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6.5: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - Biología

6.5: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - Biología


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La replicación del ADN se logra mediante la enzima ADN polimerasa que tiene las siguientes características:

  1. La ADN polimerasa cataliza la extensión de un oligonucleótido en el Dirección 5 '→ 3'. No puede ir en la dirección opuesta.
  2. A Plantilla de ADN (es decir, oligonucleótido monocatenario). Esta es la información que se replica (a través del emparejamiento de bases Watson-Crick). Si desea replicar la hebra "sentido" de un dúplex de ADN, entonces la plantilla es la hebra antisentido. Dado que el ADN es un dúplex, que se mantiene unido por fuerzas no covalentes, podemos separar las hebras del dúplex (y obtener una plantilla adecuada) mediante desnaturalización por calor (o álcali).
  3. La ADN polimerasa solo puede extender un oligonucleótido existente, no puede iniciar la replicación. Por tanto, además de un molde, la ADN polimerasa requiere un oligonucleótido cebador. La ADN polimerasa extiende el cebador en el 5 '3 'dirección.
  4. Los nucleótidos incorporados en el oligonucleótido naciente deben ser trifosfatos de nucleósidos (es decir, dNTP). La energía liberada en la hidrólisis de los enlaces fosfato anhídrido se utiliza en la formación de enlaces covalentes (incorporación del fosfato a en la columna vertebral del fosfodiéster del oligonucleótido en crecimiento).
  5. Aunque las ADN polimerasas catalizan la extensión en el 5 'Dirección 3 ', algunos tienen la capacidad de "corregir"." Lectura de pruebas "es la capacidad de reconocer una incorporación incorrecta de una base y la capacidad de hacer una copia de seguridad y eliminar la base incorrecta, y luego continuar.

Figura 6.5.1: Síntesis de ADN

  • PCR es un in vitro técnica para la amplificación de una región de ADN que se encuentra entre dos regiones de secuencia conocida.
  • La amplificación por PCR se logra mediante el uso de cebadores de oligonucleótidos. Estos son típicamente oligonucleótidos monocatenarios cortos que son complementario a las regiones exteriores de secuencia conocida.

Figura 6.5.2: Amplificación por PCR

Los oligonucleótidos sirven como imprimaciones para la ADN polimerasa y cada una de las hebras desnaturalizadas del dúplex de ADN parental sirve como plantilla.

Esto da como resultado la síntesis de nuevas hebras de ADN que son complementarias a las hebras de la plantilla madre.

Los pasos de:

  1. Desnaturalización de plantilla
  2. Recocido de imprimación
  3. Extensión de imprimación

comprender un solo "ciclo" en la metodología de amplificación por PCR.

  • Después de cada ciclo, las hebras de ADN recién sintetizadas pueden servir como plantillas en el siguiente ciclo (los cebadores de PCR generalmente se agregan en un exceso molar sustancial al ADN molde)

Resumen de productos al final de cada ciclo de PCR:

Figura 6.5.3: Productos de PCR

El producto de PCR deseado será un dúplex del fragmento de longitud definida. La pregunta es: ¿cuántos se producirán?

· Lo esperado amplificación del producto de longitud definida deseada con respecto a la concentración de plantilla original 'x' puede representarse por la fórmula:

[(2norte - (n + 1)) - (n + 1)] x

o

(2norte - 2 (n + 1))

(Esto a menudo se abrevia como una simple regla empírica para el amplificación: (2norte - 2n) x)

· La interpretación de esta fórmula es que

  • Para un número dado de ciclos 'n' hacemos '2norte X' total de dúplex posibles
  • Para un número dado de ciclos habrá '2 (n + 1) (o 2n en nuestra aproximación) x' dúplex que se forman a partir de la plantilla original o un fragmento de longitud indeterminada, junto con un fragmento de longitud definida ( y representan un producto no deseado)
  • Por lo tanto, la concentración total del producto deseado (dúplex con una longitud definida por los cebadores de PCR) será
    (2norte - 2 (n + 1)) x (donde x es la concentración del dúplex original)

El valor de amplificación teórico nunca se alcanza en la práctica. Varios factores evitan que esto ocurra, entre ellos:

1. La competencia de las hebras hijas complementarias con los cebadores para el reasociamiento (es decir, el reasociamiento de dos hebras hijas no produce amplificación).

2. Pérdida de actividad enzimática debido a la desnaturalización térmica, especialmente en los ciclos posteriores.

3. Incluso sin desnaturalización térmica, la cantidad de enzima se vuelve limitante debido al exceso de diana molar en ciclos posteriores (es decir, después de 25 a 30 ciclos, es necesario extender demasiados cebadores)

4. Posible recocido del cebador en el segundo sitio y cebado no productivo

Parámetros de ciclos térmicos

Los parámetros de los ciclos térmicos son fundamentales para el éxito de un experimento de PCR. Los pasos importantes en cada ciclo de PCR incluyen:

1. desnaturalización de la plantilla (normalmente se realiza a la temperatura más alta: 100 ° C)

2. recocido de imprimaciones (la temperatura se elige en función de la temperatura de fusión de la imprimación)

3. extensión de los cebadores (realizada de manera óptima para la polimerasa que se está utilizando)

Un perfil de temperatura representativo para cada ciclo podría tener el siguiente aspecto:

Figura 6.5.4: Ciclos térmicos

Tampones y MgCl2 en reacciones de PCR

Un tampón de reacción típico para PCR sería algo como:

  • Tris 10 mM, pH 8,3
  • KCl 50 mM
  • 1,5 mM de MgCl2
  • 0,01% de gelatina
  • El MgCl2 La concentración en la mezcla de reacción final está normalmente entre 0,5 y 5,0 mM, y la concentración óptima se determina empíricamente (normalmente entre 1,0 y 1,5 mM). Mg2+ iones:
    • formar un complejo soluble con dNTP que es esencial para la incorporación de dNTP
    • estimular la actividad de la polimerasa
    • Aumentar la Tm (temperatura de fusión) de la interacción cebador / molde (es decir, sirve para estabilizar la interacción dúplex

Generalmente,

  • bajo Mg2+ conduce a bajos rendimientos (o ningún rendimiento) y
  • elevado Mg2+ conduce a la acumulación de productos inespecíficos (cebado incorrecto).

Elección de polimerasas para PCR

  • Uno de los avances importantes que permitió el desarrollo de la PCR fue la disponibilidad de polimerasas termoestables.
  • Esto permitió que la enzima añadida inicialmente sobreviviera a ciclos de temperatura cercanos a los 100 ° C.
  • Propiedades de las ADN polimerasas utilizadas en PCR

Taq/ Amplitaq®

Vent ™

Deep Vent ™

Pfu

Tth

ULTma

Vida media de 95 ° C

40 min

400 min

1380 min

> 120 min

20 minutos

> 50 min

Tasa de extensión (nt / seg)

75

>80

?

60

>33

?

Extremos resultantes

3 'A

> 95% contundente

> 95% contundente

desafilado

3 'A

desafilado

Desplazamiento de hebra

+

+

5'®3 'exo

+

+

3'®5 'exo

+

+

+

+

Imprimaciones

Diseño de imprimación

  • Generalmente, los cebadores utilizados tienen una longitud de 20 a 30 meros. Esto proporciona temperaturas prácticas de recocido (del régimen de alta temperatura donde la polimerasa termoestable es más activa).
  • Los cebadores deben evitar tramos de secuencias de polibases (por ejemplo, poli dG) o motivos repetidos, que pueden hibridar con registros inapropiados en la plantilla.
  • Deben evitarse las secuencias repetidas invertidas para evitar la formación de una estructura secundaria en el cebador, lo que evitaría la hibridación con el molde.
  • Deben evitarse las secuencias complementarias a otros cebadores utilizados en la PCR para evitar la hibridación entre cebadores (particularmente importante para el 3 'final de la cartilla)
  • Si es posible, el extremo 3 'del cebador debe ser rico en bases G, C para mejorar el apareamiento del extremo que se extenderá
  • La distancia entre imprimaciones debe ser inferior a 10 Kb de longitud. Normalmente, se observa una reducción sustancial en el rendimiento cuando los cebadores se extienden entre sí más allá de ~ 3 Kb.

Temperatura de fusión (Tm) de los cebadores

  • La Tm de la hibridación del cebador se puede calcular usando varias fórmulas. La fórmula más utilizada es:

(1) Tm = [(número de residuos A + T) x 2 ° C] + [(número de residuos G + C) x 4 ° C]

  • Ejemplos de Tmetro calculos

GRAMO

A

T

C

Tmetro

15 mer

3

5

2

5

46

20 mer

6

5

4

5

62

30 mer

8

6

8

8

92

Si la temperatura de recocido es demasiado alta, los cebadores no se templan. Si es demasiado bajo, cebado incorrecto Puede ocurrir en sitios de secuencia de ADN similar al sitio de unión del cebador deseado.

Análisis del experimento de PCR

  • 25-30 ciclos son comunes
  • El producto principal debe ser una molécula de ADN dúplex cuyos extremos 5 'y 3' estén definidos por los dos cebadores de PCR
  • Sin embargo, se pueden producir otros productos. Estos a menudo representan productos de sitios de cebado secundario (cebado incorrecto) o errores de incorporación incorrecta de la polimerasa.
  • Por tanto, el producto de la PCR puede ser heterogéneo y debe separarse y analizarse
  • Agarosa electroforesis en gel, en combinación con la tinción con bromuro de etidio, es el método más común para separar y analizar productos de PCR

Amplificación de ácidos nucleicos

Reacción en cadena de la polimerasa multiplex

En la PCR multiplex, se incluyen dos o más conjuntos de cebadores diseñados para la amplificación de diferentes dianas en la misma reacción de PCR. Con esta técnica, se puede amplificar más de una secuencia diana en una muestra clínica en un solo tubo. Como extensión del uso práctico de la PCR, esta técnica puede ahorrar tiempo y esfuerzo. Los cebadores utilizados en las reacciones multiplex deben seleccionarse cuidadosamente para tener temperaturas de hibridación similares y no deben ser complementarios entre sí. Los tamaños de los amplicones deben ser lo suficientemente diferentes para formar bandas distintas cuando se visualizan mediante electroforesis en gel. La PCR multiplex puede diseñarse en una reacción de PCR de plantilla única que utiliza varios conjuntos de cebadores para amplificar regiones específicas dentro de una plantilla, o en una reacción de PCR de plantilla múltiple, que utiliza varias plantillas y varios conjuntos de cebadores en el mismo tubo de reacción (figura 9.6). ). Aunque el uso de la PCR multiplex puede reducir los costos y el tiempo para detectar simultáneamente dos, tres o más patógenos en una muestra, la PCR multiplex es más complicada de desarrollar y, a menudo, es menos sensible que la PCR con un solo conjunto de cebadores. La ventaja de la PCR multiplex es que se puede utilizar un conjunto de cebadores como control interno, de modo que podemos eliminar la posibilidad de falsos positivos o negativos. Además, la PCR multiplex puede ahorrar costosas polimerasas y plantillas en escasez.

Figura 9.6. Descripción general de la PCR multiplex.


¿Por qué se usa Taq en PCR?

Polimerasa taq es una forma termoestable de ADN polimerasa que puede funcionar después de la exposición a las altas temperaturas necesarias para PCR. Otras polimerasas sometido a altas temperaturas usó en el reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se desnaturalizaría y dejaría de ser funcional.

También se puede preguntar, ¿por qué fue importante el descubrimiento de la ADN polimerasa Taq para el desarrollo de la PCR? Polimerasa taq, el primer termoestable ADN polimerasa por PCR, era descubierto en 1966. PCR transformado ADN amplificación, haciendo que el proceso sea rápido y eficiente. Esto revolucionaría la clonación, ADN diseño de pruebas, medicina forense y medicina.

Entonces, ¿por qué se utiliza Thermus aquaticus en PCR?

Es por esta propiedad que hace que la polimerasa Taq sea un producto tan importante. La ADN polimerasa que se encuentra en Thermus aquaticus permanece estable incluso a temperaturas muy altas. Debido a esta estabilidad puede ser usó en el proceso conocido como reacción en cadena de la polimerasa, o PCR.


En las ciencias biológicas se han producido avances tecnológicos que catapultan a la disciplina a edades doradas de los descubrimientos. Por ejemplo, el campo de la microbiología se transformó con la llegada del microscopio de Anton van Leeuwenhoek, que permitió a los científicos visualizar procariotas por primera vez. El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de esas innovaciones que cambió el curso de la ciencia molecular con su impacto que abarca innumerables subdisciplinas en biología. El proceso teórico fue delineado por Keppe y sus colaboradores en 1971, sin embargo, pasaron otros 14 años hasta que Kary Mullis describió y aplicó experimentalmente el procedimiento completo de PCR mientras trabajaba en Cetus Corporation en 1985. La automatización y el refinamiento de esta técnica progresaron con la introducción de un ADN polimerasa termoestable de la bacteria Thermus aquaticus, en consecuencia el nombre Taq ADN polimerasa.

La PCR es una técnica de amplificación poderosa que puede generar un amplio suministro de un segmento específico de ADN (es decir, un amplicón) a partir de solo una pequeña cantidad de material de partida (es decir, plantilla de ADN o secuencia diana). Si bien es sencillo y, por lo general, no presenta problemas, existen errores que complican la reacción y producen resultados falsos. Cuando la PCR falla, puede dar lugar a muchos productos de ADN no específicos de diferentes tamaños que aparecen como una escalera o mancha de bandas en geles de agarosa. A veces no se forma ningún producto. Otro problema potencial ocurre cuando las mutaciones se introducen involuntariamente en los amplicones, dando como resultado una población heterogénea de productos de PCR. Las fallas de PCR pueden volverse frustrantes a menos que se emplee paciencia y una solución de problemas cuidadosa para resolver y resolver los problemas. Este protocolo describe los principios básicos de la PCR, proporciona una metodología que dará como resultado la amplificación de la mayoría de las secuencias diana y presenta estrategias para optimizar una reacción. Siguiendo esta guía de PCR, los estudiantes deberían poder:

  • Configurar reacciones y condiciones de ciclos térmicos para un experimento de PCR convencional
  • Comprender la función de varios componentes de la reacción y su efecto general en un experimento de PCR.
  • Diseñe y optimice un experimento de PCR para cualquier plantilla de ADN
  • Solucionar problemas de experimentos de PCR fallidos

Mejora de la especificidad de la reacción en cadena de la polimerasa mediante el óxido de grafeno mediante la modificación de la superficie: el polímero de iones híbridos es superior a otros polímeros con diferentes cargas

1 Departamento de Biomateriales, Facultad de Materiales, 2 Laboratorio Estatal Clave de Biología del Estrés Celular, Facultad de Ciencias de la Vida, 3 Departamento de Física, Instituto de Investigación en Biomimética y Materia Blanda, Universidad de Xiamen, Xiamen, República Popular y rsquos de China

*Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo

Abstracto: Se preparan óxidos de grafeno (GO) con diferentes características superficiales, como tamaño, grado de reducción y carga, y se investigan sus efectos sobre la especificidad de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este estudio, demostramos que la GO con un tamaño grande y un alto grado de reducción es superior a la GO pequeña y no reducida para mejorar la especificidad de la PCR. El ácido poliacrílico cargado negativamente (PAA), la poliacrilamida cargada positivamente (PAM), el polietilenglicol neutro (PEG) y el polímero de iones híbridos poli (sulfobetaína) (pSB) se utilizan para modificar GO. La capacidad de mejora de la especificidad de la PCR aumenta en el siguiente orden: GO-PAA & lt GO-PAM & lt GO-PEG & lt GO-pSB. Por tanto, el GO modificado con polímero de ion híbrido es superior a otros derivados de GO con diferentes cargas para mejorar la especificidad de la PCR. Los derivados de GO también se utilizan con éxito para mejorar la especificidad de la PCR para la amplificación del ADN mitocondrial humano utilizando ADN genómico sanguíneo como molde. Se realizan simulaciones de dinámica molecular y acoplamiento molecular para dilucidar la interacción entre los polímeros y Pfu ADN polimerasa. Nuestros datos demuestran que el tamaño, el grado de reducción y la carga superficial de GO afectan la especificidad de la PCR. Basándonos en nuestros resultados, el GO modificado con polímero de ion híbrido puede usarse como un aditivo eficaz para mejorar la especificidad de la PCR.

Palabras clave: Aditivo de PCR, carga, pSB, Pfu ADN polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las herramientas más ubicuas y mejor desarrolladas en biología molecular. 1,2 Debido a su capacidad para producir miles de millones de copias de ADN mediante la amplificación rápida y selectiva de una región específica en la cadena de ADN, tiene una amplia gama de aplicaciones en la amplificación de genes, la clonación molecular y el diagnóstico de enfermedades. 3 Una PCR básica generalmente requiere los siguientes cinco componentes: 1) plantilla de ADN que contiene la región de ADN diana, 2) dos cebadores para iniciar la síntesis de ADN, 3) una ADN polimerasa termoestable para catalizar la síntesis de ADN, 4) desoxinucleósido trifosfato (dNTP, el edificio bloques de nueva cadena de ADN) y 5) tampón que incluye cationes bivalentes (generalmente Mg 2 & # 43). 4 A menudo, puede ser necesario un proceso de optimización que requiere mucho tiempo para obtener una PCR exitosa, principalmente cuando se requiere la amplificación a partir de ADN genómico.

Muchos factores afectarán la especificidad de la PCR, como la pureza y secuencia del cebador, la pureza del ADN molde, la concentración de Mg 2 & # 43, la temperatura de hibridación y otros aditivos como el dimetilsulfóxido (DMSO), que se incluyen con frecuencia en la mezcla de PCR. . 5,6 Por lo general, cuando la concentración de la plantilla de ADN es muy baja o la estructura de la plantilla de ADN es muy complicada, como el gen rico en GC o el ADN genómico de mamífero, la especificidad de la PCR puede ser muy baja. Se han desarrollado diferentes estrategias para mejorar la especificidad de la PCR, como la PCR anidada utilizando dos conjuntos separados de cebadores, la PCR de contacto con temperaturas de hibridación disminuidas gradualmente y la PCR de inicio en caliente que retiene la ADN polimerasa o los cebadores hasta que la mezcla de reacción alcanza una temperatura superior el umbral para la unión inespecífica del cebador al molde. 4 Sin embargo, optimizar el diseño del cebador, las condiciones de ciclo de la PCR y las temperaturas de hibridación y ajustar las concentraciones de los componentes de la PCR son procesos largos y frustrantes. Para mejorar la especificidad de la PCR, se han utilizado varias moléculas pequeñas como aditivos, como DMSO, glicerina, betaína, formamida y albúmina de suero bovino (BSA). 7,8 Usarlos solos o en combinación no garantiza la mejora de la especificidad de la PCR. Por tanto, el efecto de estos aditivos es impredecible. Por lo tanto, sigue siendo un desafío encontrar nuevos aditivos para mejorar la especificidad de la PCR.

En los últimos años, se han utilizado nanomateriales en sistemas de PCR, incluidas nanopartículas metálicas, puntos cuánticos semiconductores, nanomateriales de carbono y nanopartículas poliméricas. 9 & # 821119 Los nanomateriales a menudo poseen propiedades físicas y químicas únicas, por ejemplo, efecto de superficie que surge de su gran relación superficie-volumen, que difieren mucho de los materiales macroscópicos. El efecto de los nanomateriales en la PCR depende principalmente de la fuerte interacción entre los componentes de la PCR y los nanomateriales. 20 Sin embargo, se obtuvieron resultados contradictorios de diferentes grupos de investigación. 21 & # 821125 Por lo tanto, el efecto de los nanomateriales con diferentes características de superficie en la PCR aún no está claro y se necesitan investigaciones mucho más sistémicas y profundas para comprender el mecanismo correspondiente.

Nuestro estudio anterior ha demostrado que la reducción del óxido de grafeno (RGO) puede mejorar significativamente la especificidad de la PCR. 19 Sin embargo, RGO tiene poca solubilidad en agua debido a su escasez de grupos funcionales en su superficie, lo que inhibe la aplicación posterior de RGO. En comparación con RGO, hay muchos grupos hidroxilo, epoxi y carboxilo en la hoja de óxido de grafeno (GO), que dan como resultado una alta polaridad e hidrofilia de GO.Por tanto, GO es hidrófilo y se puede dispersar bien en agua. Una modificación adicional de la superficie de GO puede proporcionar a GO algunas propiedades de superficie nuevas. 26 & # 821131 En este estudio, GO se modificó con ácido poliacrílico terminado en carboxilo (PAA) cargado negativamente, poliacrilamida terminada en amino (PAM) cargada positivamente, polietilenglicol neutro (PEG) o polímero de iones híbridos poli (sulfobetaína) (pSB). Además, investigamos el efecto de GO con diferentes propiedades de superficie, como tamaño, grado de reducción y modificación de la superficie, sobre la especificidad de la PCR. Descubrimos que grande y RGO era superior a pequeño y no RGO en la mejora de la especificidad de la PCR. La carga superficial de GO también afectó a la especificidad de la PCR en el siguiente orden: GO-PAA & # 60 GO-PAM & # 60 GO-PEG & # 60 GO-pSB. Para el GO modificado con polímero, se encontró que el pSB de ion híbrido era superior para mejorar la especificidad de la PCR en comparación con los polímeros neutrales y cargados negativa y positivamente. Estos derivados de GO con diferentes cargas superficiales se han utilizado con éxito como aditivos en la amplificación del ADN mitocondrial utilizando ADN genómico sanguíneo como molde. Basándonos en nuestros resultados, sugerimos que los derivados de GO también pueden mejorar la especificidad de la PCR de ADN de baja abundancia obtenido de muestras clínicas. Las simulaciones de dinámica molecular y el acoplamiento molecular se utilizan además para investigar la interacción entre los polímeros y Pfu ADN polimerasa para comprender el mecanismo de mejora de la especificidad. Los resultados de nuestra investigación pueden, en última instancia, avanzar en la aplicación de la GO en los campos biomédicos.

Se adquirió polvo de grafito natural (malla 320, Alfa, 99 y nº 37) de Tianjin Guangfu Chemical Agent Co., Ltd. (Tianjin, República Popular de China nº 8217). NaNO3, KMnO4, K3correos4 (99%), L-lisina (98 y # 37), ninhidrina (97 y # 37) y H2O2 se compraron a Guoyao Co., Ltd. (Shanghai, República Popular de China). Ácido acrílico (AA), acrilamida (AM), H2ASI QUE4, HCl, hidrato de hidracina (80 & # 37), etanol, NaHCO3, NaOH, Mg2ASI QUE4 (99 & # 37), rojo de metilo y borato de sodio se adquirieron de Xilong Chemical (Guangzhou, República Popular de China # 8217). El peroxosulfato de potasio se adquirió de Dahao Nanhong Industrial Co., Ltd. (Shantou, República Popular de China). mPEG-NH2 se compró a Kaizheng Biotech Development Co., Ltd. (Beijing, República Popular de China). El clorhidrato de 1-etil-3- [3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, 98 & # 37) se adquirió de Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, People & # 8217s República de China). BSA (98 & ​​# 37) e hidróxido de [2- (metacriloiloxi) etil] dimetil- (3-sulfopropil) amonio (SB, 98 & # 37) se adquirieron de Sigma-Aldrich. Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico-reactivo, excepto los indicados especialmente. El tubo de diálisis (8,000 & # 821114,000 MWCO) se compró a Solarbio Life Sciences (Beijing, People & # 8217s República de China). El ADN del plásmido pET-32a se adquirió en Novegan, Shanghai, República Popular de China. los Pfu polimerasa, dNTP, tampón 10 & # 215, filtro de 0,22 & # 956m, agarosa, glicerol, caldo Luria-Bertani, bromuro de etidio (EB), marcador de ADN, tampón de carga de ADN, CaCl anhidro2, Se adquirieron tubos de PCR, tampón TAE 50 & # 215 y ampicilina de Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, República Popular China & # 8217s). Los cebadores fueron sintetizados por Sangon Biotech Co., Ltd. (Tabla S1). Los productos de PCR fueron secuenciados por Sangon Biotech Co., Ltd. Se adquirió el mini kit de plásmido de TIANGEN Biotech Co., Ltd. (Beijing, República Popular de China). El kit de preparación de plantilla de PCR de alta pureza se adquirió de Roche Ltd. (Alemania). En todos los experimentos se utilizó agua desionizada.

Síntesis de GO y sus derivados

GO se sintetizó de acuerdo con nuestro método anterior. 32,33 Primero, 2.0 g de polvo de grafito y 1.0 g de NaNO3 se agregaron a 46 mL de 98 & # 37 H2ASI QUE4 en un baño de hielo, y luego 6.0 g de KMnO4 se añadió lentamente a la mezcla con agitación vigorosa. La mezcla se agitó continuamente durante 2 horas en el baño de hielo y se colocó en un baño de agua a 35 ° C durante 30 minutos. Luego se añadieron gradualmente 92 ml de agua y la temperatura se elevó a 95 ° C. La solución se agitó durante 3 horas. Finalmente, se agregaron 400 mL de agua y 6 mL de 30 & # 37 H2O2 se dejó caer en la reacción. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se filtró y se lavó con HCl 1:10 (relación en volumen), seguido de repetidos lavados con agua para eliminar el ácido. A continuación, la torta de filtración se dispersó en agua para obtener óxido de grafito. La exfoliación del óxido de grafito a GO se logró mediante ultrasonidos durante 3 horas a 500 W. El agregado se eliminó mediante centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se dializó en agua durante 1 semana para eliminar las sales residuales.

Se prepararon GO pequeños (S-GO) y GO grandes (L-GO) de acuerdo con la literatura. 34 La solución de GO dializada se sonicó durante 10 horas, seguido de centrifugación a 12.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se recogió como S-GO. El agregado se dispersó de nuevo en agua y se centrifugó a 2.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió como L-GO. Se preparó RGO a partir de GO, que se redujo mediante hidrato de hidrazina en amoníaco. Se cargó un total de 50 mL de 1 mg mL & # 87221 GO en un matraz de cuatro bocas, y luego se añadieron 6 & # 956L de hidrato de hidrazina 80 & # 37 y 100 & # 956L de hidróxido de amonio 28 & # 37. Después de mezclar a fondo, la solución se calentó en un baño de aceite a 95 ° C durante 1 hora. El sobrenadante se recogió y se dializó durante una semana en agua. Se preparó otra muestra de RGO con un grado de reducción más alto añadiendo 42 & # 956L de hidrato de hidrazina 80 & # 37 y 700 & # 956L de hidróxido de amonio 28 & # 37.

GO-PAA y GO-PAM se prepararon de acuerdo con nuestro protocolo anterior. En primer lugar, se añadió 1 ml de 1 g ml de monómero de & # 87221 AA a 50 ml de una solución de 1 mg ml de & # 87221 GO con agitación vigorosa a temperatura ambiente. Con purga de nitrógeno durante 30 minutos, 80 mg de (NH4)2S2O8 se añadió y se calentó a 70 ° C durante 3 horas en un baño de aceite. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron 200 ml de agua y se sonicaron durante 1 hora, seguido de diálisis durante una semana para eliminar el PAA libre. Después de centrifugar a 4.000 rpm durante 30 minutos, se recogió el sobrenadante como GO-PAA. Se prepararon GO-PAM y GO-pSB de forma similar excepto que el monómero AA se reemplazó por monómero AM o SB. Para la preparación de GO-pSB, se usó peroxosulfato de potasio como iniciador y la mezcla de reacción se calentó a 70 ° C durante 15 horas.

GO-PEG se preparó de acuerdo con la literatura. 36 Primero, se mezclaron 10 ml de NaOH 3 M con 20 ml de solución de 2 mg ml de & # 87221 GO y se sonicó durante 3 horas. Luego se añadió HCl 10 & # 37 para neutralizar la solución a pH 7. La mezcla se filtró y se aclaró con agua. A continuación, la torta de filtración se dispersó en 40 ml de agua. Un total de 80 mg de mPEG-NH2 se añadió a la solución y se sonicó durante 5 minutos. Luego se añadieron 20 mg de EDC y se sonicaron durante otros 30 minutos, seguido de la adición de 60 mg de EDC y se agitó durante la noche. El sobrenadante se recogió y se dializó durante una semana en agua para eliminar el exceso de mPEG-NH.2. Después de 30 minutos de centrifugación a 4.000 rpm, se recogió el sobrenadante como GO-PEG.

Caracterización de GO y sus derivados

Se obtuvieron imágenes de microscopía de fuerza atómica (AFM) en el modo de golpeteo en el aire usando Nanoscope Multimode 8 (Veeco Instruments Inc., EE. UU.). Los espectros de absorción UV & # 8211vis se obtuvieron usando un espectrómetro TU-1901 UV & # 8211Vis (Beijing Purkinje General Instrument, People & # 8217s Republic of China). Los espectros de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR) se registraron en un espectrómetro Nicolet iS10 (Thermo Scientific, EE. UU.). Sistema de difracción de rayos X en polvo (XRD) (Ultima IV Rigaku, Japón) equipado con radiación Cu K & # 945 (λ & # 611.542 & # 197) para caracterizar las estructuras cristalográficas de los materiales. Los espectros de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) se registraron en un espectrómetro de fotoelectrones de rayos X Phi Quantum 2000 (PHI, EE. UU.). El análisis termogravimétrico (TGA) se realizó en un SDT-Q600 (TA Instruments, EE. UU.) En atmósfera de nitrógeno a una velocidad de calentamiento de 10 & # 176ºC min & # 87221. Los potenciales Zeta se midieron con un Malvern Nano-ZS (Malvern Instruments, Co., Reino Unido). Se realizaron valoraciones de Boehm 37 para determinar el contenido de grupos carboxilo e hidroxilo en la superficie de RGO. La afinidad vinculante de Pfu La polimerasa con GO y RGO se estudió mediante calorímetros de titulación isotérmicos (NANO ITC TA Instruments) a 25 ° C y 176 ° C. Pfu La polimerasa se tituló con GO y RGO de diferentes contenidos de carboxilo (8,39 & # 37, 7,28 & # 37 y 5,43 & # 37, respectivamente). La cubeta de muestra se llenó con 0.12 & # 956g mL & # 87221 Pfu polimerasa, y la celda de referencia se llenó de agua. En cada experimento, se tomaron con jeringa 50 & # 956L de 100 & # 956 g mL & # 87221 RGO y se añadieron a la celda de muestra en intervalos iguales de 200 segundos. Los cambios de calor se midieron después de cada adición. Datos calorimétricos para grafeno & # 8211Pfu La unión de la polimerasa se analizó utilizando el software NanoAnalyze para NANO ITC.

PCR y electroforesis en gel de agarosa

Se utilizó el plásmido pET-32a como molde de PCR. Los siguientes componentes se mezclaron en la primera ronda de PCR: tampón de PCR 1 & # 215 que contiene Mg 2 & # 43 2 mM, dNTP (cada 0,2 mM), cebador F1 (0,4 y # 956M), cebador R1 (0,4 y # 956M) ( Tabla S1), ADN plasmídico (0,5 ng & # 956L & # 87221) y Pfu polimerasa (0,1 U & # 956L & # 87221). Se agregaron GO o sus derivados con diferentes concentraciones en el sistema de PCR. Cada muestra se preparó hasta el volumen final de 25 & # 956 L con agua. En la segunda ronda de PCR, se estableció la misma condición de reacción, excepto que se usaron 0,5 & # 956L de producto de PCR para sustituir el ADN plasmídico como molde. Las condiciones de la PCR se describen en la Tabla S2.

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Xiamen. Se recolectaron muestras de sangre de voluntarios sanos que dieron su consentimiento informado por escrito. El ADN genómico humano se aisló usando el kit de preparación de plantillas de PCR de alta pureza. Se añadió un total de 20 ng de ADN de & # 956L & # 87221 en lugar de ADN de plásmido. Se utilizaron los cebadores F2 y R2 (Tabla S1) para amplificar un fragmento de ADN mitocondrial humano. Los componentes de la PCR fueron los mismos que los anteriores, excepto que el ADN plasmídico se reemplazó con 2,5 & # 956L de ADN genómico. En la segunda o tercera ronda de PCR, se utilizaron 2,5 & # 956L de producto de la última ronda de PCR como plantilla en lugar de ADN genómico. Las condiciones de la PCR se enumeran en la Tabla S2. Las PCR se realizaron en un termociclador T3 (Biometra, Alemania). Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa 1,5 & # 37 durante 30 minutos, se tiñeron con 0,5 & # 956 g mL & # 87221 EB y se analizaron usando un sistema Gel Doc XR (Bio-Rad, EE.UU.). La intensidad de fluorescencia de la banda del producto de PCR se analizó con el módulo de análisis de densidad óptica del software Image Lab.

Simulación in silico de Pfu interacción polimerasa & # 8211polímero

Se utilizaron simulaciones de dinámica molecular y acoplamiento molecular para estudiar la posible interacción entre los polímeros y Pfu polimerasa. Se utilizaron formas ionizadas de PAA, PAM y pSB en todos los acoplamientos y simulaciones (Figura S1). Las simulaciones de dinámica molecular se realizaron utilizando la Máquina de Groningen para Simulación Química (GROMACS 5.0.4). 38 El campo de fuerza 39 de CHARMM36 se utilizó para la ADN polimerasa y el agua de carga puntual simple como disolvente. Cada polímero y complejo proteico # 8211 se colocó en una caja de simulación (14 & # 21514 & # 21514 nm) y se llenó con disolvente. PAA y PAM tienen cargos netos de & # 872270e y 70e, respectivamente. PEG y pSB son neutrales. Pfu la polimerasa tiene una carga neta de & # 87224e. Se añadieron iones Na & # 43 y Cl & # 8722 para neutralizar las cargas netas del sistema. En cada simulación independiente, el polímero se colocó en una ubicación aleatoria alrededor de la proteína. Antes de la dinámica, la estructura se relajó mediante la minimización de energía utilizando el algoritmo de descenso más empinado. Para equilibrar el sistema, se llevó a cabo una simulación de NVT de 100 ps, ​​seguida de una simulación de NPT de 100 ps. La temperatura del sistema se mantuvo a 345 K (72 & # 176C), que es la temperatura de alargamiento para Pfu polimerasa. Las interacciones electrostáticas se manejaron utilizando el método de Ewald de malla de partículas suave. Todos los enlaces en las moléculas simuladas se limitaron a sus valores de referencia con Linear Constraint Solver. Las energías de Coul de corto alcance se calcularon después de alcanzar el equilibrio.

Para calcular los posibles sitios activos en la ADN polimerasa, Molecular Operating Environment (2012.10) realizó el Site Finder. 40 El propósito de la simulación de acoplamiento es calcular y puntuar las interacciones entre ligandos y Pfu polimerasa utilizando el software AutoDockVina 1.1.2 con sus parámetros de campo de fuerza predeterminados. 41 Cinco simulaciones de atraque independientes, cada una con 10 sitios de Pfu polimerasa para el ensayo, se llevaron a cabo para cada polímero y sistema proteico.

Elaboración y caracterización de GO y sus derivados

La Figura 1 demuestra la preparación de S-GO, L-GO, GO-PAA, GO-PEG, GO-PAM y GO-pSB. GO se sintetizó a partir del grafito natural utilizando el método Hummers modificado. 32,33 S-GO y L-GO se prepararon con tecnología de centrifugación de alta velocidad. Las imágenes AFM mostraron que el tamaño medio de S-GO (50 nm) era mucho más pequeño que el de L-GO (500 nm), mientras que el grosor era & # 1260,9 nm para ambas muestras (Figura S2). El resultado muestra que tanto S-GO como L-GO son láminas monocapa con el mismo grosor. 42 Por tanto, podemos excluir el efecto del grosor de GO sobre la especificidad de la PCR en los últimos experimentos. El injerto de polímero sobre la superficie de GO dio como resultado que el espesor aumentara a 1 & # 82113 nm (Figura S2C & # 8211F). Las valoraciones de Boehm mostraron que la cantidad de grupos carboxilo de S-GO y L-GO eran 9,01 & # 37 y 8,17 & # 37, respectivamente. S-GO tenía más grupos carboxilo debido a una mayor relación superficie-volumen. El potencial zeta de S-GO (& # 872245.1 & # 1770.6 mV) era menor que el de L-GO (& # 872235.6 & # 1770.8 mV), lo que significa que el contenido de grupos carboxilo en S-GO es mayor que eso de L-GO, y el resultado es consistente con los resultados de las titulaciones de Boehm.

Figura 1 Preparación de GO y sus derivados.
Notas: (A) Preparación de S-GO y L-GO. (B) Preparación de cuatro derivados de GO. Las fotografías muestran el color de diferentes GO y derivados de GO en el agua. (C) Fórmulas moleculares de PAA, PAM, PEG y pSB.
Abreviaturas: EDC, hidrocloruro de 1-etil-3- [3-dimetilaminopropil] carbodiimida GO, óxidos de grafeno L-GO, GO PAA grande, ácido poliacrílico PAM, poliacrilamida PEG, polietilenglicol pSB, poli (sulfobetaína) S-GO, pequeño GO.

Se prepararon GO-PAA, GO-PAM y GO-pSB mediante polimerización por radicales libres de monómeros AA, AM y SB en la superficie GO, respectivamente. Por otro lado, mPEG-NH2 se conjugó con los grupos carboxilo en GO mediante la formación de amida catalizada por carbodiimida. Los espectros ultravioleta y # 8211visible (UV y # 8211vis) (Figura S3), los espectros FTIR (Figura S4), los espectros XRD (Figura S5) y los espectros XPS (Figura S6) se utilizaron para caracterizar todas las muestras y se enumeraron en los materiales complementarios. Todas estas caracterizaciones indicaron que PAA, PAM, PEG y pSB se injertaron con éxito en GO. TGA de GO, GO-PAA, GO-PAM, GO-PEG y GO-pSB se muestra en la Figura S7. La TGA de GO con contenido de carboxilo de 8,39 & # 37 exhibe dos regiones de pérdida de masa. La primera pérdida de peso a la temperatura & # 60100 & # 176C se atribuye a la pérdida de agua adsorbida. La segunda pérdida de peso entre 180 ° C y 230 ° C se atribuye a la descomposición de los grupos funcionales que contienen oxígeno, como los grupos carboxilo, epóxido e hidroxilo, en GO. La pérdida de peso de grafeno disminuye al disminuir el contenido de carboxilo (Figura S7A). En comparación con GO, la segunda pérdida de peso de los derivados de GO ocurre a una temperatura más alta, lo que resulta principalmente de la descomposición de la cadena polimérica. Calculando el porcentaje de pérdida de peso, los contenidos calculados de PAA, PAM, PEG y pSB fueron 43,48 & # 37, 40,96 & # 37, 42,53 & # 37 y 38,70 & # 37, respectivamente (Tabla S3). Estos GO modificados con polímero tienen un contenido similar de polímero. Por lo tanto, podemos excluir los efectos del contenido de polímero sobre la especificidad de la PCR en los últimos experimentos.

Los potenciales zeta de GO y RGO eran & # 872239,1 & # 1770,5 mV y & # 872215,6 & # 1770,3 mV, respectivamente, lo que indica que GO era más estable que RGO. Después de injertar polímeros en la superficie de GO, el potencial zeta de GO-PAA (& # 872246,9 & # 1770,9 mV) se volvió más negativo debido a la carga negativa de COO & # 8722 en PAA. El potencial zeta de GO-PAM aumentó a & # 872224.1 & # 1771,2 mV debido al NH cargado positivamente3 & # 43 en PAM. El potencial negativo de GO-PEG (& # 872235.7 & # 1770,8 mV) y GO-pSB (& # 872220.4 & # 1770,9 mV) resultó de los grupos COO & # 8722 en la superficie GO, aunque PEG era un polímero neutro y pSB era un polímero zwiteriónico (Tablas S4 y S5).

El efecto del tamaño de GO en la PCR

Un proceso común de PCR incluye 25 & # 821130 ciclos de cambios de temperatura repetidos. Un ciclo de PCR típico consta de los siguientes tres pasos: 1) desnaturalización del ADN molde, 2) hibridación de dos cebadores sintéticos con el ADN molde y 3) extensión de los cebadores unidos catalizada por una ADN polimerasa termoestable. 5 Aunque la PCR puede multiplicar exponencialmente el gen diana, la amplificación inespecífica sigue siendo un problema. Especialmente en la PCR de múltiples rondas, la plantilla de ADN inicial sin reaccionar y los cebadores perturban la reacción y provocan la acumulación de productos inespecíficos. 43 En los estudios iniciales, utilizamos el plásmido pET-32a como molde de amplificación por PCR. La concentración de plantilla óptima se determinó mediante experimentos de dilución en serie (Figura S8). Se consideró un total de 0,5 ng de plásmido & # 956L & # 87221 como la concentración de plantilla óptima en la primera ronda de PCR, y 0,5 & # 956L del producto de PCR de primera ronda fue la concentración de plantilla óptima en la segunda ronda de PCR. Se investigó el efecto de GO con diferentes tamaños (S-GO y L-GO) en las dos rondas de PCR. En la primera ronda de PCR, la intensidad de la banda diana de 689 pb disminuye al aumentar la concentración de GO, lo que indica que la reacción es inhibida tanto por S-GO como por L-GO a alta concentración (4.8 & # 956g mL & # 87221 para S-GO y 6.4 & # 956g mL & # 87221 para L-GO Figura 2A & # 8211C). En la segunda ronda de PCR, el producto de la primera ronda de PCR se utilizó como molde.Dado que el producto de PCR contiene no solo el producto objetivo, sino también la plantilla de ADN inicial sin reaccionar, los cebadores y los productos inespecíficos, estas sustancias alterarían la PCR de segunda ronda y provocarían la acumulación de productos inespecíficos, lo que produciría bandas de frotis obvias sin GO (Figura 2D y E). Sin embargo, después de agregar S-GO o L-GO, las bandas de frotis desaparecieron. Los productos inespecíficos disminuyeron al aumentar la concentración de S-GO y L-GO. L-GO tuvo un mejor efecto que S-GO, porque tenía un rango de concentración eficiente más amplio para mejorar la especificidad de la PCR (1.6 & # 82113.2 & # 956g mL & # 87221 para S-GO versus 0.8 & # 82114.8 & # 956g mL & # 87221 para L-GO Tabla S6).

Figura 2 Efecto de GO con diferentes tamaños en la primera y segunda ronda de PCR.
Notas: M: marcador de ADN. (A) S-GO en la primera ronda de PCR. (B) L-GO en la primera ronda de PCR. (C) Intensidad de la banda de PCR a diferentes concentraciones de GO en la primera ronda de PCR. (D) S-GO en la segunda ronda de PCR. (mi) L-GO en la segunda ronda de PCR. (F) Intensidad de la banda de PCR a diferentes concentraciones de GO en la segunda ronda de PCR. La concentración de GO en los carriles 1 & # 82117 es 0 & # 956g mL & # 87221, 0.8 & # 956g mL & # 87221, 1.6 & # 956g mL & # 87221, 3.2 & # 956g mL & # 87221, 4.8 & # 956g mL & # 87221, 6.4 & # 956g mL & # 87221 y 8.0 & # 956g mL & # 87221, respectivamente.
Abreviaturas: GO, óxidos de grafeno L-GO, PCR de GO grandes, reacciones en cadena de la polimerasa S-GO, GO pequeño.

Nuestra hipótesis de trabajo para el efecto de concentración de GO observado es la siguiente. Cuando la concentración de GO es baja, la cantidad adsorbida de carga positiva Pfu polimerasa y Mg 2 & # 43 en la superficie GO cargada negativamente fue relativamente alta. Luego, las moléculas cargadas negativamente, como la plantilla de ADN, los cebadores y los dNTP, son atraídas por Pfu polimerasa en la superficie GO. Por tanto, se reduce la probabilidad de emparejamiento incorrecto y se mejora la especificidad de la PCR. Sin embargo, al aumentar aún más la concentración de GO, la cantidad de GO cargada negativamente aumenta en el sistema de PCR, por lo que la cantidad adsorbida de GO cargada positivamente Pfu disminuye la polimerasa y el Mg 2 & # 43 en una sola superficie GO. Además, el exceso de cargas negativas de GO repelerá los cebadores cargados negativamente y los dNTP, lo que conducirá a la supresión de la PCR. Medimos los potenciales zeta de GO y su mezcla con Pfu polimerasa en agua (Tabla S4). El potencial zeta de S-GO aumentó de & # 872245.1 & # 1770.6 mV a & # 872233.2 & # 1770.9 mV, mientras que el potencial zeta de L-GO aumentó de & # 872235.6 & # 1770.8 mV a & # 872229.8 & # 1771.1 mV , lo que confirma una interacción electrostática más fuerte entre S-GO y Pfu polimerasa que la de L-GO y Pfu polimerasa. Se obtiene una tendencia similar en el tampón de PCR (Tabla S5). El resultado se atribuye a un mayor contenido de grupos carboxilo cargados negativamente en S-GO (9.01 & # 37) que el de L-GO (8.17 & # 37). Por lo tanto, S-GO inhibe la PCR a una concentración más baja (1,6 & # 956g mL & # 87221) que L-GO (6,4 & # 956g mL & # 87221) y L-GO tiene un rango de concentración más amplio para mejorar la especificidad de la PCR. .

El efecto del grado de reducción de GO en la PCR

Preparamos RGO usando hidracina como reductor en amoníaco. Las valoraciones de Boehm y TGA (Figura S7A) mostraron que el contenido de carboxilo se redujo de 8,39% 37 a 5,43% 37 después de la reducción. Los potenciales zeta se incrementaron de & # 872239,1 & # 1770,5 mV a & # 872215,6 & # 1770,3 mV después de la reducción. En la PCR de primera ronda, la intensidad de las bandas disminuyó al aumentar las concentraciones de GO y RGO (Figura 3A y # 8211D). Al mismo tiempo, el efecto de inhibición disminuyó al reducir el contenido de grupos carboxilo en GO. En la segunda ronda de PCR, aparecieron bandas de frotis obvias y disminuyeron al aumentar las concentraciones de GO y RGO. El rango de concentración eficiente para una especificidad óptima de PCR de GO (8.39 & # 37), RGO (7.28 & # 37) y RGO (5.43 & # 37) es 0.8 & # 82113.2 & # 956g mL & # 87221, 3.2 & # 82114.8 & # 956g mL & # 87221 y 0.8 & # 82116.4 & # 956g mL & # 87221, respectivamente. La especificidad de la PCR aumenta y el efecto de inhibición de la PCR disminuye al disminuir el contenido de carboxilo en GO, lo que demuestra que los grupos carboxilo en GO tienen un efecto significativo en la PCR. RGO tiene menos cargas negativas que GO, lo que resulta en menos repulsión electrostática con los componentes de PCR cargados negativamente. Además, una interacción de apilamiento más fuerte entre las estructuras de anillo de las nucleobases y la estructura de hidrocarburos poliaromáticos de RGO conduce a una mayor afinidad de RGO con las cadenas de ADN que la de GO con el ADN. RGO tiene una celosía hexagonal más perfecta que GO, por lo tanto, tiene interacciones hidrofóbicas y de apilamiento más fuertes con Pfu polimerasa que GO con Pfu polimerasa. los Pfu La polimerasa está compuesta por 775 aminoácidos, entre ellos 26 fenilalaninas, 47 tirosinas y 11 triptófanos, que todas estas moléculas contienen anillos de benceno. Los ricos bencenos apolares de estos aminoácidos aromáticos pueden unirse fuertemente a la hoja de grafeno a través de la interacción & # 960 & # 8211 & # 960. 44 Por lo tanto, RGO es superior a GO para mejorar la especificidad de la PCR debido a una menor repulsión electrostática con los componentes de la PCR cargados negativamente y una mayor afinidad con la plantilla de ADN y Pfu polimerasa. La absorción electrostática entre cargados positivamente Pfu polimerasa y RGO es más pequeño que entre Pfu polimerasa y GO con cargas más negativas, y la interacción hidrofóbica es la fuerza impulsora para la adsorción de enzimas en RGO. 45 Por lo tanto, RGO tiene una afinidad más fuerte con Pfu polimerasa que GO. Esta conclusión fue apoyada además por el análisis de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) (Tabla S7 y Figura S9). Las constantes de disociación (KD) para grafeno & # 8211Pfu La interacción de la polimerasa fue 12,3 mol & # 87225, 10,5 mol & # 87225 y 3,96 mol & # 87225 para GO (8,39 & # 37 carboxilo), RGO (7,28 & # 37 carboxilo) y RGO (5,43 & # 37 carboxilo), respectivamente. Los valores negativos del cambio de energía libre de Gibbs (& # 916GRAMO) confirmó la unión espontánea del grafeno con Pfu polimerasa. 46,47 Cuanto más RGO (5.43 & # 37) tuvo el menor KD y más negativo & # 916GRAMO valores, lo que indica una mayor afinidad entre RGO y Pfu polimerasa que entre GO y Pfu polimerasa.

figura 3 Efecto del grado de reducción de GO sobre la PCR.
Notas: (A) GO (8.93 & # 37) en la primera ronda de PCR. (B) RGO (7.28 & # 37) en la primera ronda de PCR. (C) RGO (5.43 & # 37) en la primera ronda de PCR. (D) Intensidad de la banda de PCR a diferentes concentraciones de GO y RGO en la primera ronda de PCR. (mi) GO (8.93 & # 37) en la segunda ronda de PCR. (F) RGO (7.28 & # 37) en la segunda ronda de PCR. (GRAMO) RGO (5.43 & # 37) en la segunda ronda de PCR. (H) Intensidad de la banda de PCR a diferentes concentraciones de GO y RGO en la segunda ronda de PCR. M: marcador de ADN. Los porcentajes indican el contenido de grupos carboxilo determinado por titulación de TGA y Boehm en GO y RGO. La concentración de GO y RGO en los carriles 1 & # 82117 es 0 & # 956g mL & # 87221, 0.8 & # 956g mL & # 87221, 1.6 & # 956g mL & # 87221, 3.2 & # 956g mL & # 87221, 4.8 & # 956g mL & # 87221, 6.4 & # 956g mL & # 87221 y 8.0 & # 956g mL & # 87221, respectivamente.
Abreviaturas: GO, óxido de grafeno RGO, PCR de óxido de grafeno reducido, reacción en cadena de la polimerasa TGA, análisis termogravimétrico.

El efecto de la modificación de la superficie de GO en la PCR

Para investigar más a fondo el efecto de la modificación de la superficie de GO sobre la especificidad de la PCR, modificamos GO con PAA cargado negativamente, PAM cargado positivamente, PEG neutro y pSB de ion híbrido. En la primera ronda de PCR, no se encontraron bandas de frotis para todas las muestras, lo que indica una buena especificidad de la PCR (Figura 4A y # 8211E). En la segunda ronda de PCR, apareció un frotis inespecífico en los experimentos de control sin aditivos, pero los frotis disminuyeron al aumentar las concentraciones de derivados de GO, lo que indica que la especificidad de la PCR aumenta en todos los sistemas de PCR asistidos por derivados de GO. En comparación con GO-PAA, GO-PAM y GO-PEG, GO-pSB tiene bandas de frotis menores (Figura 4F y # 8211J) y un rango de concentración eficiente más amplio (9.6 & # 821124.0 & # 956g mL & # 87221 Tabla S6), lo que indica que GO-pSB tiene un mejor rendimiento para mejorar la especificidad de la PCR que otros GO modificados con polímeros. La capacidad de mejorar la especificidad de la PCR aumenta en el siguiente orden: GO-PAA & # 60 GO-PAM & # 60 GO-PEG & # 60 GO-pSB. Los resultados indican que GO-pSB es superior a otros GO modificados con polímeros para mejorar la especificidad de la PCR. La Tabla S6 compara el rango de concentración eficiente para la especificidad óptima de PCR de GO, RGO, GO modificados con polímero y cuatro polímeros de acuerdo con los resultados de la segunda ronda de PCR. Comparado con RGO, GO-pSB tiene una solubilidad mucho mejor. Mientras tanto, también tiene un rango de concentración eficiente mucho más amplio que GO y RGO.

Figura 4 Efecto de los derivados de GO en las PCR de primera y segunda ronda.
Notas: M: marcador de ADN. La concentración de derivado de GO en los carriles 1 y # 82118 en (A), (B), (F) y (GRAMO) es 0 & # 956g mL & # 87221, 0.8 & # 956g mL & # 87221, 1.6 & # 956g mL & # 87221, 3.2 & # 956g mL & # 87221, 4.8 & # 956g mL & # 87221, 6.4 & # 956g mL & # 87221, 8.0 & # 956g mL & # 87221 y 9.6 & # 956g mL & # 87221, respectivamente. La concentración de derivado de GO en los carriles 1 y # 82116 en (C), (D), (H) y (I), es 0 & # 956g mL & # 87221, 4.8 & # 956g mL & # 87221, 9,6 & # 956g mL & # 87221, 14,4 & # 956g mL & # 87221, 19,2 & # 956g mL & # 87221 y 24,0 & # 956g mL y # 87221, respectivamente. Los contenidos de PAA, PAM, PEG y pSB en derivados de GO son 43,48 & # 37, 40,96 & # 37, 42,53 & # 37 y 38,70 & # 37, respectivamente. (mi) Intensidad de la banda de PCR a diferentes concentraciones de derivados de GO en la 1ª ronda de PCR. (J) Intensidad de la banda de PCR a diferentes concentraciones de derivados de GO en la segunda ronda de PCR.
Abreviaturas: GO, óxido de grafeno PAA, ácido poliacrílico PAM, PCR de poliacrilamida, reacciones en cadena de la polimerasa PEG, polietilenglicol pSB, poli (sulfobetaína).

Para confirmar que la mejora de la especificidad de la PCR resulta de los GO modificados con polímero y no de los polímeros, investigamos el efecto de los polímeros desnudos sobre la especificidad de la PCR sin GO. Las cantidades calculadas de polímeros de acuerdo con los datos de TGA de los derivados de GO se agregaron al sistema de PCR. Los resultados muestran que no hay cambios en la banda (Figura S10). Sólo cuando la concentración de polímero se incrementó & # 621.000 veces de microgramos por mililitro a miligramos por mililitro, se pudo mejorar la especificidad de la PCR (Figura S11). Estos resultados indican que la mejora de la especificidad de la PCR resulta del GO modificado con polímero y no de los polímeros desnudos. Según los resultados anteriores, GO no es un buen potenciador de la especificidad de la PCR. Por tanto, la potenciación de la especificidad de la PCR mediante el derivado de GO se atribuye a la combinación o al efecto sinérgico de GO y los polímeros.

La Figura 5 muestra que a altas concentraciones de GO o derivados de GO, se inhiben las bandas de control (carril 1). Para probar si Pfu la polimerasa se está adsorbiendo sobre las superficies de GO y sus derivados, se añadió BSA al sistema de PCR inhibido por el exceso de derivados de GO y GO. Después de la adición de BSA, se recuperan todas las PCR y las intensidades de la banda aumentan al aumentar la concentración de BSA. El resultado se atribuye a la adsorción competitiva de BSA en la superficie de GO y sus derivados. Por lo tanto, el adsorbido Pfu se liberó polimerasa en la solución, lo que resultó en la recuperación de la PCR. Los resultados indican que existe una fuerte interacción entre los derivados GO o GO y Pfu polimerasa. También incubamos GO y sus derivados con Pfu polimerasa durante 1 hora en hielo para permitir una absorbancia suficiente de Pfu polimerasa con GO o sus derivados. Luego agregamos otros componentes de PCR y realizamos PCR. La Figura S12 confirma una PCR eficiente después de la adsorción de Pfu polimerasa en GO o sus derivados.

Figura 5 Efecto de BSA sobre PCR inhibida por GO y sus derivados.
Notas: M: marcador de ADN. (A) GO (9.6 y # 956g mL y # 87221), (B) GO-PAA (4.8 & # 956g mL & # 87221), (C) GO-PAM (8.0 y # 956 g mL y # 87221). (D) GO-PEG (24.0 & # 956g mL & # 87221) y (mi) GO-pSB (24.0 & # 956g mL & # 87221). La concentración de BSA en los carriles 1 & # 82114 es 0 & # 956g mL & # 87221, 2,0 & # 956g mL & # 87221, 20,0 & # 956g mL & # 87221 y 200,0 & # 956g mL & # 87221, respectivamente.
Abreviaturas: BSA, albúmina de suero bovino GO, óxido de grafeno PAA, ácido poliacrílico PAM, poliacrilamida PCR, reacción en cadena de la polimerasa PEG, polietilenglicol pSB, poli (sulfobetaína).

La PCR se inhibió cuando la concentración de derivado de GO se incrementó aún más (Figura 4). Cada hoja GO puede adsorber cargada positivamente Pfu polimerasa o Mg 2 & # 43 debido a su gran área superficial y muchos grupos carboxilo cargados negativamente. El aumento de la concentración de derivado de GO disminuirá la cantidad de adsorción de Pfu polimerasa y Mg 2 & # 43 en una sola hoja GO, lo que resulta en una menor eficiencia de la PCR. Cuando se agrega un exceso de Mg 2 & # 43 en el sistema de PCR, más Mg 2 & # 43 se adsorberá más en los derivados de GO cargados negativamente con Pfu polimerasa para recuperar la PCR. La Figura 6 muestra que las bandas inhibidas se recuperan después de la adición de 1 & # 82112 mM Mg 2 & # 43. Por lo tanto, los resultados indican además que la PCR se inhibirá si el Pfu polimerasa y Mg 2 & # 43 adsorbidos en una disminución del derivado simple de GO.

Figura 6 Efecto de la concentración de Mg 2 & # 43 sobre la PCR asistida por GO y sus derivados.
Notas: M: marcador de ADN. (A) VAYA (9,6 y # 956 g mL y # 87221). (B) GO-PAA (4.8 & # 956g mL & # 87221). (C) GO-PAM (8.0 y # 956 g mL y # 87221). (D) GO-PEG (24.0 & # 956g mL & # 87221). (mi) GO-pSB (24.0 & # 956g mL & # 87221). La concentración de Mg 2 & # 43 añadido en las pistas 1 & # 82114 es 0 mM, 0,4 mM, 1,0 mM y 2,0 mM, respectivamente (no se incluyó el Mg 2 & # 43 2 mM original).
Abreviaturas: GO, óxido de grafeno PAA, ácido poliacrílico PAM, poliacrilamida PCR, reacción en cadena de la polimerasa PEG, polietilenglicol pSB, poli (sulfobetaína).

Pfu La polimerasa posee una actividad de corrección de pruebas y se puede utilizar en lugar de Taq polimerasa para realizar una mayor fidelidad de la síntesis de ADN. Para confirmar si GO o sus derivados afectarían la fidelidad de la PCR, se secuenciaron todos los productos de PCR en ausencia o presencia de GO y sus derivados. Los datos confirman que GO y sus derivados no tienen ningún efecto sobre la fidelidad de Pfu polimerasa (Figura S13). Los resultados indican además que la especificidad de la PCR se mejora y la fidelidad de Pfu la polimerasa está garantizada en presencia de derivados de GO.

La aplicación en muestras clínicas.

Finalmente, los derivados de GO también se utilizaron para mejorar la especificidad de la PCR para amplificar las complicadas muestras clínicas. Se utilizó ADN genómico de sangre humana como molde. Se amplificó un fragmento de 324 pb del ADN mitocondrial. En las PCR de primera y segunda ronda, no se observan bandas de frotis para todas las muestras, pero la banda objetivo es más débil para la PCR de segunda ronda sin derivado de GO que la de la muestra con derivados de GO (Figura 7). En la PCR de tercera ronda, hay una banda de frotis fuerte para la PCR sin derivado de GO y la banda objetivo se vuelve insignificante. Sin embargo, las bandas objetivo siguen siendo notables con productos poco específicos en presencia de derivados de GO. Por lo tanto, los derivados de GO mejoran la especificidad de la PCR para amplificar las complicadas muestras clínicas. Los resultados indican que los derivados de GO pueden tener aplicaciones potenciales en el diagnóstico molecular clínico.

Figura 7 La aplicación de derivados de GO para amplificar muestras clínicas.
Notas: La plantilla es ADN mitocondrial de ADN genómico de sangre humana obtenido de muestras clínicas. M: marcador de ADN 1: PCR de primera ronda 2: PCR de segunda ronda 3: PCR de tercera ronda C: experimentos de control sin derivados de GO. Las concentraciones de GO-PAA, GO-PAM, GO-PEG y GO-pSB son 0,6 & # 956g mL & # 87221, 2,4 & # 956g mL & # 87221, 4,8 & # 956g mL & # 87221 y 19,2 & # 956g mL y # 87221, respectivamente.
Abreviaturas: GO, óxido de grafeno PAA, ácido poliacrílico PAM, poliacrilamida PCR, reacción en cadena de la polimerasa PEG, polietilenglicol pSB, poli (sulfobetaína).

Simulación de la interacción entre polimerasa y polímero.

Es muy difícil simular directamente la interacción entre la polimerasa y la GO modificada con polímero. Por lo tanto, la simulación de dinámica molecular y el acoplamiento molecular se utilizaron para estudiar la posible interacción entre el polímero y Pfu polimerasa cuando GO se descuidó por simplificación. Pfu polimerasa contiene los siguientes cinco dominios: el N-terminal (residuos 1 & # 8211130 y 327 & # 8211368), exonucleasa (131 & # 8211326), palma (369 & # 8211450 y 501 & # 8211588), dedos (451 & # 8211500) y dominios del pulgar ( 589 & # 8211775) (Figura S14). El mecanismo de corrección de pruebas y polimerización se coordina a partir de las interacciones entre el bucle (144 & # 8211158) del dominio de exonucleasa y el borde cargado positivamente del dominio del pulgar. 48 El acoplamiento molecular mostró que los sitios de unión de los polímeros se ubicaron en el dominio de exonucleasa, pulgar, palma y dedos mediante cálculos de acoplamiento (Figura S14). Las afinidades de unión disminuyeron en el siguiente orden: PAA & # 62 PAM & # 62 PEG & # 62 pSB (Tabla S8). Las energías de Coul de corto alcance fluctuaron ampliamente en el transcurso del equilibrio de 10 ns, alcanzando valores estables después de & # 1264 ns (Figura S15A y B). El análisis de energía de Coul Short Range indica que existe una fuerte interacción electrostática entre PAA y Pfu (& # 87222,248 & # 177203 kJ mol & # 87221). La energía Coul de corto alcance de Pfu-PAM es & # 8722959 & # 177107 kJ mol & # 87221, mientras que PEG y pSB casi no tienen interacción electrostática con Pfu (Tabla S9). Este orden es consistente con los resultados de la PCR (Figura S11). El área de superficie accesible al solvente (SASA) es el área de superficie de una biomolécula que es accesible a un solvente. SASA partir de Pfu-PEG y Pfu-pSB son casi equivalentes en 10 ns (Figura S15C), lo que indica que PEG y pSB tienen una influencia similar sobre la unión de la enzima y el sustrato. La distancia mínima de PEG y Pfu fluctúa en un amplio rango, lo que indica una mayor flexibilidad de PEG que pSB (Figura S15D).La distribución acumulativa de disolvente muestra que el área del dipolo de la molécula de disolvente alrededor de PEG es mucho mayor que la de pSB (Figura S15E y F), lo que indica que PEG y pSB afectan al disolvente y la proteína en diferentes niveles. Las simulaciones de dinámica molecular mostraron que el Pfu& # 8211PAA complex (PAA: la franja marrón debajo Pfu) tuvo la interacción más fuerte seguida de Pfu& # 8211PAM complex (PAM: la franja azul debajo Pfu) (Figura 8A y B). La interacción sería interacciones electrostáticas e hidrofóbicas y la fuerza de van der Waals & # 8217. Obviamente, no existe una interacción directa entre Pfu polimerasa y PEG, y Pfu polimerasa y pSB (Figura 8C y D). Estos resultados son consistentes con el análisis de energía de Coul Short Range. Los resultados de la simulación de dinámica molecular y el acoplamiento molecular son razonables porque el PEG puede reducir la adsorción de proteínas, 49 y el polímero de iones híbridos tiene una mejor capacidad para reducir la adsorción de proteínas que el PEG. 50 Afinidades de unión de polímeros con Pfu polimerasa (Tabla S8) también apoyan el resultado.

Figura 8 Simulaciones MD de la interacción de Pfu polimerasa con PAA (A), PAM (B), PEG (C) y pSB (D).
Abreviaturas: MD, dinámica molecular PAA, ácido poliacrílico PAM, poliacrilamida PEG, polietilenglicol pSB, poli (sulfobetaína).

Además de la interacción entre Pfu polimerasa y polímero, GO cargados negativamente y cargados positivamente Pfu La polimerasa también tiene fuertes interacciones electrostáticas, hidrófobas y de apilamiento & # 960 & # 8211 & # 960. PEG y pSB disminuirán estas interacciones debido a la reducción de la adsorción de Pfu polimerasa. Por tanto, GO-PEG y GO-pSB no inhiben la PCR en un rango de concentración más amplio que GO-PAA y GO-PAM, lo cual es consistente con los resultados experimentales (Figura 4). Una pequeña cantidad de carga positiva Pfu la polimerasa todavía es adsorbida por GO cargado negativamente en GO-PEG y GO-pSB, aunque PEG y pSB reducirán su adsorción. Por tanto, la especificidad de la PCR también se ve reforzada por la PCR asistida por derivado de GO. Por lo tanto, estos resultados confirman además que estos derivados de GO pueden mejorar la especificidad de la PCR.

Investigamos el efecto de GO con diferentes tamaños, grados de reducción y modificaciones de superficie sobre la especificidad de la PCR. Los resultados indican que L-GO y RGO son superiores a S-GO y no RGO en la mejora de la especificidad de la PCR. Para los derivados de GO, la capacidad de potenciar la especificidad de la PCR aumenta en el siguiente orden: GO-PAA & # 60 GO-PAM & # 60 GO-PEG & # 60 GO-pSB. Nuestro estudio demuestra que tanto GO como sus propiedades superficiales afectan la especificidad de la PCR. Los derivados de GO pueden usarse como aditivos eficaces para mejorar la especificidad de la PCR en el diagnóstico molecular clínico.

Este estudio está respaldado por el Proyecto Nacional de Investigación Básica 973 (2014CB932004) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de la República Popular de China # 8217 (31371005, 81571764 y 81171453). Agradecemos al profesor Zhiliang Ji del Laboratorio Estatal Clave de Biología del Estrés Celular, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Xiamen, por su sugerencia en la simulación. Agradecemos al doctor Yoav Peleg del Instituto de Ciencias Weizmann, Israel, por su amable consejo y revisión del lenguaje. También agradecemos al profesor Chuanliu Wu y a su estudiante de doctorado Yaqi Chen por su amable ayuda con todas las mediciones del ITC.

Todos los autores contribuyeron al análisis de datos, redacción y revisión crítica del documento y acuerdan ser responsables de todos los aspectos del trabajo.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses en este trabajo.

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Contenido

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de biología molecular utilizada para amplificar segmentos de ADN específicos en varios órdenes de magnitud. Los segmentos específicos de ADN se amplifican mediante tres procesos, desnaturalización, hibridación y extensión, donde las hebras de ADN se separan elevando la temperatura a la temperatura óptima desde la temperatura ambiente antes de que los cebadores se unan y la polimerasa alinee los nucleótidos con la hebra molde. Utiliza ADN polimerasa, que es ligeramente activa a bajas temperaturas. [1] En la PCR convencional, la mezcla de reacción se completa a temperatura ambiente y, debido a la actividad de la ADN polimerasa, los cebadores pueden formar dímeros de cebadores o aparearse con el ADN de manera no específica. Durante el procedimiento de PCR, la ADN polimerasa extenderá cualquier fragmento de ADN con cebadores unidos, generando productos diana pero también productos inespecíficos que reducen el rendimiento. En la PCR de inicio en caliente, algunos de los reactivos se mantienen separados hasta que la mezcla se calienta a la temperatura de hibridación específica. Esto reduce el tiempo de hibridación, lo que a su vez reduce la probabilidad de extensión inespecífica del ADN y la influencia de la unión del cebador inespecífico antes de la desnaturalización. [sesenta y cinco]

En la PCR convencional, temperaturas más bajas por debajo de la temperatura de hibridación óptima (50-65 ° C) dan como resultado modificaciones fuera del objetivo tales como amplificaciones no específicas en las que los cebadores se unirán de forma no específica al ácido nucleico. [5] Estos complejos de cebadores no específicos, que están en exceso en la mezcla, son la causa detrás de la síntesis de subproductos como el dímero de cebadores y el cebado incorrecto. [10] El cebado incorrecto impide y reduce en gran medida la eficiencia de la amplificación por PCR al competir activamente con las secuencias diana para la amplificación. De manera similar, los dímeros de los cebadores forman complejos que disminuyen la cantidad de amplificaciones del número de copias obtenidas. [10] Esto se puede controlar mediante la implementación de PCR de inicio en caliente que permite bloquear las extensiones de cebadores hasta que se alcancen las temperaturas óptimas. [2]

En la PCR de inicio en caliente, se evita que los reactivos importantes (como la ADN polimerasa y los cofactores de magnesio) reaccionen en la mezcla de PCR hasta que se alcancen las temperaturas óptimas mediante la separación física o modificaciones químicas. [5] [2] La PCR de inicio en caliente también puede ocurrir cuando la polimerasa Taq se inhibe / inactiva o su adición se retrasa hasta las temperaturas óptimas de hibridación, mediante modificaciones de desoxirribonucleótido trifosfato o modificando los cebadores mediante manipulación de estructuras secundarias y enjauladas.

La PCR de inicio en caliente es a menudo un enfoque mejor que la PCR tradicional en circunstancias en las que hay una falta de ADN en la mezcla de reacción (& gt10 4 copias), la plantilla de ADN es muy compleja o si hay varios pares de cebadores de oligonucleótidos en la PCR. [3]

La PCR de inicio en caliente es un método que evita la extensión de la ADN polimerasa a temperaturas más bajas para evitar la unión no específica y minimizar la pérdida de rendimiento. La PCR de inicio en caliente reduce la cantidad de unión no específica a través de reactivos limitadores hasta los pasos de calentamiento de la PCR: limite la reacción temprano al limitar la polimerasa de ADN Taq en una reacción. La unión no específica a menudo conduce a dímeros de cebadores y dianas cebadas incorrectamente / cebadas falsamente. [11] Estos pueden rectificarse mediante métodos modificados como:

Inactivación / inhibición de la ADN polimerasa Taq Editar

Anticuerpos ligados a enzimas / ADN polimerasa Taq complejados con anticuerpos anti ADN polimerasa Taq:

Los anticuerpos ligados a enzimas inactivan la ADN polimerasa Taq. Los anticuerpos se unen y se unen a la polimerasa, evitando la amplificación temprana del ADN que podría ocurrir a temperaturas más bajas. Una vez que se alcanza la temperatura de hibridación óptima, los anticuerpos comenzarán a degradarse y disociarse, liberando la ADN polimerasa Taq en la reacción y permitiendo que comience el proceso de amplificación. [2] [12] ADN polimerasa Platinum Taq y ADN polimerasa AccuStart Taq (ambas desarrolladas por Ayoub Rashtchian en Life Technologies y Quanta BioSciences, respectivamente) son ejemplos de ADN polimerasas Taq de inicio en caliente basadas en anticuerpos disponibles comercialmente. Estas ADN polimerasa Taq están precomplejadas con una mezcla de anticuerpos monoclonales específicos para la ADN polimerasa Taq. [13]

Se crea una barrera física entre la ADN polimerasa Taq y el resto de los componentes de la PCR mediante las perlas de cera que dependen de la temperatura. Una vez que la temperatura sube por encima de los 70 ° C, durante el paso de desnaturalización en el primer ciclo, la perla de cera se derrite, lo que permite que la ADN polimerasa Taq escape más allá de la barrera y se libere en la reacción, iniciando el proceso de amplificación. La capa de cera luego se mueve a la parte superior de la mezcla de reacción durante la etapa de amplificación para actuar luego como una barrera de vapor. [2]

Oligonucleótidos altamente específicos:

Los oligonucleótidos son polímeros cortos de ácido nucleico que se unen fácilmente. Los oligonucleótidos altamente específicos, como los aptámeros, se unen a la ADN polimerasa Taq a temperaturas más bajas, lo que la hace inactiva en la mezcla. Solo a temperaturas más altas, los oligonucleótidos se separarán del Taq, lo que le permitirá reaccionar. [5]

Estos son los métodos más efectivos para la PCR de inicio en caliente, los anticuerpos ligados a enzimas y los métodos de oligonucleótidos altamente específicos en particular son los más adecuados durante los procedimientos que requieren un tiempo de inactivación más corto. [14] Sin embargo, se sabe que se implementan otros métodos como:

Adición tardía de la ADN polimerasa Taq Editar

La máquina de PCR se calienta de antemano mientras los componentes se mezclan con hielo y luego se colocan inmediatamente en la máquina de PCR una vez que alcanza la temperatura óptima. Esto eliminaría el proceso de calentamiento requerido, reduciría el recocido inespecífico de las imprimaciones y aseguraría que se separe cualquier imprimación emparejada que falte en la mezcla. [15]

La congelación actúa como una forma de separación física al igual que las perlas de cera. La mezcla de reacción que contiene los cebadores, la hebra molde, agua y trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTP) se congela antes de la polimerasa Taq y los componentes de PCR restantes se añaden encima de la mezcla congelada. Esto actúa para prevenir la unión no específica. [15]

Los componentes de la PCR en la mezcla de reacción se preparan y calientan sin la adición de Taq. Taq solo se introduce más tarde en la mezcla una vez que se alcanza la temperatura óptima. Sin embargo, este método es el menos fiable y puede provocar una contaminación de los componentes. [15]

Otro método es mediante PCR de inicio en caliente mediada por trifosfato de desoxirribonucleótido que modifica las bases de nucleótidos a través de un grupo protector.

Modificaciones de desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP) Editar

El dNTP de inicio en caliente se puede modificar químicamente para incluir un grupo protector sensible al calor en el extremo 3 principal. Esta modificación evitará que los nucleótidos interaccionen con la polimerasa Taq para unirse a la hebra molde hasta que se alcancen las temperaturas óptimas, por lo tanto, el grupo protector se eliminará durante la etapa de activación por calor. Los dNTP, dA, dT, dC y dG de arranque en caliente reemplazan a los nucleótidos naturales. [16] [17] Se recomienda usar los cuatro nucleótidos modificados; sin embargo, investigaciones anteriores muestran que reemplazar uno o dos de los nucleótidos naturales con los dNTP modificados sería suficiente para garantizar que no se produzca una amplificación no específica. [16] [17] Otra modificación química del ácido nucleico es a través de la modificación covalente reversible por calor que actúa para impedir la hibridación de los cebadores con la plantilla de interés. El grupo amino de la guanosina interactúa con el glioxal para formar dG. [18]

Imprimaciones modificadas Editar

Cierta estructura secundaria puede impedir las funciones de los cebadores. Por ejemplo, los oligonucleótidos con estructura de horquilla no pueden actuar eficazmente como cebadores. Sin embargo, después de calentar la mezcla de reacción a la temperatura de hibridación, el cebador experimentará un cambio de conformación que permitirá que el cebador forme una estructura lineal en su lugar, lo que permite que el cebador se una al segmento objetivo y comience la PCR. [19] [20]

Jaulas extraíbles fotoquímicamente:

Un grupo enjaulado que es un grupo protector que se puede eliminar fotoquímicamente, como las fosforamiditas de timidina enjauladas, se incorpora a un cebador oligonucleotídico. Esto permite activar y desactivar la función de la imprimación mediante el uso de irradiación UV (365 nm). Por lo tanto, los cebadores se pueden activar después de que se alcanza la temperatura de recocido. [21]

Adición controlada de magnesio Editar

El magnesio es necesario en la PCR y actúa como cofactor porque la polimerasa Taq depende del magnesio. [22] El aumento de la concentración de magnesio y fosfato a los reactivos tampón estándar crea un precipitado de magnesio, proporcionando un inicio en caliente para la reacción ya que no hay magnesio para la ADN polimerasa hasta durante la etapa de ciclo térmico. Durante el ciclo térmico, el magnesio se disolverá nuevamente en solución y estará disponible para que la polimerasa lo use, lo que le permitirá funcionar normalmente. [23]

La PCR de inicio en caliente tiene la ventaja de que requiere menos manipulación y reduce el riesgo de contaminación. La PCR de inicio en caliente puede modificarse químicamente o basarse en anticuerpos, lo que proporciona diferentes ventajas al procedimiento. En la PCR de inicio en caliente químicamente modificada, el procedimiento se puede llevar a cabo a temperatura ambiente y disminuye significativamente la formación de dímeros de cebadores al evitar que los cebadores se unan entre sí antes de que haya comenzado el proceso de PCR, así como al limitar el cebado no específico. De manera similar, la PCR de inicio en caliente inhibe la unión de los cebadores a las secuencias molde que tienen una baja homología que conduce a un cebado incorrecto. También puede mejorar la especificidad y la sensibilidad, debido a las estrictas condiciones, así como aumentar el rendimiento del producto del fragmento objetivo. [5] En la PCR de inicio en caliente basada en anticuerpos, la polimerasa se activa después del paso de desnaturalización inicial durante el proceso de ciclado, lo que reduce el tiempo requerido. Esto también conduce a una alta especificidad. [14]

Junto con sus ventajas, la PCR de inicio en caliente también tiene limitaciones que deben considerarse antes de implementar el método. La PCR de inicio en caliente requiere la adición de calor durante períodos de tiempo más largos en comparación con la PCR convencional, por lo tanto, el ADN molde es más susceptible a sufrir daños. El aumento del tiempo de calentamiento también significa que el procedimiento no es compatible con ciertos procedimientos, como el método de PCR de transcripción inversa de un solo tubo y tampón único, que requiere una temperatura más baja para someterse al paso de transcripción inversa. [12] En la PCR de inicio en caliente modificada químicamente, el proceso de amplificación del ADN puede verse afectado negativamente, en primer lugar debido a un aumento significativo en el tiempo de reactivación requerido para que la polimerasa se active y, en segundo lugar, si la longitud de la plantilla de ADN diana es demasiado larga. [14] En los procedimientos basados ​​en anticuerpos, cada enzima requiere un anticuerpo diferente y, por lo tanto, el costo de realizar el procedimiento es mayor [15]


Tabla de selección de ADN polimerasa

La siguiente tabla enumera las propiedades que deben tenerse en cuenta al elegir una polimerasa. Dado que estas propiedades pueden depender de las condiciones de reacción, se deben consultar las referencias principales antes de su uso en una aplicación determinada.

Polimerasas de PCR Exonucleasa 3 & prime & ndash & gt5 & prime Fidelidad 5 & ​​prime & ndash & gt3 & prime exonucleasa Desplazamiento de hebra Traducción de Nick Extender el cebador de ARN Extensión de Nick Tolerancia dU Extremos resultantes Formatos populares disponibles Aplicaciones
PCR de alta fidelidad
ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 & reg ++++ 280x Taq No _ No No No No Desafilado ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 & reg PCR de ultra alta fidelidad, PCR de largo alcance, clonación de material in vitro para expresión de proteínas o análisis de genes, análisis de SNP mediante clonación y secuenciación, mutagénesis dirigida al sitio
ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 & reg Hot Start
Mezcla maestra 2x de ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 & reg
Q5 & reg Mezcla maestra 2x de ADN polimerasa de inicio en caliente de alta fidelidad
NEBNext & reg Ultra & trade II Q5 & reg Master Mix Preparación de la biblioteca NGS
ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U & reg Hot Start ++++ No _ No No No Desafilado ADN polimerasa de alta fidelidad Q5U & reg Hot Start Clonación del USUARIO, amplificación de alta fidelidad de sustratos de ADN convertidos o desaminados con bisulfito, prevención de arrastre
Mezcla maestra NEBNext Q5U y reg
ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion & reg * ++++ 39 b -50x c Taq No _ No No No No Desafilado Phusion & reg ADN polimerasa de alta fidelidad PCR de alta fidelidad, clonación
Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion & reg con tampón de HF
Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion & reg con tampón GC
Phusion & reg Hot Start Flex ADN polimerasa
Mezcla maestra de Phusion & reg Hot Start Flex 2X
PCR de rutina
UnoTaq & reg ADN polimerasa ++ 2x _ j No 3'A / Blunt UnoTaq & reg ADN polimerasa PCR de rutina, PCR de colonias, detección de genotipos
UnoTaq & reg ADN polimerasa de inicio en caliente
UnoTaq & reg y unoTaq & reg Hot Start 2x Mezclas maestras
UnoTaq & reg ADN polimerasa de carga rápida
UnoTaq & reg Mezcla maestra de carga rápida y reg 2X
Taq ADN polimerasa _ 1x _ j No 3'A TaqADN polimerasa con tampón Thermopol PCR de rutina
Arranque en caliente TaqADN polimerasa
Taq y Hot Start Taq Mezcla maestra 2X
Carga rápida Taq Mezcla maestra 2X
Mezcla maestra Multiplex PCR 5X PCR de punto final multiplex
PCR de especialidad
LongAmp y reg Taq ADN polimerasa ++ 2x _I No 3'A / Blunt LongAmp y reg Taq ADN polimerasa PCR de largo alcance para plantillas complejas y simples
Arranque en caliente LongAmp & reg Taq ADN polimerasa
LongAmp y reg Taq Mezcla maestra 2X
Arranque en caliente LongAmp & reg Taq Mezcla maestra 2X
Hemo KlenTaq _ No _ No No No 3'A Hemo KlenTaq PCR directa en sangre
Epimark & ​​reg Hot Start Taq ADN polimerasa _ _ j No 3'A Epimark & ​​reg Hot Start Taq ADN polimerasa Amplificación de ADN convertido con bisulfito, plantillas ricas en AT
Amplificación isotérmica y desplazamiento de hebras 3 & prime & ndash & gt5 & prime exonucleasa Tasa de error (x 10 -6)
5 & ​​prime & ndash & gt3 & prime exonucleasa Desplazamiento de hebra Traducción de Nick Extender el cebador de ARN Extensión de Nick Tolerancia dU Extremos resultantes Formatos populares disponibles Aplicaciones
Bst ADN polimerasa, longitud completa _ _ j
3'A Bst ADN polimerasa, longitud completa Traducción de Nick
Bst ADN polimerasa, fragmento grande _ No ++++ No 3'A Bst ADN polimerasa, fragmento grande Amplificación isotérmica (LAMP, SDA) diagnóstico molecular, diagnóstico de campo
Bst 2.0 ADN polimerasa _ 62 (y plusmn5) e No ++++ No 3'A Bst 2.0 ADN polimerasa
Bst 2.0 WarmStart y reg ADN polimerasa
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix con UDG
Kit LÁMPARA WarmStart & reg (ADN y ARN amp)
WarmStart & reg Colorimetric LAMP 2X Master Mix (ADN y ARN amp)
Bst 3.0 ADN polimerasa _ 70 (y plusmn23) e No ++++ No 3'A Bst 3.0 ADN polimerasa
ADN polimerasa Bsu, fragmento grande _ No + No 3'A Bsu ADN polimerasa, fragmento grande Amplificación isotérmica (RPA, SDA, RCA)
ADN polimerasa phi29 ++++ 5 yo No + No Si k Desafilado ADN polimerasa phi29 WGA
Polimerasas para la manipulación del ADN 3 & prime & ndash & gt5 & prime exonucleasa Tasa de error (x 10 -6) 5 & ​​prime & ndash & gt3 & prime exonucleasa Desplazamiento de hebra Traducción de Nick Extender el cebador de ARN Extensión de Nick Tolerancia dU Extremos resultantes Formatos populares disponibles Aplicaciones
T7 ADN polimerasa (sin modificar) ++++ 15 h No _ No No Desafilado T7 ADN polimerasa (sin modificar)
ADN polimerasa IV de Sulfolobus _ No _ No 3'A ADN polimerasa IV de Sulfolobus Bypass de lesiones trans
Terminador y ADN polimerasa comercial _ No + No 3'A Terminador y ADN polimerasa comercial Terminador de cadena
ADN polimerasa I (E. coli) ++ 9 f _ j Desafilado ADN polimerasa I (E. coli) Síntesis de la segunda hebra, traducción de nick
ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) ' ++ 18 g No + No Desafilado ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) ' Blunting, extensión de la imprimación
Fragmento de Klenow (3 & prime & rarr5 & prime exo_) _ 100 gramos No +++ No 3'A Fragmento de Klenow (3 & prime & rarr5 & prime exo_) Un etiquetado de cebado aleatorio y de relaves
ADN polimerasa T4 ++++ & lt1 f No _ No No Desafilado ADN polimerasa T4 Blunting
Polimerasas heredadas Exonucleasa 3 & prime & ndash & gt5 & prime Tasa de error (x 10 -6) 5 & ​​prime & ndash & gt3 & prime exonucleasa Desplazamiento de hebra Traducción de Nick Extender el cebador de ARN Extensión de Nick Tolerancia dU Extremos resultantes Formatos populares disponibles Aplicaciones
ADN polimerasa vent & reg ++ No + No No No Desafilado ADN polimerasa vent & reg
Vent & reg (exo & ndash) ADN polimerasa _ No +++ No No No 3'A Vent & reg (exo & ndash) ADN polimerasa
Deep Vent & reg ADN polimerasa +++ No ++ No No No Desafilado Deep Vent & reg ADN polimerasa
ADN polimerasa Deep Vent & reg (exo y ndash) _ No +++ No No No 3'A ADN polimerasa Deep Vent & reg (exo y ndash)

Deep Vent & reg y Therminator & trade son marcas comerciales de New England Biolabs, Inc.
Q5 y reg, Q5U y reg, LongAmp y reg, unoTaq & reg, Vent & reg son marcas comerciales registradas de New England Biolabs, Inc.

* Aviso a los clientes:
La ADN polimerasa Phusion & reg fue desarrollada por Finnzymes Oy, ahora parte de Thermo Fisher Scientific. Este producto es fabricado por New England Biolabs, Inc. bajo el acuerdo y las especificaciones de rendimiento de Thermo Fisher Scientific.
Phusion & reg es una marca registrada y propiedad de Thermo Fisher Scientific.


Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por fondos del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (No. 2015CB553402 y No. 2016YFC0206300 a TFZ No. 2017YFA0505200 a LL), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31470532, No. 91543102, y No 31711530153 a TFZ No 21532004 a LL), el Programa Beijing Nova (No Z171100001117011 a TFZ), el Programa de Investigación Científica de la Iniciativa de la Universidad de Tsinghua (No 20161080152 a TFZ), el Centro de Ciencias de la Vida de la Universidad de Tsinghua-Pekín (CLS) y el Centro de Innovación Avanzada de Biología Estructural de Beijing.


Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)

En RT-PCR, una población de ARN se convierte en ADNc mediante transcripción inversa (RT) y luego el ADNc se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Figura 1). El paso de amplificación del cDNA brinda oportunidades para estudiar más a fondo las especies de RNA originales, incluso cuando son limitadas en cantidad o se expresan en baja abundancia. Las aplicaciones comunes de la RT-PCR incluyen la detección de genes expresados, el examen de variantes de la transcripción y la generación de moldes de ADNc para clonación y secuenciación.

Dado que la transcripción inversa proporciona plantillas de ADNc para la amplificación por PCR y los experimentos posteriores, es uno de los pasos más críticos para el éxito experimental. La transcriptasa inversa seleccionada debe ofrecer la mayor eficiencia incluso con muestras de ARN desafiantes, como las que están degradadas, tienen inhibidores de arrastre o poseen un alto grado de estructura secundaria. (Papel blanco:Transcriptasa inversa diseñada)

Al realizar RT-PCR, los métodos de uno y dos pasos son los dos enfoques comunes, cada uno con sus propias ventajas y desventajas (Figura 2). Como su nombre indica, RT-PCR de un solo paso combina la síntesis de ADNc (RT) de la primera hebra y la posterior PCR en un solo tubo de reacción. Esta configuración de reacción simplifica el flujo de trabajo, reduce la variación y minimiza la posible contaminación. La RT-PCR en un solo paso permite un procesamiento más fácil de una gran cantidad de muestras, lo que la hace adecuada para aplicaciones de alto rendimiento. Sin embargo, la RT-PCR de un solo paso utiliza cebadores específicos de genes para la amplificación, lo que limita el análisis a unos pocos genes por muestra de ARN. Dado que la reacción es un compromiso entre la transcripción inversa y las condiciones de amplificación, la RT-PCR de un solo paso podría ser menos sensible y menos eficiente en algunos escenarios. Sin embargo, el uso de un cebador específico de gen en RT-PCR puede ayudar a maximizar el rendimiento del ADNc diana y minimizar la amplificación de fondo. (Papel blanco:Sistema mejorado de RT-PCR en un solo paso)

RT-PCR de dos pasos implica dos reacciones separadas, comenzando con la síntesis de ADNc (RT) de la primera hebra, seguida de la amplificación de una porción del ADNc resultante mediante PCR en un tubo separado. Por lo tanto, la RT-PCR de dos pasos es útil para detectar múltiples genes en una sola muestra de ARN. La separación de las reacciones de RT y PCR permite la optimización de las condiciones de reacción para cada paso, así como la flexibilidad con cebado de transcripción inversa (cebadores oligo (dT), hexámeros aleatorios o cebadores específicos de genes) y configuración de PCR (p. Ej., Elección de ADN polimerasa y componentes de PCR). En comparación con la RT-PCR de un paso, las desventajas de la RT-PCR de dos pasos incluyen varios pasos para un flujo de trabajo extendido, manipulación y procesamiento de muestras adicionales y aumento de la posibilidad de contaminación y variación en los resultados.

Tabla 1. Comparación de RT-PCR de uno y dos pasos

RT-PCR de un pasoRT-PCR de dos pasos
ConfiguraciónReacción combinada en condiciones que apoyan tanto la transcripción inversa como la PCRReacciones optimizadas separadas para transcripción inversa y PCR
ImprimacionesCebadores específicos de genesElección de oligo (dT), hexámeros aleatorios o cebadores específicos de genes
Uso idealAnálisis de plataformas de alto rendimiento de uno o dos genesAnálisis de múltiples genes
VentajaConveniente, de alto rendimientoFlexible

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6.5: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - Biología

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El objetivo de la PCR, reacción en cadena de la polimerasa, es amplificar una secuencia genética. En este ejemplo, se amplificará un gen de interés a partir de ADN purificado. Para realizar la amplificación, se requiere una polimerasa para sintetizar el nuevo ADN.

También se necesita un cebador, un fragmento corto de ADN monocatenario que comparte homología con el gen de interés. Por último, se utilizan nucleótidos simples llamados desoxinucleósidos trifosfatos o dNTP para fabricar la nueva hebra. El primer paso en la PCR es calentar la mezcla que desnaturaliza el ADN.

A continuación, la reacción se enfría y los cebadores se aparearán con su región homóloga. Una vez unida, la reacción se calienta a una temperatura óptima para la polimerasa. La polimerasa luego reconoce el complejo de ADN del cebador y comienza la síntesis de la nueva hebra utilizando los dNTP en la solución.

A continuación, la reacción se calienta y prosigue como se describe a lo largo de ciclos adicionales. Después del tercer ciclo, hay ocho copias totales del gen. Después del cuarto ciclo, 16 copias.

Y quinto ciclo, 32 ejemplares. El número de ciclos seguirá creciendo exponencialmente. Después de 30 ciclos, hay poco más de mil millones de copias.

15.14: PCR

Visión general

La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica ampliamente utilizada para copiar segmentos de ADN. Debido a la amplificación exponencial, la PCR puede producir millones o miles de millones de copias de ADN en solo unas pocas horas.En una reacción de PCR, una enzima polimerasa de ADN resistente al calor amplifica el ADN original a través de una serie de cambios de temperatura dentro de una máquina automatizada llamada termociclador.

La PCR es un método versátil que revolucionó la biología molecular

Kary Mullis desarrolló la PCR en 1983, por lo que fue galardonado con el Premio Nobel de Química en 1993. Al ser una forma relativamente rápida, económica y precisa de copiar una secuencia de ADN, la PCR se convirtió en una herramienta invaluable para numerosas aplicaciones, incluida la clonación molecular, mutagénesis genética, detección de patógenos, análisis de expresión genética, cuantificación y secuenciación de ADN y diagnóstico de enfermedades genéticas.

El ciclo de reacción de la PCR

La PCR imita el proceso natural de replicación del ADN que ocurre en las células. La mezcla de reacción incluye una secuencia de ADN molde que se copiará, un par de moléculas de ADN cortas llamadas cebadores, bloques de construcción de ADN libres llamados desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) y una enzima polimerasa de ADN especializada.

La PCR implica una serie de pasos a altas temperaturas, que requieren una enzima ADN polimerasa que sea funcional a tales temperaturas. La ADN polimerasa más utilizada es Taq polimerasa, que lleva el nombre de Thermus aquaticus, la bacteria de la que se aisló inicialmente la polimerasa. La ADN polimerasa es incapaz de sintetizar una molécula de ADN desde cero o de novo. En cambio, la ADN polimerasa se agrega a las moléculas de ADN cortas, llamadas cebadores, que se unen a la plantilla de ADN a través del emparejamiento de bases complementarias. Los cebadores proporcionan un grupo hidroxilo 3 & rsquo libre al que la ADN polimerasa puede unir nuevos dNTP. Hay cuatro tipos de dNTP en una PCR, uno para cada nucleótido de la molécula de ADN: dATP, dCTP, dGTP y dTTP.

Cada ciclo de PCR consta de tres pasos: desnaturalización, recocido y síntesis de ADN.

  1. Desnaturalización. El ciclo de PCR se inicia calentando la mezcla de reacción a una temperatura alta, lo que provoca la separación de la doble hélice de ADN en dos hebras. Este proceso de & ldquomelting & rdquo generalmente ocurre a una temperatura de 90 & degC & tímido & tímido & ndash100 & degC.
  2. Recocido. La mezcla de reacción se enfría rápidamente (normalmente a 50 ° C y ndash65 ° C), permitiendo que los dos cebadores se unan a sus secuencias complementarias en las hebras de ADN molde.
  3. Síntesis de ADN (extensión del cebador). La mezcla de reacción se calienta nuevamente, esta vez a una temperatura (generalmente 60 ° C y ndash75 ° C) que permite que la ADN polimerasa extienda los cebadores agregando dNTP que se emparejan con las bases en la hebra molde.

Una PCR típica implica de 20 a 40 ciclos repetidos de estos tres pasos, que ocurren en el termociclador. Dado que el número de moléculas de ADN se duplica en cada ciclo, el ADN se amplifica exponencialmente.

Limitaciones de la PCR

Si el científico quiere amplificar un tramo específico del genoma, el científico debe conocer al menos parte de la secuencia de ADN objetivo para diseñar cebadores apropiados. Otro problema potencial es el apareamiento inespecífico de cebadores con secuencias de ADN parcialmente similares, lo que conduce a la amplificación del ADN no objetivo. Este problema se puede controlar optimizando las condiciones de reacción. Al ser un método de detección altamente sensible, la PCR también es vulnerable a la contaminación, e incluso pequeñas cantidades de ADN contaminante pueden causar resultados engañosos. Las ADN polimerasas utilizadas en la PCR pueden ser propensas a errores. Si ocurre una mutación dentro de los primeros ciclos, la mayor parte del ADN amplificado llevará la mutación.

Garibyan, Lilit y Nidhi Avashia. & ldquoTécnicas de investigación simplificadas: reacción en cadena de la polimerasa (PCR). & rdquo The Journal of Investigative Dermatology 133, no. 3 (marzo de 2013): e6. [Fuente]

Ore, Leslie A. & ldquoLa revolución de la biotecnología: PCR y el uso de la transcriptasa inversa para clonar genes expresados. & Rdquo Educación de la naturaleza 1, no. 1 (2008): 94. [Fuente]


Ver el vídeo: PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa divulgación científica IQOG-CSIC (Noviembre 2022).