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B1. Unión de un solo ligando: biología

B1. Unión de un solo ligando: biología


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Las siguientes derivaciones y gráficos se derivan de la ecuación de saturación fraccional (Y = [L] / (K_d + [L]) ). Asimismo, considere un error constante en L

Ajustes hiperbólicos

Para el equilibrio:

[M + L rightleftharpoons ML, ]

con

[[ML] = dfrac {[M_o] [L]} {K_d + [L]} ]

o expresado en términos de saturación fraccional (Y)

[Y = dfrac {[L]} {K_d + [L]}. ]

Una gráfica de (Y ) frente a (L ) da una hipérbola, como se muestra en la figura siguiente.

Figura: Hipérbola

Tenga en cuenta que las barras de error constante también se muestran en el diagrama. Recuerde, no puede determinar fácilmente el Kd a partir de un ajuste hiperbólico (Kd = L a la mitad de la saturación) a menos que realmente haya alcanzado la saturación. Una mejor manera de determinar Kd a partir de datos de enlace hiperbólico es ajustar todos los datos a una ecuación para una hipérbola utilizando un programa de regresión no lineal, como el que se encuentra en Mathcad. Sin embargo, recuerde que los datos incorrectos aún pueden ajustarse.

Mathcad 8: ajuste hiperbólico no lineal. A: Mo y Kd | B: Kd

PARCELA DOBLE RECIPROCAL: AJUSTE A LA ECUACIÓN DE REGRESIÓN LINEAL.

[ dfrac {1} {Y} = dfrac {K_d + L} {L} = dfrac {K_d} {L} + 1 ]

Esta gráfica recíproca doble tiene la forma (y = mx + b ), donde (y = 1 / Y ), m = (K_d ), x = 1 / L y (b = 1 ).

Figura: gráfico recíproco doble

Observe en esto que los errores no son constantes. Esto se muestra fácilmente en el siguiente ejemplo.

  • Si Y = 1 +/- 0.02 (como en los ejemplos anteriores), entonces Y podría variar de 0.98 - 1.02 (rango de 0.04). 1 / Y variaría de 1 / 1.02 - 1 / 0.98 o 0.98 - 1.02. (rango de 0.04)
  • Si, Y = 0.1 +/- 0.02, entonces Y podría variar de 0.08 a -0.12, un rango nuevamente de 0.04. Pero ahora, 1 / Y variaría de 1 / 0.12 - 1 / 0.08, o 8.33 - 12.5, (¡rango de 4.17! Note que a medida que Y es más pequeño, I / Y aumenta y la "envolvente" de error aumenta.

No se puede utilizar legítimamente el análisis de regresión lineal en la gráfica recíproca doble de línea recta, ya que el error en cada punto no es constante. Puede utilizar el análisis LR para determinar la pendiente si puede ponderar cada punto de manera diferente. Claramente, en este caso, los valores de Y más altos o de 1 / Y más bajos se ponderarían más. Dada la disponibilidad de programas de computadora para ajustar ecuaciones no lineales, la gráfica lineal doble recíproca no se usa con frecuencia para extraer el mejor valor de Kd. Sin embargo, es muy útil para obtener una estimación de Kd que luego puede usarse en un ajuste no lineal como se describe en A. Además, todavía tiene un uso generalizado en el análisis visual de múltiples curvas de unión en ausencia y presencia de diferentes concentraciones de un inhibidor de la unión. Veremos este uso más adelante cuando estudiemos la cinética de las enzimas.

Parcelas Scatchard

[ frac {Y} {K_d + L} = L ]

o

[ dfrac {Y} {K_d} + YL = L ]

o

[Y , K_d = L - YL = L (1 - Y) ]

lo que da

[ dfrac {Y} {L} = dfrac {1-Y} {K_d} = dfrac {-Y} {K_d} + dfrac {1} {K_d} ]

Esta ecuación, conocida como la ecuación de Scatchard, tiene la forma (y = mx + b ),

con

  • (y = dfrac {Y} {L} ),
  • (x = Y ),
  • (m = dfrac {-1} {K_d} ), y
  • (b = dfrac {1} {K_d} ).

Figura: Ecuación de Scatchard

Si asumimos que, como se indicó anteriormente, hay un error en Y (o término ligado B) y no en L, entonces ambos ejes deben tener un error atribuible al término Y. La siguiente descripción del análisis de errores en los gráficos de Scatchard y el gráfico anterior fueron amablemente aportados por George Dombi de la Universidad de Rhode Island. "La única concentración que tiene una barra de error vertical es la concentración libre cero. Las barras de error deben correr en una línea que emana del origen a través del punto trazado (puntos azules en el gráfico anterior). Esta línea se vuelve cada vez más horizontal a niveles más altos de ligando libre. Esto es lo que hace que el uso de la gráfica de Scatchard sea un problema cuando se intenta diseccionar visualmente dos o más líneas de unión individuales de los datos ". Este método de ajuste es uno de los más utilizados.

Observe que Y / L parece ir a 0/0 cuando L se acerca a 0. Este valor límite real se puede determinar a partir de la regla de l'Hopital: la razón límite está dada por el límite de la derivada del numerador (Y) dividido por el derivada del denominador (L). Este valor es 1 / Kd.

A menudo se observan parcelas curvilíneas de Scatchard. Estos pueden deberse a varias razones, que incluyen:

  • una mezcla de dos M diferentes, con diferentes Kd
  • M se une a más de 1 ligandos con diferentes Kd
  • M que se une a más de 1 ligando en el que la unión del primero disminuye la Kd del segundo (cooperatividad positiva) o viceversa (cooperatividad negativa).

PARCELA SEMI-LOG:

La mejor manera de visualizar si se alcanza la saturación es trazando Y frente a log L, ya que la trama se eleva abruptamente y se estabiliza rápidamente en comparación con la trama hiperbólica que se estabiliza lentamente.

Figura: Y vs log L

En segundo lugar, es lógico graficar Y frente a log L, ya que la extensión de la unión está determinada por el potencial químico de L y M, y el potencial químico de L es proporcional a log L.Incluso si obtiene un buen ajuste no lineal a una hipérbola (como en A anterior), debe hacer una gráfica Y vs log L para ver qué tan cerca de la saturación ha llegado.

Podemos pensar en la naturaleza de la gráfica Y vs log L comparándola con los resultados que obtuvimos usando la ecuación de Henderson-Hasselbach. A partir de esa ecuación, podríamos calcular, dado un pH, el estado de protonación de un ácido. Determinamos que si el pH estaba 2 unidades por debajo del pKa, se protonaba la relación de [HA] / [A-] = 100/1 o aproximadamente el 100% del ácido. Asimismo, si el pH estaba 2 unidades por encima del pKa, se desprotonó la relación de [HA] / [A-] = 1/100 o aproximadamente el 100% del ácido. Si el pH = pKa, se protonó el 50% del ácido. En este ejemplo, realmente observamos la saturación fraccional del ácido (es decir, cuánto estaba unido a los protones) en función del log L donde L era [H3O +].

Ahora apliquemos esto al equilibrio (M + L rightleftharpoons ML ). Deseamos saber cuánto está ligado, o la saturación fraccionaria, en función del log L. Considere tres ejemplos.

  1. L = 0.01 (K_d ) (es decir, L << KD), lo que implica que (K_d ) = 100L. Entonces Y = L / [KD+ L] = L / [100L + L] ≈1 / 100. Esto implica que, independientemente del [L] real, si L = 0.01 (K_d ), entonces Y ≈0.01.
  2. L = 100 (K_d ) (es decir, L >> KD), lo que implica que (K_d ) = L / 100. Entonces Y = L / [KD+ L] = L / [(L / 100) + L] = 100L / 101L ≈ 1. Esto implica que, independientemente del [L] real, si L = 100 (K_d ), entonces Y ≈1.
  3. L = (K_d ), luego Y = 0.5

Estos escenarios muestran que si L varía en 4 órdenes de magnitud (0.01Kd < (K_d ) <100Kd), o, en términos de registro, de -2 + log (K_d ) D), independientemente de la magnitud de (K_d ), que Y varía de aproximadamente 0 - 1. En otras palabras, Y varía de 0-1 cuando L varía de log (K_d ) en +2. Por lo tanto, las gráficas de Y frente a log L para una serie de reacciones de unión de (K_d ) (menor afinidad) cada vez más altas revelarían una serie de curvas sigmoideas idénticas desplazadas progresivamente hacia la derecha. Esto se muestra en la siguiente figura.

Figura: Y vs Log L, diferentes valores de Kd

Wolfram Mathematica CDF Player - Gráfico interactivo de Y vs log L en diferentes valores de Kd (se requiere un complemento gratuito)

NOTA: He derivado ecuaciones y gráficos anteriores usando las variables Y y L. Recuerde, Y = ML / Mo. Podría sustituir fácilmente ML / Mo con todas las ecuaciones anteriores, y obtener gráficos usando ML y L. Mo, una constante, se factorizaría en los términos de pendiente e intersección.


Disección de una sola molécula del ligando que se une a una proteína con dinámica intrínseca.

Se ha sugerido que la dinámica de las proteínas tiene un papel crucial en el reconocimiento biomolecular, pero los mecanismos moleculares precisos siguen sin estar claros. En este documento, realizamos mediciones de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de una sola molécula para la proteína de unión a maltosa (MBP) de tipo salvaje y sus variantes para demostrar la interacción de la dinámica conformacional y el reconocimiento molecular. El análisis cinético proporcionó evidencia directa de que MBP reconoce un ligando a través de un mecanismo de "ajuste inducido", no a través del mecanismo de selección generalmente propuesto para proteínas con dinámica conformacional como MBP. Nuestros resultados indicaron que la mera presencia de dinámica intrínseca es insuficiente para un mecanismo de "selección". Un análisis enérgico de la unión del ligando implicó el papel crítico de la dinámica conformacional para facilitar un cambio estructural que ocurre en la unión del ligando.


Resultados

La estabilidad mecánica de NuG2 se mejora mediante la unión de hFc.

NuG2 es un mutante GB1 diseñado computacionalmente por el grupo de David Baker (Universidad de Washington, Seattle, WA), y su estructura tridimensional es muy similar a la del tipo salvaje (wt) -GB1 (24). Aunque no se conoce la estructura tridimensional del complejo NuG2 / hFc, se prevé que la estructura de NuG2 / hFc será muy similar a la de wt-GB1 / Fc. Para caracterizar la estabilidad mecánica de NuG2, construimos una poliproteína (NuG2)8, que se compone de ocho repeticiones en tándem idénticas de dominios NuG2. Estirar la poliproteína (NuG2)8 resulta en relaciones fuerza-extensión de la apariencia característica del patrón de diente de sierra, donde el pico de diente de sierra individual corresponde al evento secuencial de despliegue mecánico de los dominios NuG2 individuales en la cadena de poliproteínas (Fig.1 A). Los picos de fuerza de despliegue están igualmente espaciados. Los ajustes del modelo de cadena en forma de gusano (WLC) de elasticidad del polímero (25) a los picos de fuerza de despliegue consecutivos (líneas rojas) miden un incremento de la longitud del contorno (ΔLC) de ≈18.0 nm para el despliegue mecánico de NuG2, en buen acuerdo con el valor esperado para el despliegue mecánico de NuG2. ΔLC es una propiedad estructural intrínseca de una proteína dada (7) y nos sirve como huella digital para identificar el despliegue mecánico de NuG2. Debido a que los dominios NuG2 en la cadena de poliproteínas son idénticos entre sí, el despliegue mecánico de los dominios NuG2 ocurre con fuerzas similares. La fuerza de despliegue promedio de los dominios NuG2 es 105 ± 20 pN (promedio ± SD, norte = 1,773) a una velocidad de tracción de 400 nm / s (Fig.2 A).

La estabilidad mecánica de NuG2 es un indicador funcional de la unión de hFc. (A) Estirar poliproteína (NuG2)8 da como resultado curvas típicas de fuerza-extensión en forma de diente de sierra que se caracterizan por fuerzas de despliegue de ≈105 pN e incrementos de longitud del contorno ΔLC de ≈18 nm. Cada pico de fuerza individual corresponde al despliegue mecánico de dominios NuG2 individuales en la poliproteína. Todos los dominios NuG2 se despliegan con una fuerza similar de ≈105 pN, como lo indica la línea discontinua. Las líneas rojas corresponden a los ajustes de WLC a la curva fuerza-extensión con ΔLC de 17,6 nm. (B) La estabilidad mecánica de NuG2 se ve reforzada por la unión de hFc. Cuando se preequilibra con hFc 33,3 μM, la mayoría de los dominios de NuG2 se despliegan a fuerzas mucho más altas de ≈210 pN, lo que indica que la fuerza de despliegue de NuG2 se puede usar como indicador para informar la unión efectiva de hFc a NuG2. Las líneas rojas corresponden a los ajustes de WLC a la curva fuerza-extensión con ΔLC de 18,2 nm. (C) Las curvas de fuerza-extensión de NuG2 a una concentración intermedia de hFc identifican directamente las formas de NuG2 unidas a hFc y libres de hFc a nivel de molécula única. Cuando se preequilibra con 17,8 μM hFc, las fuerzas de despliegue de NuG2 ocurren en dos niveles distintos (como lo indican las líneas discontinuas): los primeros cuatro eventos de despliegue ocurrieron en ≈105 pN y pueden atribuirse al despliegue de NuG2 libre de hFc el último cuatro eventos de despliegue ocurrieron a ~ 210 pN, que corresponde al despliegue de NuG2 unido a hFc. Las líneas rojas corresponden a los ajustes de WLC a los datos experimentales. (Recuadros) Ilustración esquemática del estiramiento de (NuG2)8 poliproteína entre una punta de AFM y un sustrato de vidrio en ausencia o presencia de hFc. También se indican los estados funcionales de los dominios NuG2 en la poliproteína.

Los histogramas de fuerza de despliegue de NuG2 en presencia de hFc revelan dos poblaciones distintas de NuG2 (formas libres de hFc y unidas a hFc). (A) Despliegue del histograma de fuerza de NuG2 en ausencia de hFc. La línea continua es un ajuste gaussiano a los datos experimentales. (B – G) Histogramas de fuerza de despliegue de NuG2 preequilibrados con diferentes concentraciones de hFc. Los histogramas de fuerza de despliegue de NuG2 muestran dos picos claros separados en presencia de hFc: uno está en 105 pN, que corresponde al despliegue de NuG2 libre de hFc, y el otro está en 210 pN, que corresponde al despliegue de NuG2 en la complejo con hFc. La concentración inicial de hFc para cada histograma se muestra a la derecha. Cada histograma de fuerza de despliegue se ajustó con dos funciones gaussianas (líneas continuas), y las áreas relativas por debajo de los ajustes gaussianos miden directamente la fracción de hFc libre y unido a hFc de NuG2.

Aunque la unión de hFc a NuG2 no introduce cambios estructurales importantes en NuG2, mejora significativamente la estabilidad mecánica de NuG2. Estiramiento (NuG2)8 que está preequilibrado con 33 µM de hFc da como resultado curvas de fuerza-extensión en forma de diente de sierra. WLC se ajusta a la medida de picos de fuerza consecutivos ΔLC de ≈18 nm, lo que indica que los picos de fuerza de despliegue resultan del despliegue mecánico de los dominios NuG2. Sin embargo, la mayoría de los dominios NuG2 se despliegan a una fuerza promedio mucho mayor de 210 ± 20 pN (norte = 223) que el de NuG2 en ausencia de hFc (Fig.1 B). Debido a que la gran mayoría de los dominios NuG2 están unidos a Fc a esta concentración de hFc, atribuimos la mayor fuerza de despliegue de 210 pN al despliegue mecánico de la forma unida a hFc de NuG2. Los experimentos de control descartaron la posibilidad de que los picos de fuerza más altos fueran causados ​​por el despliegue mecánico de los dominios Ig de hFc (SI Fig. 5) o el tampón Tris / azida usado para hFc (SI Fig. 6). Estos resultados indican claramente que la unión de hFc a NuG2 reforzó significativamente la resistencia mecánica de NuG2 al despliegue inducido por la fuerza, a pesar de los pequeños cambios estructurales aparentes provocados por la unión de hFc.

La estabilidad mecánica de NuG2 sirve como informador funcional para la unión de hFc a NuG2.

Debido a que la forma unida a hFc de NuG2 es mecánicamente distinta de la forma libre de hFc de NuG2, es posible utilizar la estabilidad mecánica de NuG2 como un indicador funcional para informar directamente el estado de unión de los dominios de NuG2 una molécula a la vez y determinar la población relativa de las dos formas de NuG2 en presencia de hFc. De hecho, al realizar experimentos AFM de molécula única de NuG2 a diversas concentraciones de hFc, observamos dos poblaciones distintas de NuG2. Por ejemplo, estiramiento (NuG2)8 preequilibrado con 17,8 μM hFc dio como resultado curvas de fuerza-extensión con picos de fuerza de despliegue igualmente espaciados pero con dos niveles distintos de fuerzas de despliegue, uno ubicado en ≈105 pN y un segundo nivel en ≈210 pN. En la figura 1 se muestra una curva típica de fuerza-extensión. C, donde cuatro eventos de despliegue ocurrieron a ≈105 pN y los otros cuatro ocurrieron a ≈210 pN. El histograma de fuerza de despliegue (Fig.2 mi) muestra dos picos de fuerza de despliegue claramente separados centrados en 105 pN y 210 pN, respectivamente. Podemos identificar fácilmente los dominios NuG2 que se despliegan a ≈105 pN como la forma libre de hFc de NuG2, mientras que los dominios NuG2 se despliegan a ≈210 pN como las formas unidas a hFc de NuG2. Contando el número de eventos de despliegue de NuG2 que ocurren a fuerzas bajas y altas, podemos determinar fácilmente la distribución de NuG2 entre las dos poblaciones distintas: formas de NuG2 unidas a hFc y libres de hFc.

Variando la concentración de hFc, investigamos el cambio de la distribución de las dos formas de NuG2. Los histogramas de fuerza de despliegue de NuG2 bajo diferentes concentraciones de hFc se muestran en la Fig. 2. Es evidente que, en presencia de hFc, los histogramas de fuerza de despliegue de NuG2 muestran una distribución bimodal, con un pico a ≈105 pN y un segundo a ≈210 pN. Como era de esperar, al aumentar la concentración de hFc, ocurren más eventos de despliegue a ~ 210 pN y menos eventos de despliegue a ~ 105 pN. Y eventualmente, los eventos que se desarrollan en ≈210 pN se vuelven dominantes. Este resultado demuestra claramente que las NuG2 sin hFc se convierten en la forma de NuG2 unida a hFc al aumentar la concentración de hFc. Las posiciones de los dos picos de fuerza de despliegue en los histogramas permanecen sin cambios a diferentes concentraciones de hFc, lo que indica que la estabilidad mecánica de las formas unidas y libres de hFc de NuG2 no depende de la concentración de hFc y, por lo tanto, las dos poblaciones observadas de NuG2 reflejan los dos estados funcionales intrínsecos de NuG2 causados ​​por la unión específica de hFc a NuG2.

Medición de la constante de disociación de hFc a NuG2 a nivel de una sola molécula.

Las fracciones de NuG2 unido a hFc y libre de hFc se determinaron directamente a partir de las áreas relativas bajo los picos a 105 pN y 210 pN, respectivamente (Fig. 2). Las fracciones de NuG2 unido a hFc se representan frente a la concentración de hFc (Fig. 3, cuadrados). Debido a que los dominios NuG2 en la poliproteína se unen a hFc de manera independiente, según lo determinado por la técnica de resonancia de plasmón de superficie (datos no mostrados), ajustamos la isoterma de unión a un modelo de unión de un solo sitio, que tiene en cuenta todas las especies presentes, y midió una constante de disociación K D de 12,6 ± 0,9 µM para la unión de hFc a NuG2.

Determinación precisa de la constante de disociación. K D utilizando un ensayo de unión de una sola molécula basado en espectroscopia de fuerza. Las fracciones de NuG2 y wt-GB1 unidos a hFc se representan frente a la concentración inicial de ligando hFc en la isoterma de unión (cuadrados, triángulos NuG2 / hFc, wt-GB1 / hFc). Las líneas continuas se ajustan a las isotermas de unión utilizando un modelo de sitio de unión único que tiene en cuenta todas las especies presentes en la solución (línea negra, línea gris de NuG2 / hFc, wt-GB1 / hFc). El medido K D es 12,6 ± 0,9 µM para la unión de hFc a NuG2 y 2,2 ± 0,4 µM para la unión de hFc a wt-GB1.

Para probar la sensibilidad de este método, también estudiamos la unión de hFc a wt-GB1. De manera similar a NuG2, la estabilidad mecánica de GB1 aumentó significativamente tras la unión de hFc. La fuerza de despliegue de GB1 aumentó de 180 pN a 265 pN (datos no mostrados). Siguiendo procedimientos similares, medimos la fracción unida a hFc de GB1 en función de la concentración de hFc (Fig.3, triángulos) y determinamos K D de 2,2 ± 0,4 µM para la unión de GB1 a hFc. A pesar de que K D para NuG2 y GB1 solo difieren seis veces, el ensayo de unión de una sola molécula basado en espectroscopía de fuerza detecta fácilmente esta diferencia, lo que demuestra la alta sensibilidad del ensayo de unión basado en espectroscopía de fuerza de una sola molécula. Es de notar que, aunque K D de NuG2 a hFc es aproximadamente seis veces mayor que el de GB1 a hFc, el efecto de estabilización sobre la estabilidad mecánica tras la unión de un ligando es similar en ambos casos. Por tanto, la sensibilidad de la espectroscopia de fuerza no depende de la fuerza de unión entre la proteína y su ligando.

Sin embargo, vale la pena señalar que la sensibilidad y precisión de esta metodología depende de la diferencia de estabilidad mecánica entre las formas de proteínas unidas y libres de ligando. Si la unión del ligando no da como resultado una diferencia medible en la estabilidad mecánica (26, 27), como la unión del ligando E9 a la proteína Im9 (26), la aplicación de la metodología actual puede volverse limitada.


Se observa unión de una segunda molécula de CO

IMAGEN: El cofactor de hierro-vanadio (FeV) en la nitrogenasa dependiente de vanadio se hizo reaccionar con monóxido de carbono (CO) y luego se gaseó bajo presión, permitiendo visualizar dos moléculas del sustrato. Ver más

Crédito: Gráfico: Oliver Einsle

A través de la fijación biológica del elemento nitrógeno por la enzima nitrogenasa, los organismos obtienen acceso al nitrógeno molecular (N2) en la atmósfera de la Tierra, que es esencial para la construcción de estructuras celulares. Además, una variante de nitrogenasa dependiente del vanadio puede reducir el gas tóxico monóxido de carbono (CO) a hidrocarburos. Estas reducciones de N2 y CO se encuentran entre los procesos más importantes de la química industrial, ya que se utilizan para producir tanto fertilizantes como combustibles sintéticos. Sin embargo, los investigadores aún no han podido descifrar las diferentes vías de las dos reacciones. El Dr. Michael Rohde del equipo del Prof.Dr. Oliver Einsle en el Instituto de Bioquímica de la Universidad de Friburgo, en colaboración con dos grupos de investigación en Freie Universit & # 228t Berlin, ahora ha podido mostrar cómo el sitio activo del vanadio- la nitrogenasa dependiente es capaz de unir dos moléculas de CO simultáneamente, creando así la base para combinar los átomos de carbono espacialmente adyacentes de ambas moléculas en un proceso reductivo. Los investigadores presentaron recientemente sus resultados en la revista Avances de la ciencia.

Las reducciones industriales de N2 y CO, conocidas como procesos de Haber-Bosch y Fischer-Tropsch, respectivamente, requieren altas temperaturas y presión. Mientras que la reducción de N2 conduce al producto biodisponible amonio (NH4 +), al menos dos átomos de carbono se combinan durante la conversión de CO. El producto de reacción predominante es el etileno (eteno, C2H4), un gas incoloro que juega un papel importante no solo en los combustibles, sino también en también en la producción de plásticos. Aunque la escisión de un enlace N-N en la fijación de nitrógeno es químicamente bastante diferente de la formación de un enlace C-C en la reducción de CO, los científicos sospechaban previamente que la nitrogenasa utiliza los mismos principios mecánicos básicos para ambas reacciones.

En un trabajo anterior, el equipo dirigido por Rohde y Einsle utilizó nitrogenasa para reaccionar con el gas CO, lo que resultó en la unión específica de una sola molécula. En su estudio actual, que se basa en este trabajo, los investigadores muestran que gasearon cristales de este primer estado con CO a presión y luego los sometieron a análisis cristalográfico de rayos X. Esto les permitió observar directamente cómo se une una segunda molécula de CO. "La forma de nitrogenasa obtenida de esta manera, con dos moléculas de CO en el sitio activo, probablemente representa un estado bloqueado", explica Rohde, "pero proporciona pistas directas sobre el mecanismo de la enzima". Como resultado, el equipo de Einsle ahora puede esbozar un mecanismo detallado de reducción de CO a través de la nitrogenasa.

Oliver Einsle se desempeña como profesor en el Instituto de Bioquímica de la Universidad de Friburgo y es miembro del Centro BIOSS para Estudios de Señalización Biológica de la Universidad de Friburgo.

Publicación original:
Rohde, M., Laun, K., Zebger, I., Stripp, S. T., Einsle, O. (2021): Dos sitios de unión de ligandos en la nitrogenasa de vanadio reductora de CO revelan un principio mecanicista general. En: Avances de la ciencia, Vol. 7, No. 22. DOI: 10.1126 / sciadv.abg4474

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Puntos cuánticos compactos conjugados con halo-ligando para la obtención de imágenes multicolores de una sola molécula de proteínas GPCR superpobladas en las membranas celulares

Para detectar moléculas individuales dentro del límite de difracción óptica. (& lt aprox. 200 nm), se desarrolla una técnica de formación de imágenes multicolor utilizando puntos cuánticos conjugados Halo-ligando (Halo-QDs & lt6 nm de diámetro). Usando tres tipos de Halo-QD, imágenes de fluorescencia multicolores de una sola molécula de proteínas GPCR en Dictyostelium se logran las células.

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Robert Batey

Los ribosconmutadores son una clase de elementos de ARN no codificantes que se encuentran comúnmente en las 5'-UTR de los ARNm bacterianos que regulan la expresión en forma cis en virtud de su capacidad para interactuar directamente con un metabolito celular específico. El reconocimiento del ligando efector por parte del ARNm se logra mediante un receptor, conocido como dominio aptámero, cuya compleja arquitectura terciaria andamia un bolsillo de unión que forma complejos de alta afinidad notablemente específicos con el metabolito. La unión del efector se comunica a un dominio regulador descendente, comúnmente llamado plataforma de expresión, que forma una de dos estructuras secundarias mutuamente excluyentes que sirven como señales para activar o desactivar la expresión. La amplia distribución de los riboconmutadores en el reino bacteriano, incluidos muchos patógenos de importancia médica como las especies de Staphylococcus aureus y Streptococcus, destaca la importancia biológica de este mecanismo regulador. Debido a que los riboconmutadores a menudo regulan genes metabólicos esenciales, se han convertido en objetivos de interés en la búsqueda de nuevos compuestos antimicrobianos. En los últimos años, se han logrado avances hacia la identificación y validación de nuevas clases de riboswitches y la determinación de cómo sus dominios aptámeros reconocen ligandos estructuralmente diversos.

Comprender el reconocimiento de moléculas pequeñas mediante ARN biológicos

La cristalografía de rayos X es la herramienta más poderosa que tenemos a nuestra disposición para generar hipótesis sobre la estructura y función de los riboswitches. Centrándonos en el dominio aptámero, el receptor del efector de molécula pequeña del riboswitch, hemos determinado las estructuras de varios aptámeros diferentes, incluidos purina, SAM-I, SAM-II, lisina y SAH (consulte la pestaña "Estructuras" para obtener más información). información). Además de estos complejos de ARN-ligando, hemos podido determinar las estructuras libres de varios de estos riboswitches para comenzar a comprender la naturaleza de los cambios conformacionales inducidos por ligando en el aptámero. Finalmente, continuamos trabajando en cada uno de estos ARN a través de investigaciones en curso de sus complejos con otras moléculas pequeñas. Estas estructuras revelan aspectos de la especificidad del ARN por su efector afín y la plasticidad del bolsillo de unión.

Esto nos permite obtener imágenes a nivel atómico de riboswitches unidos a su efector que arrojan nuevos conocimientos sobre el reconocimiento de moléculas pequeñas por el ARN y los mecanismos de riborregulación. Un ejemplo reciente es una estructura de un riboswitch sensor de cobalamina que incluye tanto el dominio aptámero como la plataforma de expresión (Nature 2012):

Además de nuestro trabajo sobre riboswitches, también continuamos desarrollando herramientas que facilitan la determinación de la estructura del ARN en colaboración con el Prof. Jeff Kieft del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Colorado en Denver. Una herramienta que hemos desarrollado es un sistema de purificación de ARN nativo que utiliza una etiqueta de captura por afinidad (ver más abajo, a la izquierda). Después de la transcripción estándar in vitro de T7 RNAP, se une una proteína de captura (fusión de recubrimiento His6-MBP-MS2) a la etiqueta de afinidad 3 'y se pasa por una columna de níquel. El ARN de interés se eluye añadiendo glucosamina-6-fosfato, que activa la ribozima GlmS. Una segunda herramienta que hemos desarrollado es el módulo de fase "G-U", un pequeño motivo que se puede agregar dentro de una hélice en forma de A que recluta hexamina de iridio en el sitio. Este módulo (derecha) ha sido fundamental para resolver varios ARN de nuestro grupo y otros.

Comprensión de los mecanismos regulatorios

Si bien la cristalografía de rayos X es capaz de generar modelos útiles de ARN y sus complejos con proteínas y moléculas pequeñas, solo representa una instantánea de la vida del ARNm. Utilizamos una variedad de enfoques biofísicos y bioquímicos para descubrir la naturaleza de los cambios conformacionales inducidos por ligandos en el ARN y cómo esto afecta la estructura del interruptor estructural secundario aguas abajo en la plataforma de expresión.
Un ejemplo de un enfoque es una técnica de sondeo químico llamada "FORMA". Esta técnica utiliza un reactivo que reacciona con grupos 2'-hidroxilo conformacionalmente dinámicos en la estructura del ARN. La reacción del reactivo con un azúcar conduce a una modificación que puede revelarse como una parada de la transcriptasa inversa en un gel de secuenciación. De particular importancia, podemos sondear el complejo ARN o ARN-ligando en un amplio rango de temperatura para monitorear su despliegue con resolución de nucleótidos. Este enfoque, aplicado al riboswitch de purina, reveló que el ligando estabilizó la estructura principalmente dentro de una región de unión que actúa como una "tapa" flexible que encapsula la nucleobase dentro del ARN.
Es importante destacar que este estudio mostró que la formación de la estructura terciaria que implica la secuencia de cambio estaba estrechamente acoplada a la unión del ligando. Esto proporciona el vínculo físico entre el efector bindng y el conmutador regulador aguas abajo.

Aplicaciones de los riboswitches en biología sintética

Los dispositivos compuestos de ARN están emergiendo como herramientas importantes en biología sintética para aplicaciones que incluyen la detección in vivo de moléculas pequeñas con biosensores codificables genéticamente y elementos reguladores diseñados para controlar la expresión génica. En parte, esto se debe a la capacidad de seleccionar ácidos nucleicos con una actividad deseada utilizando métodos de evolución in vitro bien establecidos (SELEX). Este método somete un grupo inicial de secuencias aleatorias a múltiples rondas de presión de selección y replicación de los supervivientes. El resultado, cuando la presión de selección es para la unión, es un aptámero capaz de unirse a la molécula diana con alta afinidad y especificidad. En los 20 años transcurridos desde su desarrollo, SELEX ha producido ARN capaces de unirse a una variedad de compuestos químicamente diversos, lo que revela que se pueden obtener aptámeros para casi cualquier molécula deseada. Para muchas aplicaciones, el aptámero debe estar acoplado a un módulo de lectura que transduzca el evento vinculante en una señal detectable, un obstáculo importante en la ingeniería de dispositivos prácticos.

Una fuente potencial de dominios de lectura modular se encuentra en los dispositivos de control genético naturales llamados riboswitches. Hemos demostrado la modularidad de las plataformas de expresión de selectos riboswitches que controlan la expresión génica a nivel transcripcional. Estos ribosconmutadores quiméricos que comprenden nuevas combinaciones de dominios de aptámeros de riboswitch y plataformas de expresión conservan las propiedades reguladoras de las secuencias biológicas. Es importante destacar que para la biología sintética, encontramos que el cambio estructural secundario de estas plataformas de expresión puede ser dirigido por aptámeros sintéticos. La estrategia de ingeniería que empleamos para acoplar aptámeros con estas plataformas de expresión modular es conceptualmente simple y requiere una selección mínima de variantes para encontrar un riboswitch eficaz. Estos conmutadores son funcionales tanto en un ensayo de transcripción in vitro básico como como un elemento regulador que controla la expresión de un gen indicador en E. coli.

Un ejemplo de una "combinación y combinación" tan simple es la creación de una quimera entre un dominio aptámero de unión a guanina (xpt de B. subtilis) y una plataforma de expresión de un riboswitch sensor SAM (metE de B. subtilis) . Los geles representan un ensayo de transcripción de lectura completa de recambio único en función de la concentración del efector (SAM o guanina). Estos son interruptores "OFF" en los que el efector promueve la formación del producto terminado (T). Los datos se pueden cuantificar para producir la concentración de efector necesaria para provocar una respuesta reguladora media máxima.

Más importante aún, podemos unir aptámeros sintéticos a la plataforma de expresión modular metE para producir riboswitches quiméricos que funcionan tanto in vitro como in vivo. A continuación, se muestran los datos de una quimera entre el aptámero de teofilina derivado de SELEX y varios interruptores de ARN biológicos diferentes.

Continuamos desarrollando estas y otras herramientas para la fácil creación de sensores de ARN para aplicaciones basadas en células, así como colaborando con otros grupos para aplicar estos nuevos biosensores a aplicaciones biológicas sintéticas del mundo real.


Abstracto

Fondo- Aunque los sistemas renina-angiotensina y β-adrenérgicos están interrelacionados, existe una interacción directa entre los receptores β-adrenérgicos (βAR) y los receptores de angiotensina II tipo 1 (AT1Rs) no se ha identificado.

Métodos y resultados Aquí, proporcionamos evidencia de una interacción funcional y fisiológica entre 2 receptores acoplados a proteína G: el βAR y el AT1R. El bloqueo selectivo de βAR en cardiomiocitos de ratón inhibe la contractilidad inducida por angiotensina con un CI50 que es similar a su inhibición de la contractilidad mediada por isoproterenol. Además, la administración del bloqueador del receptor de angiotensina valsartán a ratones intactos da como resultado una reducción significativa en la respuesta máxima a la elevación de la frecuencia cardíaca inducida por catecolaminas. El mecanismo de este efecto transinhibidor de los bloqueadores β y los bloqueadores de los receptores de angiotensina es a través del desacoplamiento de la proteína G del receptor, es decir, los bloqueadores β interfieren con la AT1R-Gq acoplamiento, y valsartán interfiere con βAR-Gs acoplamiento. Finalmente, demostramos que AT1Rs y βARs forman complejos constitutivos que no se ven afectados por la estimulación del ligando. Como resultado de estas interacciones, un único antagonista del receptor bloquea de forma eficaz la señalización y el tráfico de ambos receptores simultáneamente.

Conclusiones Mostramos que las interacciones directas entre βAR y AT1Los R pueden tener profundas consecuencias en la respuesta general a los fármacos que antagonizan estos receptores.

La insuficiencia cardíaca es un trastorno progresivo que involucra disfunción del sistema renina-angiotensina y del sistema nervioso adrenérgico. 1,2 El impulso adrenérgico sostenido después de una lesión en el corazón da como resultado anomalías en la señalización del receptor adrenérgico β (AR) (regulación a la baja de β1AR y desacoplamiento de ambos β1 y β2AR de las proteínas G 3,4), así como una disminución del número de receptores de angiotensina II (Ang II) tipo 1 (AT1Rs). 1 A pesar de la evidencia de una regulación por retroalimentación positiva entre el sistema renina-angiotensina y los sistemas βAR, 5 hasta la fecha no hay pruebas de diafonía directa a nivel del receptor entre los receptores β-adrenérgicos y angiotensina.

Ambos βAR y AT1Los R pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR), que, una vez activados, interactúan con las moléculas efectoras mediante el acoplamiento a las proteínas G. A1Rs traducen las acciones del agonista Ang II acoplando al heterotrimérico Gq/ 11 familia de proteínas G y activación de la fosfolipasa Cβ (PLCβ), mientras que los βAR median las acciones de la noradrenalina a través de Gs-activación dependiente de la adenilil ciclasa. Aunque inicialmente se creyó que los receptores de la superfamilia GPCR funcionaban como entidades monoméricas, un creciente cuerpo de evidencia sugiere que existen como homodímeros o heterodímeros. 6

En el presente estudio, demostramos la existencia de una interacción directa entre AT1Rs y βARs y muestran que al interferir específicamente con la señalización de un receptor (es decir, el βAR o el AT1R) da como resultado el desacoplamiento y la inhibición de la señalización por parte del receptor recíproco que interactúa.

Métodos

Preparación de miocitos cardíacos adultos y estudios de contractilidad

Los ratones utilizados en estos estudios fueron ratones C57BL / 6 de tipo salvaje hembras adultas, de 3 a 6 meses de edad y con un peso de 30 a 40 g (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Los animales se manipularon de acuerdo con los protocolos aprobados y las regulaciones de bienestar animal de la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico de la Universidad de Duke. Los miocitos se aislaron como se describió anteriormente 7 y se visualizaron con un microscopio invertido (Nikon Eclipse TE 300). La contracción unicelular se midió mediante detección de bordes por video y las grabaciones se realizaron en condiciones basales y después de la administración de los diferentes agentes, como se describe en las leyendas de las figuras.

Cultivo y transfección celular

COS-7 y células 293 de riñón embrionario humano (HEK) se cultivaron en DMEM o medio de Eagle modificado, respectivamente. Se cultivaron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en medio completo EGM-2. La proteína fluorescente verde de rata Ang II tipo 1A (AT1R-GFP) y AT con etiqueta HA1Los ADNc de R fueron un generoso obsequio del Dr. Larry Barak (Universidad de Duke, Durham, NC) y el FLAG-β humano2AR fue un generoso regalo del Dr. Robert Lefkowitz (Universidad de Duke, Durham, NC). Se realizaron transfecciones transitorias en monocapas confluentes del 60% al 80% en placas de 100 mm mediante el uso de FUGENE6 (Roche Molecular Biochemicals). Las estimulaciones con agonistas se realizaron a 37 ° C en medio sin suero después de la preincubación con los inhibidores indicados.

Inmunotransferencia

Las células HUVEC o COS-7 se privaron de suero durante 2 horas antes de la estimulación.Las reacciones terminaron rápidamente y las muestras se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondaron para detectar quinasa regulada por señal extracelular fosforilada (ERK) utilizando un anticuerpo específico de fosfo-ERK1 / 2 de conejo policlonal (tecnología de señalización celular). Las transferencias se visualizaron con electroquimioluminiscencia (Amersham Pharmacia) y las autorradiografías se cuantificaron mediante el uso de un Fluor-S MultiImager (Bio-Rad). A continuación, las transferencias se separaron y se volvieron a analizar con un anticuerpo anti-ERK1 / 2 (Upstate Biotechnology, Inc) para normalizar el nivel de ERK fosforilada a ERK total.

Estudios de unión de ligandos

Las células COS-7 se sembraron en placas de 24 pocillos y se dejaron alcanzar la confluencia. Las reacciones de unión se realizaron en 0,25 ml de tampón de unión como se describió anteriormente. 8 Se añadieron 0,5 nmol / L de angiotensina marcada con 125 I o cianopindolol (CYP) marcado con 125 I 125 pmol / L y varias concentraciones de ligandos competidores no marcados, luego las placas se incubaron en hielo durante 4 horas. La unión inespecífica se determinó mediante la adición de 100 µmol / L de Ang II o propranolol sin marcar, respectivamente. Para los estudios de internalización, las células COS-7 se privaron de suero durante 2 horas y se estimularon con los diferentes agentes, como se indica en la leyenda de la figura. Las concentraciones de proteínas se determinaron con el ensayo de Bradford (Bio-Rad). Los datos se analizaron mediante el uso de Prism 3.0 (GraphPad).

Mediciones de fosfato de inositol

Las células COS-7 se cultivaron en placas de 12 pocillos y se incubaron con 2 µCi / pocillo de mio- [3 H] -inositol (76 Ci / mmol, Amersham) en medio sin suero durante 24 horas. Las muestras se preincubaron con propranolol durante 30 minutos antes de la estimulación con Ang II durante 60 minutos más. Los niveles de fosfato de inositol se midieron exactamente como se describió anteriormente. 8

Preparación de membranas cardíacas

Se prepararon membranas cardíacas crudas a partir de corazones extirpados como se describió anteriormente. 9

Estudios de unión a GTPγS

Se ensayó la unión de GTPγS marcado con [35S] a membranas cardíacas aisladas en un volumen de reacción total de 50 µl como se describió anteriormente. 10

Microscopia confocal

Células HEK 293 que expresan AT1R-GFP o HA-AT1R se sembraron en placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm y se privaron de suero durante 3 horas antes de la estimulación. Las células vivas se trataron con los diferentes agentes como se describe en las leyendas de las figuras. La fijación y la tinción dual de las células se realizaron como se describió anteriormente. 11 Las imágenes se recogieron mediante el uso de un microscopio confocal de barrido láser Olympus 1 × 70.

Mediciones de frecuencia cardíaca y presión arterial en ratones intactos

Los ratones se anestesiaron con ketamina (100 mg / kg) y xilazina (2,5 mg / kg) y se sometieron a una vagotomía bilateral antes del cateterismo para prevenir la inhibición del reflejo en la frecuencia cardíaca como se describió anteriormente. 9 Se canuló la arteria axilar izquierda para el registro continuo de la presión arterial y la frecuencia cardíaca. Los fármacos se administraron a través de la vena yugular externa derecha. A los animales de control se les inyectó vehículo, seguido de una dosis escalonada de isoproterenol (ISO 50 a 10000 pg). A otros dos grupos de animales se les inyectó una dosis única de valsartán (250 μg) o propranolol (1 μg) antes de la administración de ISO.

Análisis estadístico

Los datos se expresan como media ± SEM. La significación estadística se determinó mediante un ANOVA de una vía o un ANOVA de dos vías de medidas repetidas cuando fuera apropiado. El análisis post hoc se realizó con una prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer o una prueba de Newman-Keuls cuando fue apropiado. Un valor de PAG& lt0.05 se consideró significativo.

Resultados

Para probar la existencia de una posible regulación cruzada entre AT1Rs y βARs en el corazón, medimos el efecto de los β-bloqueadores sobre la contractilidad mediada por Ang II de cardiomiocitos de ratón recién aislados. En condiciones basales, la estimulación de las células con Ang II resultó en un aumento significativo en el acortamiento celular y la tasa de acortamiento celular (−dL / dt) (Figura 1, A y B), similar a la respuesta observada por la estimulación con el agonista βAR. YO ASI. 7 Sorprendentemente, la coadministración del propranolol β-bloqueador no selectivo junto con Ang II abolió el efecto de Ang II, demostrando una acción directa de los β-bloqueadores sobre la respuesta contráctil mediada por Ang II (Figura 1, A y B). Porque β1Los RA son el subtipo predominante de βAR en el corazón, probamos el efecto de los βAR selectivos1Metoprolol inhibidor de AR sobre el aumento de contractilidad mediado por Ang II. Como se muestra en la Figura 1B, el metoprolol también abolió la respuesta mediada por Ang II. Ninguno de los betabloqueantes tuvo ningún efecto sobre los niveles basales de contractilidad. Confirmar que las acciones de los betabloqueantes sobre el AT1R estaban mediados por receptores, probamos el efecto del propranolol en un aumento no mediado por receptores en la contractilidad de los miocitos inducida por el inhibidor de Na + / K + -ATPasa ouabaína. Como se muestra en la Figura 1B, la ouabaína indujo un aumento sustancial de la contractilidad que no se vio afectada significativamente por la presencia del bloqueador β.

Figura 1. Los betabloqueantes inhiben la contractilidad de los miocitos mediada por Ang II. A, trazados representativos de células individuales que muestran cambios en la longitud celular (arriba) y su primera derivada (−dL / dt) (abajo) en condiciones basales en las que las células se estimularon en el campo a 0,5 Hz y después de la administración de 1 μmol / L de propranolol (Prop), 10 μmol / L Ang II (AngII) o ambos. B, Resumen del porcentaje de acortamiento celular y tasa de acortamiento celular (−dL / dt) de 5 corazones individuales (10 a 15 miocitos de cada corazón) al inicio del estudio y después de la estimulación con diferentes agentes: 1 μmol / L Prop, 1 μmol / L metoprolol (Met) y 100 μmol / L ouabaína (Ouab). *PAG& lt0.05 vs basal. C, Resumen del efecto dosis-respuesta del propranolol sobre el acortamiento celular mediado por ISO- (○) y Ang II– (•) de 5 corazones individuales. IC50 ISO = 3,0 × 10 −7 mol / L, IC50 Ang II = 5.3 × 10 −7 mol / L. D, Efecto dosis-respuesta del propranolol sobre ISO- (○) y Ang II– (•) mediado por −dL / dt de 5 corazones individuales. IC50 ISO = 2,41 × 10 −7 mol / L, IC50 Ang II = 4,45 × 10 −7 mol / L.

Para discriminar entre los efectos del propranolol mediados por βAR frente a las acciones independientes de βAR (p. Ej., Antagonismo directo de los receptores de angiotensina o efectos inespecíficos sobre la fluidez de la membrana), medimos la IC50 para la inhibición de la contractilidad mejorada por ISO y Ang II por el propranolol. Como se muestra en la Figura 1C, el aumento de las concentraciones de propranolol dio como resultado una inhibición comparable de la contractilidad mediada por ISO y Ang II. Además, el IC50 Los valores para la inhibición de propranolol de los efectos de ISO y Ang II no fueron significativamente diferentes (3.0 × 10 −7 y 5.3 × 10 −7 mol / L, respectivamente, PAG= NS). Se obtuvo el mismo resultado para la inhibición en la tasa de contractilidad en presencia del bloqueador β (Figura 1D). La capacidad de los β-bloqueadores para inhibir la contractilidad de los miocitos estimulados por Ang II e ISO dentro del mismo rango de concentraciones apoya nuestra hipótesis de que el propranolol ejerce su efecto sobre la señalización de la angiotensina a través del βAR y no a través de la unión al receptor de angiotensina.

Para excluir directamente la posibilidad de que los β-bloqueadores inhiban la señalización mediada por Ang al interferir con la unión de Ang II a su receptor, realizamos análisis de unión de radioligando competitivo en células COS-7 intactas. Las células COS expresan β2AR y AT1Rs a niveles comparables, con poca expresión de β1AR. Como se muestra en la Figura 2A, concentraciones crecientes de Ang II sin marcar desplazaron eficazmente la unión de 125 I-Ang II. Por el contrario, tanto el propranolol como el β2El antagonista de AR ICI-118,551 (ICI) no pudo competir con el ligando marcado, lo que sugiere que los bloqueadores β no interfieren con la unión de Ang II al AT1R. De manera similar, encontramos que el bloqueador del receptor de Ang II valsartán, que se une específicamente al AT1R, 12 no desplazó la β2Antagonista de AR 125 I-cianopindolol de la β expresada endógenamente2AR (Figura 2B). Juntos, estos datos demuestran que el propranolol y el valsartán se unen específicamente a βAR y AT1R, respectivamente, y que el efecto transinhibidor sobre sus vías recíprocas se ejerce a través de un bloqueo específico en un punto distal a la unión del ligando.

Figura 2. trans-La inhibición de la actividad del receptor no está mediada por la unión competitiva del ligando (A). Unión competitiva de 125 I-Ang II con Ang II (○), Prop (•) e ICI 118,551 (▴). Los valores representan medias de 5 experimentos individuales para cada ligando. B, Unión competitiva de 125 I-CYP a células COS-7. (○) ICI y (•) valsartán. Los valores representan datos promedio de 5 experimentos individuales para cada ligando.

Para probar si los antagonistas selectivos de un receptor pueden desacoplar el receptor recíproco de la unión a su proteína G análoga, evaluamos el acoplamiento de la proteína G del receptor en las membranas cardíacas de ratón. Como se muestra en la Figura 3A, la estimulación con AT mejorada con Ang II1R – Gq acoplamiento, determinado por [35 S] GTPγS carga de Gq. Sin embargo, la preincubación de las membranas con propranolol evitó por completo la AT1R – Gq acoplamiento. De acuerdo con el desacoplamiento del receptor, la formación de fosfato de inositol después de la estimulación con Ang II en las células COS-7 se anuló en presencia de propranolol (Figura 3B) o ICI (no mostrado). Para probar si el bloqueo del AT1R indujo un efecto similar sobre el acoplamiento de βAR a Gs, las membranas cardíacas se estimularon con ISO en ausencia o presencia de valsartán. Acoplamiento inducido por ISO de βAR a Gs, que resultó en un aumento significativo en la carga de [35 S] GTPγS, se bloqueó completamente en presencia de valsartán (Figura 3C). De acuerdo con βAR – Gs desacoplamiento, la generación mediada por ISO del segundo mensajero cAMP se vio afectada en presencia de valsartán en células COS-7 que expresan endógenamente ambos receptores (Figura 3D).

Figura 3. El bloqueo de un receptor provoca el desacoplamiento funcional de trans-receptor de su proteína G análoga. A, el propranolol interfiere con la AT1R – Gq acoplamiento. Unión de [35 S] GTPγS estimulada por Ang II a Gαq en membranas de cardiomiocitos en ausencia o presencia de 10 μmol / L de propranolol. Se muestran los datos de 6 experimentos separados realizados por triplicado. *PAG& lt0.01 frente a basal. B, Aumento estimulado por Ang II en la formación de fosfato de inositol (IP) en células COS-7 en ausencia o presencia de 10 μmol / L Prop. Se muestran la media ± SEM de 6 experimentos separados realizados por triplicado. *PAG& lt0.05 vs basal. C, valsartán interfiere con βAR – Gs acoplamiento. La unión de [35 S] GTPγS estimulada por Ang II a Gαs en las membranas de los cardiomiocitos en ausencia o presencia de 10 μmol / L de valsartán (Val). Se muestran las medias de 5 experimentos separados realizados por triplicado. *PAG& lt0.05 vs basal. D, Valsartan inhibe la producción de AMPc después de la estimulación ISO. Aumento estimulado por ISO en la producción de AMPc en presencia o ausencia de 10 μmol / L de valsartán. Se muestran la media ± SEM de 5 experimentos separados realizados por triplicado. *PAG& lt0.01 frente a basal.

Para probar si la transinhibición del receptor, ya sea por los bloqueadores del receptor de Ang II o por los bloqueadores beta, afecta la señalización aguas abajo por los bloqueadores beta2AR y AT1Rs, medimos la activación de la proteína quinasa activada por mitógenos ERK en células COS-7 intactas que expresan endógenamente ambos receptores. La estimulación de las células con ISO o Ang II indujo un aumento significativo en la fosforilación de ERK (Figura 4, A y B) de una manera dependiente de la dosis y el tiempo (no mostrado), lo que confirma la existencia de ambos receptores en estas células. De manera similar a las observaciones realizadas en los estudios de contractilidad, el pretratamiento de las células con propranolol abolió la activación de ERK mediada por Ang II (Figura 4B, izquierda). De manera recíproca, la estimulación de las células con ISO en presencia de valsartán anuló la activación de la vía ERK mediada por ISO (Figura 4A). Como era de esperar, la β1El metoprolol, antagonista selectivo de AR, no tuvo ningún efecto sobre la activación de ERK por ISO o Ang II (Figura 4A, derecha), de acuerdo con el hecho de que las células COS-7 no expresan endógenamente niveles detectables de β1AR. La presencia de principalmente β2Los AR en las células COS-7 se confirmaron aún más por la observación de que el β2El agonista inverso ICI selectivo de AR bloqueó la respuesta de Ang II (Figura 4B). Estos datos confirman que el efecto de los betabloqueantes sobre la señalización mediada por Ang II es específico del subtipo de receptores expresados ​​en el tejido estudiado.

Figura 4. trans-Inhibición de la señalización del receptor aguas abajo entre βAR y AT1Rs. A, inmunotransferencias representativas que muestran acumulación de fosfo-ERK después del tratamiento con 10 μmol / L de ISO o 1 μmol / L de Ang II durante 5 minutos en comparación con el control (CN): se agregaron 10 μmol / L de Prop, ICI, Val o Met 30 minutos antes de la estimulación agonista. B, El gráfico de resumen representa datos cuantitativos de 4 a 5 experimentos independientes. *PAG& lt0.01 frente a control. C, inmunotransferencia representativa que muestra acumulación de p-ERK después del tratamiento de HUVEC con 10 μmol / L ISO o 1 μmol / L Ang II durante 5 minutos en ausencia o presencia de 10 μmol / L Prop o Val.

Se encontró que la capacidad de los antagonistas usados ​​en el presente estudio para inhibir la señalización recíproca del receptor depende principalmente de los niveles de expresión de ambos receptores. Por ejemplo, la estimulación de HUVEC con ISO dio como resultado una marcada elevación de la fosforilación de ERK (Figura 4C). Sin embargo, estas células no respondieron a la estimulación de Ang II y la activación de ERK inducida por ISO no fue sensible al tratamiento con valsartán. Los estudios de unión complementarios mostraron que, a diferencia del corazón, las HUVEC expresan βAR y AT1Rs en una proporción de ≈46: 1 (79 frente a 1,7 fmol / mg de proteína, respectivamente).

El hallazgo de que el bloqueo farmacológico del βAR o del AT1Los resultados de R en el desacoplamiento funcional del receptor recíproco de su proteína G afín nos llevaron a postular que este efecto está mediado por una interacción directa entre AT1R y βAR. Para determinar si AT1Rs y βARs forman complejos estables, utilizamos la estrategia de etiquetado diferencial de epítopos y coinmunoprecipitación selectiva. 6 β etiquetado con epítopo BANDERA2AR y AT con etiquetas HA1Las R se expresaron solas o juntas, a niveles de expresión bajos similares, y las células se expusieron a Ang II, ISO o propranolol. Como se muestra en la Figura 5A, inmunoprecipitación de FLAG-β2Los RA dieron como resultado una coinmunoprecipitación de HA-AT1Rs en ausencia de ligando (carril 3). Además, la cantidad de complejo precipitado no se vio afectada por la presencia de agonista o antagonista del receptor (carriles 4 a 6), lo que sugiere que estos receptores se ensamblan como oligómeros antes de su localización en la membrana plasmática. 13

Figura 5. βAR y AT1Rs forman complejos estables. A, células COS-7 transfectadas transitoriamente con FLAG- β2AR (carriles 1 y 7), HA-AT1R (carriles 2 y 8), o ambos (carriles 3 a 6) se trataron durante 30 minutos con 1 μmol / L de Ang II (carril 4), 10 μmol / L ISO (carril 5) o 10 μmol / L de propranolol ( Prop) (carril 6). Las proteínas inmunoprecipitadas (IP) se resolvieron mediante SDS-PAGE y se inmunotransfirieron (IB) para FLAG-β2AR y HA-AT1R usando agarosa monoclonal M2 anti-FLAG-afinidad o matriz de afinidad monoclonal HA-11, respectivamente. La aparición de poblaciones heterogéneas de receptores se debe a la glicosilación variable y / o la formación de complejos de mayor peso molecular. B, las células HEK 293 con expresión endógena de βAR se transfectaron transitoriamente con AT1R-GFP en condiciones que produjeron niveles similares de ambos receptores (10 a 40 fmol / mg de proteína). Las células se trataron con 10 μmol / L de Ang II (izquierda) o se pretrataron con 10 μmol / L de propranolol durante 15 a 20 minutos antes de la estimulación con Ang II (derecha). Las flechas indican vesículas internalizadas formadas después de la estimulación. Imagen confocal representativa de 4 experimentos independientes. C, imágenes representativas de células HEK 293 con expresión endógena de βAR y sobreexpresión de HA-AT1R. Las células se preincubaron en ausencia o presencia de 10 μmol / L de H-89 durante 20 minutos antes de la estimulación con 10 μmol / L de ISO durante 12 minutos. D, Internalización de AT endógena1R después de la estimulación agonista. Las células COS-7 privadas de suero se trataron con 1 µmol / L de Ang II o 10 µmol / L de ISO durante 30 minutos. La preincubación con 10 μmol / L de H-89 se realizó 20 minutos antes de la estimulación. Los valores representan la media ± SEM de 5 experimentos separados realizados por triplicado. *PAG& lt0.01 frente a basal. E, imágenes representativas de células HEK 293 que expresan AT1R-GFP (verde) y FLAG-β2AR (rojo) pretratado con 10 μmol / L Val durante 20 minutos antes de la estimulación con 10 μmol / L ISO. Las flechas indican la aparición de β2AR en vesículas endocíticas, que se observa solo en células que carecen de AT1R.

Para determinar más a fondo si existe una interacción directa entre los βAR y los AT1Rs, examinamos si la estimulación o el bloqueo de 1 receptor afectaba la capacidad del otro receptor para experimentar un proceso de internalización después de la estimulación agonista. 14,15 células HEK 293 que expresan niveles similares de βAR endógenos y AT marcados con GFP transfectados1Los R se estimularon con Ang II en ausencia o presencia de propranolol. Internalización del GFP-AT1R se visualizó en forma de agregados de receptores bajo el microscopio confocal de barrido láser. Como se esperaba, GFP-AT1Rs experimentó una marcada internalización después de la estimulación con Ang II (Figura 5B, izquierda). Sin embargo, el pretratamiento de βAR endógenos con propranolol previno la GFP-AT inducida por Ang II1R internalización, y los receptores permanecieron en la superficie de la membrana plasmática (Figura 5B, derecha).

Análisis de AT1La internalización de R mostró que AT1Las R se internalizan mediante estimulación Ang II o ISO (Fig. 5, C y D). Es importante destacar que solo del 30% al 40% de AT1Rs internalizados en respuesta a ISO, en comparación con ≈80% en respuesta a Ang II. Porque βARs y AT1Los R muestran diferentes patrones de internalización en función de su capacidad para unirse a la β-arrestina, 16 la presencia de AT1Los dímeros R – βAR pueden alterar las propiedades de reciclaje del AT1R a la de un βAR.

Debido a que la endocitosis de los GPCR está precedida por la fosforilación del receptor, es posible que la activación de PKA mediada por βAR pueda promover la fosforilación, desensibilización e internalización mediante desensibilización heteróloga. 17 Para probar esta posibilidad, examinamos el efecto del inhibidor selectivo de PKA H-89 sobre la internalización inducida por ISO del AT1R. Como se vio por microscopía confocal (Figura 5C) y estudios de unión de ligando (Figura 5D), la inhibición de PKA no evitó la internalización de la AT1R en respuesta a ISO, apoyando la idea de que una interacción directa entre los 2 receptores, en lugar de la estimulación de la actividad de la proteína quinasa, es responsable del efecto sobre el tráfico de receptores.

El efecto de valsartán sobre la internalización de βAR se evaluó en células HEK 293, que no mostraron niveles detectables de AT1Rs por unión a ligando. Células transfectadas con FLAG-β2AR solo o con ambos FLAG-β2AR y GFP-AT1R se estimularon con ISO en presencia de valsartán. Células que expresaron solo β2Los AR (rojo) mostraron una internalización marcada después de la estimulación ISO (Figura 5E, flechas blancas). Sin embargo, la internalización en células que expresan tanto βAR (rojo) como GFP-AT1Rs (verde) en respuesta a ISO se deterioró significativamente en presencia de valsartán.

Para determinar si nuestros hallazgos in vitro podrían traducirse en el contexto in vivo, probamos el efecto de una dosis única de valsartán en la elevación de la frecuencia cardíaca estimulada por ISO en ratones intactos vagotomizados de tipo salvaje. Como se muestra en la Figura 6A, las dosis crecientes de ISO produjeron una marcada elevación en la frecuencia cardíaca, ocurriendo la mitad de la respuesta máxima a una dosis de 1 ng por ratón. El pretratamiento con una dosis única de propranolol dio como resultado un marcado desplazamiento de la curva de respuesta ISO hacia la derecha, como se esperaba de un antagonista β competitivo clásico. Por el contrario, una sola dosis de valsartán dio como resultado una reducción significativa del 25% en la frecuencia cardíaca, con la mitad de la respuesta máxima a una dosis de 1,4 ng por ratón. La capacidad de valsartán para atenuar la frecuencia cardíaca estimulada por ISO sin alterar la respuesta semimáxima indica una disminución en la eficacia agonista sin un efecto sobre la potencia agonista. La administración de valsartán o propranolol no tuvo ningún efecto sobre la presión arterial periférica en comparación con el grupo de control, lo que sugiere un efecto directo de valsartán en el corazón (Figura 6B).

Figura 6. El valsartán reduce la elevación de la frecuencia cardíaca estimulada por ISO. A, Evaluación in vivo del cambio en la frecuencia cardíaca en respuesta a dosis crecientes de ISO (○, n = 12) después de la administración aguda de 250 μg de valsartán (•, n = 15) o 1 μg de propranolol (♦, n = 6). El análisis estadístico se realizó con ANOVA de medidas repetidas. La prueba post hoc se realizó con la prueba de Newman-Keuls (*PAG& lt0.005 valsartán frente al control, †PAG& lt0.0005 prop vs control). Se encontró un efecto principal significativo entre los grupos en respuesta a ambos fármacos (PAG& lt0.001). El patrón de cambio entre los grupos también fue estadísticamente diferente (PAG& lt0.00001). B, Cambio en la presión arterial en respuesta a dosis crecientes de ISO (○, n = 12) en presencia de 250 μg de valsartán (•, n = 15) o 1 μg de propranolol (♦, n = 6).

Discusión

El principal hallazgo de este estudio es que AT1Los R pueden interactuar directamente con ambos subtipos de βAR y que esta interacción provoca un fenómeno por el cual el bloqueo selectivo de βAR inhibe la señalización de AT1Rs, mientras que el AT selectivo1El bloqueo de R inhibe la señalización descendente de los βAR. Además, el mecanismo para la transinhibición dual de 2 receptores independientes por un solo antagonista es a través del desacoplamiento funcional del receptor de señalización de su proteína G afín.

El paradigma aceptado para la señalización de GPCR es que estos receptores funcionan como unidades individuales (monómeros), capaces de forma independiente de acoplarse a una proteína G y activar / inhibir moléculas efectoras. Sobre la base de nuestros resultados y los resultados obtenidos para otros GPCR, 8 proponemos un cambio en este paradigma al sugerir que más de 1 receptor puede estar involucrado en el acoplamiento eficiente de la proteína receptor-G, proporcionando así un nuevo papel para la oligomerización in vivo de GPCR. Debido a que uno de los receptores en el complejo (el receptor "no señalizador") tiene que estar libre de antagonistas para permitir el acoplamiento y la señalización del receptor activado por ligando, puede tener un papel en la estabilización de la interacción del receptor activado con su afín G proteína. 18 Por lo tanto, es posible que el bloqueo de βAR o AT1Rs induce un cambio conformacional que ya no es favorable para apoyar la interacción del otro receptor con su proteína G (es decir, AT1R – Gq o βARs – Gs). Actualmente se está investigando la naturaleza de los cambios conformacionales en presencia de agonistas o antagonistas y su efecto sobre el receptor recíproco.

La evidencia acumulada indica que la formación de oligómeros por GPCR agrega un nivel de complejidad a su señalización. Aquí, demostramos una interacción entre AT1Rs y βARs y presentan evidencia de que como resultado de esta interacción, un antagonista de un solo receptor bloquea simultáneamente la señalización y el tráfico de ambos receptores. Estos hallazgos están respaldados por observaciones recientes realizadas en células de cáncer de próstata, en las que el bloqueo del receptor de bradicinina tipo 1 o del receptor de bradicinina tipo 2 resultó en un acoplamiento y señalización deteriorados por el receptor recíproco sin interferir con la unión del ligando. 8 Debido a que nuestros datos, así como otros estudios, 19 indican que la dimerización es un proceso constitutivo, la respuesta general de un órgano a un agonista o antagonista dependerá muy probablemente de los niveles y combinaciones de complejos de GPCR que expresa. Al respecto, recientemente se demostró que AT1Los dímeros del receptor de R-bradicinina aumentan la eficacia y la potencia de Ang II 20 y que un aumento en el número de estos dímeros media la hipersensibilidad inducida por Ang II en la preeclampsia. 21 Aquí, también demostramos que mientras que los βAR son sensibles al valsartán en el corazón, no se ven afectados por este fármaco en las células endoteliales, que expresan una proporción mucho mayor de βAR a AT1Rs. Juntos, estos hallazgos indican que los niveles de expresión de diferentes receptores tienen un efecto crítico sobre la respuesta general de un tejido específico a los antagonistas selectivos de los receptores.

Se ha demostrado que el bloqueo selectivo de la angiotensina y las vías de señalización adrenérgica en pacientes con insuficiencia cardíaca moderada y grave mejora la supervivencia y la calidad de vida. 22-25 Debido a que algunas de las características de la insuficiencia cardíaca son anomalías distintas en el sistema βAR, actualmente se cree que muchos de los efectos beneficiosos de los β-bloqueadores son el resultado del antagonismo de los efectos citotóxicos de las catecolaminas circulantes elevadas y la normalización de Señalización βAR. 2 En vista de nuestros datos in vitro e in vivo, proponemos que los β-bloqueadores pueden tener un nuevo papel adicional en el bloqueo directo de las vías mediadas por Ang II, obteniendo así el control de 2 vías de señalización que desempeñan un papel fundamental en la función cardíaca y son fuertemente implicado en la fisiopatología de la insuficiencia cardíaca.

Aunque hay poca evidencia física directa de AT1Dimerización de R-βAR en el corazón, creemos que nuestros datos apoyan fuertemente la existencia de diafonía directa de receptores in vivo. Por lo tanto, es posible que la transinhibición de la señalización del receptor tenga implicaciones potencialmente amplias cuando el uso de AT1Los antagonistas de R y βAR se consideran en el tratamiento de estados patológicos como la insuficiencia cardíaca, en particular porque el uso de un antagonista puede bloquear más de una vía de señalización. Aunque se debe tener precaución con respecto a la traducción de los datos in vitro al resultado de los ensayos clínicos, nuestros datos pueden proporcionar una explicación biológica para los hallazgos inesperados del estudio de valsartán en pacientes con insuficiencia cardíaca (el ensayo clínico Val-Heft 6), en cuyo tratamiento de pacientes con una combinación de betabloqueantes, valsartán e inhibidores de la ECA resultó en un aumento de los eventos adversos. 26 Si de hecho AT1Las interacciones R-βAR ocurren in vivo, como sugieren nuestros datos, los β-bloqueadores junto con valsartán producirían una inhibición casi completa de ambas vías de señalización del receptor, porque cada antagonista bloquea no solo su propio receptor, sino también la señalización del receptor recíproco por un mecanismo de transinhibición. La adición de inhibidores de la ECA reduciría los niveles de Ang II y norepinefrina circulantes mediante la inhibición del sistema renina-angiotensina y el sistema nervioso simpático. 27 Por lo tanto, una combinación de los 3 fármacos puede actuar en conjunto para suprimir severamente los 2 sistemas de señalización más allá de un punto crítico necesario para mantener la homeostasis.

En conclusión, el presente estudio muestra que las interacciones directas entre βAR y AT1Los R in vivo tienen un papel importante en la determinación de la respuesta general a los fármacos diseñados para bloquear estos receptores. Por lo tanto, una mejor comprensión de las complejas interacciones entre diferentes GPCR in vivo puede tener implicaciones importantes para el desarrollo de un tratamiento farmacológico altamente especificado para una amplia gama de trastornos cardiovasculares.

Este artículo apareció originalmente en línea el 8 de septiembre de 2003 (Circulación. 2003108: r79 – r86).

Este trabajo fue financiado en parte por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud HL-56687 y el Fondo Burroughs Wellcome (ambos al Dr. Rockman). El Dr. Rockman ha recibido el premio de científico clínico Burroughs Wellcome Fund en investigación traslacional. Los autores agradecen a Kristine Hesser Porter, al Dr. Lan Mao y a Weili Zou por su excelente asistencia técnica.


Nos gustaría agradecer al Dr. Mike Stubbington por sus fructíferas discusiones sobre el tema de la predicción de la especificidad de las células T. D.S.F. reconoce el apoyo de una beca de la Fundación de Investigación Alemana (DFG) a través de la Escuela de Graduados de Biociencias Cuantitativas de Munich (QBM) [GSC 1006 a D.S.F.] y de Joachim Herz Stiftung. B.S. reconoce el apoyo financiero del Programa de becas posdoctorales del Helmholtz Zentrum München. F.J.T. reconoce el apoyo financiero de la Graduate School QBM, la Fundación de Investigación Alemana (DFG) dentro del Collaborative Research Center 1243, Subproyecto A17, por la Asociación Helmholtz (Incubadora subvención sparse2big, subvención # ZT-I-0007), por la subvención BMBF # 01IS18036A , y subvención # 01IS18053A y por la Iniciativa Chan Zuckerberg DAF (fondo asesorado de Silicon Valley Community Foundation, 182835). Agradecemos al Centro de Servicios de Información y Computación de Alto Rendimiento (ZIH) de TU Dresden por las generosas asignaciones de tiempo informático.

DSF y YW implementaron los modos y realizaron el análisis. DSF, BS y FJT redactaron el manuscrito.


B1. Unión de un solo ligando: biología

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Última modificación 21 de mayo de 2019

Esta subsección de la sección Función describe la interacción entre un solo aminoácido y otra entidad química. Se da prioridad a la anotación de ligandos fisiológicos.

Un grupo de residuos de unión a ligandos que están separados por no más de tres residuos se muestra como una 'Región'.

La naturaleza general del ligando (sustrato, carbohidrato, etc.) se indica en el campo Descripción. Si se define, también se proporciona la composición química exacta.
Ejemplo: P83790

Cuando la entidad química que se une al aminoácido es un metal, esta información se almacena en la subsección "Unión de metales".
Ejemplo: P24146

Por defecto, la interacción involucra la cadena lateral de aminoácidos. Para las interacciones mediadas a través de los átomos de nitrógeno de la cadena lateral de histidina, indicamos, cuando se conoce, qué nitrógeno está involucrado: Pros es el término utilizado para el átomo de nitrógeno más cercano al carbono alfa y tele para el otro.
Ejemplo: Q57I19, P73925

También se especifican las interacciones que se producen a través del oxígeno o el nitrógeno de la cadena principal.
Ejemplo: Q8CFV9

Las interacciones se consideran no covalentes de forma predeterminada. Cuando una sustancia está unida covalentemente con un cofactor o un grupo protésico, esto se indica mediante el calificativo "covalente".
Ejemplo: P81280

Para los residuos de enzimas que se unen tanto al sustrato como al producto de la reacción, hemos optado por indicar la unión al sustrato.
Ejemplo: P08019

Esta subsección complementa la información sobre la unión covalente descrita en las subsecciones "Residuo modificado", "Glicosilación" y "Lipidación", así como la información en la subsección "Sitio activo" relativa a los intermediarios de reacción inestables.


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