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Disponibilidad de una base de datos que contiene las proteínas de Vibrio cholerae y sus correspondientes secuencias de genes

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Quería una lista de todas las proteínas (secuencias de aminoácidos) y sus correspondientes secuencias de genes de Vibrio cholerae. Traté de buscar en patric, pero la cantidad de secuencias de aminoácidos y secuencias de genes no coinciden, ya que han proporcionado todo el genoma. Necesito saber si existe una base de datos donde se puedan obtener todas las proteínas de Vibrio cholerae y sus correspondientes secuencias de genes en un solo archivo o en un par de archivos. Copiar y pegar secuencias de proteínas y genomas 4000-5000 individualmente de Internet me parece engorroso.


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Caracterización y variación genética de Vibrio cholerae Aislado de fuentes clínicas y ambientales en Tailandia

Afiliación Instituto Nacional de Alimentos, Universidad Técnica de Dinamarca, Grupo de Investigación sobre Epidemiología Genómica, Centro Colaborador de la OMS para la Resistencia a los Antimicrobianos en Patógenos y Genómica Transmitidos por los Alimentos y Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para la Resistencia a los Antimicrobianos, Kgs. Lyngby, Dinamarca

Afiliación Instituto Nacional de Alimentos, Universidad Técnica de Dinamarca, Grupo de Investigación sobre Epidemiología Genómica, Centro Colaborador de la OMS para la Resistencia a los Antimicrobianos en Patógenos y Genómica Transmitidos por los Alimentos y Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para la Resistencia a los Antimicrobianos, Kgs. Lyngby, Dinamarca

Afiliación al Departamento de Microbiología, Facultad de Salud Pública, Universidad Mahidol, Bangkok, Tailandia

Afiliación Instituto Nacional de Alimentos, Universidad Técnica de Dinamarca, Grupo de Investigación sobre Epidemiología Genómica, Centro Colaborador de la OMS para la Resistencia a los Antimicrobianos en Patógenos y Genómica Transmitidos por los Alimentos y Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para la Resistencia a los Antimicrobianos, Kgs. Lyngby, Dinamarca

Facultad de Afiliación de Salud Pública, Universidad de Thammasat, Centro Rangsit, Pathumthani, Tailandia

Afiliación Instituto Nacional de Alimentos, Universidad Técnica de Dinamarca, Grupo de Investigación sobre Epidemiología Genómica, Centro Colaborador de la OMS para la Resistencia a los Antimicrobianos en Patógenos y Genómica Transmitidos por los Alimentos y Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para la Resistencia a los Antimicrobianos, Kgs. Lyngby, Dinamarca


2 EL PARADIGMA: EL SISTEMA QUIMOSENSORIAL EN EL ORGANISMO MODELO Escherichia coli

La quimiosensorialidad se entiende mejor como la vía de la quimiotaxis en la bacteria modelo. E. coli (Parkinson et al., 2015), Figura 1. Este organismo tiene un único sistema quimiosensorial que detecta el estado de unión de los atrayentes y repelentes a cuatro receptores transmembrana llamados proteínas de quimiotaxis que aceptan metilo (MCP). Estos receptores detectan nutrientes, moléculas de señalización y toxinas que se unen a sus dominios periplásmicos, ya sea directa o indirectamente (Milburn et al., 1991 Tam y Saier, 1993 Englert et al., 2010). Un quinto receptor adicional es un sensor redox independiente de metilación que funciona a través de la regulación de la oxidación y reducción de un resto de dinucleótido de flavina adenina que se une a una proteína circadiana del período periplásmico, proteína traductora nuclear del receptor de aril hidrocarburo, dominio de proteína de un solo propósito (PAS) (Bibikov et al., 2004 ).

El estado de unión de los receptores se comunica a través de un dominio de histidina quinasas, adenilato ciclasas, proteínas aceptoras de metilo y fosfatasas (HAMP) a sus puntas citoplasmáticas. Aquí, regulan la autofosforilación de la histidina quinasa CheA. Esta quinasa es una enzima de cinco dominios que forma homodímeros. Cada dominio juega un papel distinto en la función de CheA: P1 lleva el sustrato histidina que recibe el grupo fosforilo durante la autofosforilación, P2 es el sitio de unión para el regulador de respuesta CheY. Ambos dominios, P1 y P2, se unen al resto de la proteína a través de conectores flexibles. P3 es el dominio de dimerización, P4 es el dominio de quinasa con el bolsillo de unión a ATP y P5 es el dominio de unión al receptor (Muok et al., 2020 ).

Tras la activación, la quinasa transfiere el grupo fosforilo a CheY. CheY fosforilado a su vez se une al motor flagelar donde provoca un cambio en la dirección de rotación flagelar (Stock y Da Re, 2000). Cuando los niveles de atrayentes aumentan, la quinasa se apaga y CheY no se fosforila. En ausencia de CheY-P, los motores giran en sentido antihorario (ccw). Esto provoca un agrupamiento de los múltiples flagelos que, en conjunto, impulsan la célula hacia adelante, lo que da como resultado un patrón de natación suave (lo que se denomina "carrera"). Tras la disminución de atrayentes o el aumento de repelentes, los receptores activan la quinasa. CheY se fosforila, lo que da como resultado una inversión de la dirección de giro del motor tras la unión de CheY-P. Esto hace que el haz flagelar se separe y las células se reorienten aleatoriamente (“caen”). Para mantener el nivel general de CheY-P en sincronía con la actividad de CheA, CheY-P se desfosforila rápidamente por la fosfatasa CheZ (Parkinson et al., 2015 ).

El sistema de quimiotaxis puede adaptarse a las condiciones actuales mediante la regulación de la metilación del receptor en residuos de glutamilo específicos en la porción citoplásmica de las MCP (Sourjik y Wingreen, 2012). La metilesterasa CheB también se activa mediante la fosforilación de CheA. Junto con la metiltransferasa CheR constitutivamente activa, estas enzimas controlan la metilación de los receptores, lo que permite una adaptación precisa al contrarrestar el estado de activación de los receptores de forma retardada en el tiempo: un receptor completamente metilado da como resultado una alta actividad de quinasa, mientras que un receptor completamente desmetilado regula a la baja la quinasa (Parkinson et al., 2015). El sistema de quimiotaxis permite que las células controlen la duración y frecuencia de las fases de ejecución y caída. En última instancia, al cambiar el equilibrio entre estos dos estados, las células se mueven en una "caminata aleatoria sesgada" hacia arriba en gradientes de atrayentes y en gradientes de repelente hacia abajo.

Los receptores juntos forman grandes grupos en los polos celulares. En E. coli, los receptores forman matrices hexagonales bien ordenadas con CheA y CheW CheW y el dominio P5 homólogo de CheW de CheA forman anillos alternos unidos a las puntas del receptor. Los dominios de dimerización P3 de CheA forman un puente entre hexágonos vecinos. La estequiometría de CheA a CheW varía de 1: 1 a 1: 2. Esta variabilidad de CheW se origina en la arquitectura de la matriz; hay seis hexágonos que contienen tres monómeros de CheA cada uno, rodeando uno que carece de histidina quinasa (Briegel et al., 2012 Liu et al., 2012 Cassidy et al., 2015). Este hexágono sin CheA puede contener CheW adicional.

La disposición de los receptores en matrices muy ordenadas no es exclusiva de E. coli, pero se ha encontrado en todas las bacterias quimiotácticas y arqueas fotografiadas hasta ahora (Briegel et al., 2009 2015 ).

Si bien tenemos un conocimiento profundo del sistema quimiosensorial en E. coli, apenas estamos comenzando a desentrañar la estructura y función de tales sistemas en otros organismos. En esta revisión, resumiremos el conocimiento actual sobre los complejos sistemas quimiosensoriales en V. cholerae, un sistema modelo clave como patógeno humano con un ciclo de vida complejo. Específicamente, destacaremos similitudes y diferencias con el sistema modelo en E. coliy describa algunas de las preguntas abiertas restantes.


Resultados

Desarrollo de cepas informadoras para monitorear la frecuencia de pérdida de IG en V. cholerae.

Trabajos previos que estudiaron el fenómeno de escisión de IG en V. cholerae adoptó el ensayo de PCR (19, 20). Sin embargo, este ensayo no es eficaz para controlar la pérdida de GI y no puede aislar células bacterianas de una población heterogénea que ha perdido el GI de su genoma. En este estudio, diseñamos el genoma de diferentes V. cholerae cepas para controlar la frecuencia de pérdida de diferentes IG en condiciones de crecimiento in vitro e in vivo. Cada GI (VPI-1, VPI-2, VSP-1 y VSP-2) y los profagos fueron etiquetados con múltiples seleccionables (gato), contraseleccionable (sacB) y cromogénico (lacZ) alelos en la clínica V. cholerae cepa N16961 y sus derivados (Fig. 2). Dado que el genoma N16961 carece de SXT, etiquetamos este elemento con un marcador seleccionable y contraseleccionable similar en un V. cholerae Aislamiento clínico O1 El Tor 41081 (Tabla 1). El alelo sacB-gato o sacB-cat-lacZ o sacB-aadA se introdujo en los GI o SXT mediante el método de intercambio alélico secuencial utilizando derivados del vector suicida pKAS32 que alberga un marcador seleccionable bla y marcador contra-seleccionable rpsL en la columna vertebral del plásmidoApéndice SI, Tabla S1). Primera cepa intermedia cruzada que lleva la columna vertebral del vector (pKAS32) y el alelo informador (sacB-gato o sacB-cat-lacZ o sacB-aadA) se confirmó por resistencia a antibióticos (Cam R o Spc R y Amp R) y susceptibilidad a estreptomicina y sacarosa. Las cepas informadoras deseadas SB30 (VPI-1 ::sacB-gato), SB26 (VPI-2 ::sacB-gato), SB23 (VSP-1 ::sacB-gato), DD1 (VSP-2 ::sacB-gato), BB2 (CTXΦ ::sacB-gato) y JV3 (SXT ::sacB-aadA) se confirmaron mediante la resistencia a los antibióticos, la susceptibilidad a la sacarosa, el color de la colonia, el ensayo de PCR y la secuenciación del ADN (Fig. 3). Dado que la integración de CTXΦ y RS1Φ son irreversibles, la matriz de profagos TLC-CTX-RS1 en el genoma de N16961 se reemplazó primero por un casete de resistencia a espectinomicina mediante el método de intercambio alélico. Posteriormente, CTXΦ ::sacB-gato elemento fue introducido en el lacZ-dif1 alelo por recombinación específica de sitio para desarrollar la cepa bacteriana recombinante BB2 (Tabla 1). El fenotipo de resistencia a antibióticos, el ensayo de PCR y el cribado azul-blanco confirmaron la cepa BB2 deseada.

Representación esquemática de la organización genética de las islas genómicas (GI), elemento conjugativo integrativo (ICE) y profagos y ubicación de genes indicadores en el genoma marcado. Seleccionable (gato), contra-seleccionable (sacB) y cromogénico (lacZ) alelos se introdujeron en el V. cholerae genoma, adoptando un método de intercambio alélico. El asterisco indica que Vibrio La isla de patogenicidad-1 (VPI-1) fue etiquetada con sacB-gato al igual que sacB-cat-lacZ alelos.

Genotipo y fenotipo relevante de tipo salvaje y genéticamente modificado. Vibrio cholerae cepas utilizadas en el estudio

Organización genética de los sitios de integración cromosómica (attB) antes y después de la escisión de las cuatro islas genómicas del genoma de N16961. (A) attL y attR Los sitios se formaron debido a la recombinación específica del sitio entre el sitio de unión de la isla genómica (attP) y sitio de unión cromosómica (attB). Los números de carril 17 y 18 contenían escaleras de ADN de 1 kb y 100 pb, respectivamente. (B) Análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de N16961 y sus derivados en presencia y ausencia de islas genómicas (IG). Los productos de PCR amplificados se resolvieron en un gel de agarosa. El número de carril y el amplicón correspondiente se mencionan en A. Las flechas azules indican cebadores que se unen hacia arriba y hacia abajo de GI, y las flechas verdes indican cebadores que se unen a GI.

Determinación de la frecuencia in vitro e in vivo de pérdida de IG, elemento conjugativo integrativo y profago CTX.

Para monitorear la estabilidad de los cuatro GI, el profago CTX y el elemento SXT en condiciones de crecimiento in vitro, las cepas informadoras diseñadas en este estudio (SB30, SB26, SB23, DD1, BB2 y JV3) se cultivaron en un medio nutricionalmente rico (Caldo Luria-Bertani LB) durante 12 ha 37 ° C. Los cultivos de las cepas indicadoras se sembraron en placas de agar Luria (LA) suplementadas con sacarosa (15%) y estreptomicina (100 µg / ml). Se controló la sensibilidad de las colonias que crecieron en las placas de selección al cloranfenicol o la espectinomicina, dependiendo del casete de resistencia usado para marcar los GI, el profago CTX y el elemento SXT. Las colonias extirpadas se sometieron además a confirmación por PCR amplificando una región de unión cromosómica de cada uno de los GI (Fig. 3). Secuencias de adjuntos (attB) para cada GI y SXT se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Se determinó el número total de células bacterianas en un cultivo bacteriano desarrollado durante la noche colocando el mismo cultivo en una placa LA suplementada con estreptomicina. Observamos diferente frecuencia de pérdida para diferentes IG (Tabla 2). Se observó la mayor frecuencia de pérdida en condiciones de crecimiento in vitro para el VPI-1, mientras que no se detectó pérdida para el profago CTX (Tabla 2).

Frecuencia de pérdida in vitro e in vivo de diferentes islas genómicas

Para controlar las frecuencias de pérdida de diferentes GI en condiciones de crecimiento in vivo, adoptamos el modelo experimental de bucle ileal de conejo ligado. Las cepas informadoras que albergaban GI marcados en su genoma se inocularon en un asa ileal ligada, y las frecuencias de pérdida de cada GI se midieron después de 12 h colocando células en placas de selección suplementadas con sacarosa (15%) y estreptomicina (100 μg / ml). . Al igual que en el experimento in vitro, se cuantificó el número total de células bacterianas en el líquido del asa ileal ligado colocando el líquido en la placa LA suplementado con estreptomicina. Se observó la mayor frecuencia de pérdida para el VPI-2 en comparación con cualquier otro IG (Tabla 2). No se observó pérdida para el profago CTX (Tabla 2). Las cepas informadoras que llevan la deleción de GI aisladas de asas ileales ligadas se confirmaron volviendo a secar las colonias en el Vibrio-medio selectivo específico TCBS y LA suplementado con estreptomicina (resistente) o cloranfenicol (sensible). Curiosamente, observamos que la frecuencia de pérdida de todas las IG del V. cholerae el genoma era muy alto en condiciones in vitro en comparación con las células cultivadas in vivo (Tabla 2).

V. cholerae Las cepas desprovistas de islas genómicas y profagos son viables y pueden multiplicarse tanto en medios ricos como mínimos.

Hemos realizado una amplia ingeniería del genoma de N16961 para eliminar todos sus GI y profagos de su genoma. Primero, etiquetamos a las IG con sacB-gato o sacB-cat-lacZ y luego aislado V. cholerae células que perdieron el GI marcado sembrando las células en medio de selección suplementado con sacarosa (Tabla 1). Para aislar cepas que carecen de diferentes combinaciones de MGE como ΔVPI-1 (SB31), ΔVPI-2 (SB27), ΔVSP-1 (SB25), ΔVSP-2 (DD2), ΔTLCΦ-CTXΦ-RS1Φ (BS1), ΔVPI-1ΔVPI- 2 (SB52), ΔVSP-1ΔVSP-2 (SB44), ΔVSP-1ΔVSP-2ΔVPI-1 (SB47), ΔVSP-1ΔVSP-2ΔVPI-2 (SB48), ΔVSP-1ΔVSP-2ΔVPI-1ΔVPI-2 (SB50) y ΔVSP-1ΔVSP-2ΔVPI-1ΔVPI-2ΔTLCΦ-CTXΦ-RS1Φ ::lacZ-dif1 (BB1) (Tabla 1), utilizamos la toxicidad condicional de sacB a la bacteria huésped.

Medimos la tasa de crecimiento de N16961 y sus derivados con o sin IG y profagos en un medio nutricionalmente rico (LB) o mínimo (M9) (nutricionalmente pobre). V. cholerae células desprovistas de cualquier GI y profagos pudieron crecer en ambos medios (Fig.4 A y B). Sin embargo, el crecimiento de SB50 (Δvsp-1Δvsp-2vpi-1vpi-2) se redujo significativamente (PAG & lt 0.01) durante 5, 6 y 7 h de crecimiento en comparación con su cepa parental N16961 (Fig.4A). También observamos una reducción significativa (PAG & lt 0.05) en el crecimiento de la cepa SB47 (Δvsp-1Δvsp-2vpi-1) durante 5, 6 y 7 h de incubación. Curiosamente, BB1, el derivado de SB50 que lleva dif1 en Chr1 pero desprovisto de los cuatro GI y profagos en el cromosoma, mostró un perfil de crecimiento similar al de la cepa WT N16961 (Fig.4 A y B). No hemos observado cambios importantes en el perfil de crecimiento ni en M9 ni en LB entre las cepas N16961 y BB1 (Fig.4 A y B). Anteriormente se informó que el V. cholerae La cepa O1 El Tor N16961 tiene una ventaja de crecimiento significativa sobre la cepa de biotipo clásico O395 en cultivo en fase estacionaria cuando ambas cepas se cocultivaron en LB en condiciones óptimas de crecimiento (27). La principal diferencia entre El Tor y los biotipos clásicos con respecto a GI es la ausencia de VSP-1 y VSP-2 en este último. Investigamos si la cepa clásica O1 O395 puede competir con la cepa O1 El Tor SB60 desprovista de islas VSP-1 y VSP-2. Para diferenciar las cepas SB60 y O395 en el cocultivo, introdujimos dos casetes de genes de resistencia diferentes, gato y sh ble, en el dif1 sitio de El Tor y cepas clásicas, respectivamente. El cultivo mixto se hizo crecer en medio LB o M9 en condiciones óptimas de crecimiento, y se midió el número de células bacterianas en diferentes puntos de tiempo (Fig.4 C y D). Nuestro hallazgo indica que el biotipo clásico O395 puede competir con el biotipo El Tor eliminado de VSP-1 y VSP-2 cuando se cocultivaron en medio M9. Sin embargo, las cepas El Tor eliminadas de VSP-1 y VSP-2 pueden superar a la O395 en el medio LB. Este hallazgo indica que la adquisición de VSP-1 y VSP-2 en el genoma de V. cholerae proporcionó ciertos rasgos metabólicos que posiblemente ayudaron al biotipo El Tor de la séptima pandemia a superar al biotipo clásico causante de la sexta pandemia. Sin embargo, el papel adicional de oriC Las funciones también podrían ayudar al biotipo El a superar al biotipo clásico en un ambiente rico en nutrientes incluso en ausencia de tales rasgos metabólicos (28). Anteriormente se informó que el oriC del biotipo clásico lleva una mutación de base única (T → G) en su región de repetición R de 13 meros rica en AT conservada en comparación con la oriC del biotipo El Tor (28). Se ha demostrado que el número de copias del minicromosoma y su eficiencia transformacional se reducen sustancialmente debido a la mutación de sustitución en el oriC del biotipo clásico (28). Esta podría ser una de las razones de la menor competencia del biotipo clásico durante el cocultivo con el biotipo El Tor en el medio rico en nutrientes.

Curva de crecimiento de tipo salvaje y transgénico V. cholerae cepas en medio de cultivo rico (LB) y nutricionalmente definido (M9). La cepa El Tor N16961 y sus derivados se cultivaron individualmente en monocultivos en LB (A) y M9 (B), y el crecimiento de las células bacterianas se controló midiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nm (DO600) en un espectrofotómetro en diferentes momentos. La competencia de crecimiento entre ΔVSP-1ΔVSP-2 N16961 y O395 también se realizó en ricos (C) y medio mínimo (D) en un medio cocultivado inoculando un número similar de células juntas (1: 1). El recuento de UFC de cada cepa se determinó colocando el cultivo en medio rico (LA) suplementado con antibiótico específico. TCR = TLCΦ-CTXΦ-RS1Φ.

Eficiencia de integración de diferentes GI, SXT y CTXΦ en presencia y ausencia de genoma adquirido.

Los estudios sobre la eficiencia de integración de las indicaciones geográficas son complicados debido a su gran tamaño y la naturaleza no replicativa de su forma circular extirpada. Por lo tanto, para evitar esta complejidad, amplificamos el módulo integrador de GI, SXT y CTXΦ de su forma circular escindida, que incluye el sitio de unión (attP) con o sin recombinasas (Fig. 5). Los módulos de integración se clonaron en un vector conjugativo condicionalmente replicativo (Apéndice SI, Tabla S1). El vector recombinante que contiene el módulo de integración de GI, SXT o CTXΦ se introdujo por conjugación en V. cholerae cepas que llevan el sitio de unión cromosómico nativo (attB) con o sin otras IG. Integración del módulo integrador en el cromosoma de V. cholerae se determinó con base en el perfil de resistencia a antibióticos (cloranfenicol o zeocina) de las células receptoras. La integración de un GI en un locus cromosómico específico se confirmó además mediante un ensayo de PCR y un ensayo colorimétrico azul-blanco. La conjugación de diferentes vectores recombinantes que llevan un módulo de integración no replicativo de diferentes GI, SXT y CTXΦ dio lugar a diferentes números de transconjugantes (Tabla 3). Entre los GI no replicativos y SXT, el mayor número de transconjugantes se obtuvo con el vector recombinante que lleva el módulo de integración de SXT (Tabla 3). La ausencia de GI y profagos aumentó la eficiencia de integración de SXT. Se obtuvo un número mínimo de transconjugantes con el vector recombinante que porta el módulo de integración de VSP-1 (Tabla 3). Sin embargo, cuando se compara con la eficiencia de integración de GI y SXT con el módulo replicativo e integrador de CTXΦ, el mayor número de transconjugantes se obtuvo con el genoma del fago (Tabla 3). Para diferenciar entre V. cholerae células que llevan la forma integrativa o replicativa del módulo RS2 de CTXΦ, fusionamos el sitio de unión cromosómica dif1 en la región de codificación del lacZ gen amplificado de mi. coli. los lacZ-dif1 El alelo produjo β-galactosidasa funcional y generó colonias azules en presencia de la sustancia cromogénica X-gal en la placa de selección. Luego eliminamos endógenos lacZ gen de V. cholerae células, y la matriz de profagos TLC-CTX-RS1 se reemplazó con lacZ-dif1 aleloApéndice SI, Fig. S3). La cepa informadora que lleva el módulo RS2 replicativo de CTXΦ se volvió azul en presencia de X-gal en la placa de selección, mientras que la cepa que transportaba RS2 integrativo en el dif1 en el cromosoma lacZ-dif1 alelo produjo colonias blancas debido a la inactivación de lacZ gen y aboliendo la producción de β-galactosidasa (Apéndice SI, Fig. S3). El número de transconjugantes con el mismo vector recombinante en presencia y ausencia de otros GI en las células huésped mostró resultados diferentes (Tabla 3). Las eficiencias de integración de CTXΦ y sus derivados se midieron en ausencia de TLCΦ y otros profagos. El módulo de integración de SXT y VPI-1 puede integrarse casi con igual eficiencia en presencia y ausencia de otras IG en el V. cholerae genoma. La eficiencia de integración de VPI-2 se redujo en ausencia de otras IG. Curiosamente, la eficiencia de integración de VSP-1 y VSP-2 aumentó en ausencia de IG (Tabla 3).

Herramientas genéticas diseñadas para medir la eficiencia de integración de diferentes IG, ICE (SXT) y CTXΦ. El módulo de integración de todos los elementos se amplificó a partir de su forma circular extirpada, que incluye el sitio de unión (attP) con o sin tirosina recombinasas. El vector original (pSW23T) no pudo replicarse en V. cholerae debido a su condicional o yo (R6K) función.

Frecuencias de integración de diferentes islas genómicas, elemento CTXΦ y SXT en presencia y ausencia de elementos genéticos adquiridos

También hemos medido la eficiencia de integración del módulo RS2 no replicativo de CTXΦ en el dif1 sitio de Chr1 en V. cholerae cepa informadora BS1 y BB1. Observamos una eficiencia de integración similar del módulo RS2 no replicativo en presencia y ausencia de diferentes IG. El evento de integración del módulo RS2 no replicativo fue específico del sitio (≥99,3%) e irreversible, tanto en presencia como en ausencia de otros IG (Tabla 3).

Interferencia entre elementos genéticos adquiridos horizontalmente y el genoma central.

Diálogo cruzado entre IG y profagos en V. cholerae es un fenómeno bien conocido (29, 30). Sin embargo, se desconoce la influencia de las funciones adquiridas en la funcionalidad de los genes presentes en el genoma central. Comprender la base molecular de la esencialidad de LexA en V. cholerae es de especial interés debido a su contribución en la biología de los MGE adquiridos horizontalmente, especialmente en la replicación, integración y producción de CTXΦ extracromosómico a partir de profagos y la escisión y diseminación de SXT. Resolvimos el misterio de la esencialidad de LexA en V. cholerae eliminando el lexA gen del cromosoma en la ingeniería V. cholerae cepa BB1 eliminada con IG y profagos (Tabla 1). Utilizamos un vector recombinante pAP17 que contenía un casete de resistencia a kanamicina (aph3) flanqueado por las regiones aguas arriba y aguas abajo de lexA para borrar el lexA gen por método de intercambio alélico. Identificar el elemento genético clave responsable de la esencialidad de la lexA gen en V. cholerae genoma, seleccionamos cepas GI únicas o múltiples o con deleción de profago (Tabla 1) seguido de un intento de eliminar lexA en cada una de estas cepas de ingeniería. Sorprendentemente, tal cribado nos permitió descubrir que el lexA gen no es esencial en TLC-CTX-RS1 con deleción de profago V. cholerae células, pero sigue siendo esencial en cepas GI negativas únicas o múltiples (Tabla 4). Para determinar si la matriz TLC-CTX-RS1 o cualquiera de estos fagos en particular es responsable de la esencialidad de lexA, cada uno de ellos se eliminó secuencialmente, seguido de un intento de eliminar lexA en esas cepas de ingeniería. Curiosamente, se identificó que lexA no es esencial solo en células CTX con deleción de profago (Tabla 4). El profago CTX se compone de RS2 y región central. Mientras RS2 lleva rstR-rstA-rstB genes, el segmento central lleva siete genes diferentes, incluida la codificación de CT ctxAB genes. Por otro lado, el RS1Φ es idéntico al RS2 excepto que lleva un gen adicional, llamado rstC. los rstA, rstB, y rstR Los productos génicos son esenciales para la replicación, integración y regulación de la transcripción de fagos, respectivamente. Dado que la expresión de rstR, rstA, y rstB está bajo el control de LexA de PrstA promotor (31), por lo tanto, analizamos la función de cada una de estas proteínas para comprender su contribución, si la hubiera, en la esencialidad de lexA gen en V. cholerae. RstB es una proteína de unión a ADN monocatenario, que ayuda en la integración de CTXΦ y RS1Φ en el cromosoma dif sitio. RstR es un regulador transcripcional, que reprime la transcripción de rstA, rstB, y rstC de la PrstA promotorApéndice SI, Fig. S3). RstA es una proteína Rep, que introduce cortes de ADN en el o yoctx secuencia y ayuda a CTXΦ a generar genoma de fago extracromosómico a partir del profago. Presumimos que, en ausencia de represión mediada por LexA, podría haber un exceso de producción de RstA a partir de los profagos CTX y RS1, lo que a su vez genera cortes frecuentes en el ADN del profago CTX y RS1, lo que conduce a roturas cromosómicas letales. Para probar esta hipótesis, intentamos integrar CTXΦ o CTXΦ-RS1Φ en tándem en V. cholerae ΔlexA ΔCTXΔRS1 mutante pero no pudo integrar múltiples copias de CTXΦs o CTXΦ-RS1Φ en tándem. En marcado contraste, la integración de múltiples copias de CTXΦs o CTXΦ-RS1Φ en tándem en el dif1 sitio de la V. cholerae ΔCTXΔRS1 pero lexA-se obtuvo fácilmente la cepa positiva (Apéndice SI, Fig. S1). Dado que RecA está intrincadamente asociado con la estabilidad de LexA y, por lo tanto, la expresión del gen profago, diseñamos un ΔlexAΔrecA cepa JV5 doble mutante e investigó el número de profagos CTX en el dif1 sitio después de introducir el fago por conjugación. Como ΔlexA cepa, el profago CTX de copia única también fue dominante en ΔlexAΔrecA doble mutanteApéndice SI, Fig. S1). Para proporcionar más evidencia de que la copia múltiple de funcional rstA está asociado con la esencialidad de LexA en V. cholerae, realizamos mutagénesis dirigida al sitio para reemplazar el residuo de tirosina catalítica del motivo RIYNK de la proteína RstA con el residuo de fenilalanina. Debido a esta mutación puntual, la CTXΦ diseñada que codifica la proteína mutante RstA Y237F catalíticamente inactiva no pudo iniciar la replicación del círculo rodante en V. cholerae. Sin embargo, una única copia de CTXΦ que lleva RstA no funcional se lisogenizó de forma estable tanto en presencia como en ausencia de LexA. Por lo tanto, estos resultados sugieren fuertemente que, cuando funcional rstA el gen está presente en V. cholerae genoma, deleción de lexA es letal para la bacteria. El seguimiento de los fenotipos (resistencia a los antibióticos) y de los genotipos (ensayo de PCR y secuenciación) confirmó la autenticidad de estos V. cholerae mutantes.

Esencialidad de lexA por la viabilidad de Vibrio cholerae en presencia y ausencia de islas genómicas y profagos

RecA codificado por el genoma central ayuda a CTXΦ a superar la inmunidad del huésped y reinfectar V. cholerae.

Aparte de la RstA codificada por fagos, la helicasa UvrD codificada cromosómicamente y LexA también desempeñan un papel importante en la replicación de CTXΦ (30). Se informó que RstR, el factor de transcripción codificado por CTXΦ, se une al rstA promotor (PrstA) y reprime su expresión a partir del genoma del profago (31). Sin embargo, la represión completa se produce por la interacción cooperativa con LexA, el regulador principal de la respuesta bacteriana SOS. La importancia de RecA, la segunda proteína crucial para la respuesta SOS bacteriana, en la replicación de CTXΦ en V. cholerae no ha sido explorado. Medimos la eficiencia de replicación de los tipos El Tor, clásicos y ambientales de CTX en presencia y ausencia de RecA en diferentes V. cholerae cepas (Fig. 6). El genoma de N16961 alberga un profago CTXΦ ET en su cromosoma grande. Introdujimos el módulo de replicación e integración de CTXΦ ET (RS2 ET) y CTXΦ Cl (RS2 Cl) en RecA-positivo N16961 y transconjugantes aislados en una placa de selección suplementada con cloranfenicol. Obtuvimos 2,44 x 10 4 y 3,32 x 10 5 transconjugantes que llevan RS2 ET (pBS66) y RS2 Cl (pBS22), respectivamente (Fig. 6). También habíamos introducido CTXΦ ET, RS2 ET, RS2 Cl, RS2 Env y RS1Φ completos en un reportero V. cholerae cepa BS1 que carece del profago CTXΦ en su genoma, que tiene una RecA funcional. Cabe mencionar que se obtuvieron números similares de transconjugantes para cada uno de los fagos introducidos (Fig. 6). Cuando introdujimos cada uno de estos fagos en el derivado BS1 que alberga el profago CTXΦ ET en el dif1 loci, aquí también obtuvimos un número similar de transconjugantes que llevan genomas de fagos replicativos e integradores o módulos RS. Los resultados indican que la reinfección por CTXΦ es posible incluso en presencia de biotipos específicos. rstR y funcional recA genes en el genoma del hospedador (Fig. 6).

Análisis de la eficiencia de replicación de diferentes CTXΦ en presencia y ausencia de función RecA. Las barras representan el número de UFC que llevan un módulo replicativo de CTXΦ. Los módulos replicativos se transfirieron a las bacterias hospedadoras mediante conjugación de 3 h. Los transconjugantes se seleccionaron en función de los fenotipos de resistencia a los antibióticos. Se utilizó RM-ANOVA bidireccional para inferir la significación estadística de las diferencias de los números de UFC. Las barras de error indican SD. Peso, ET de tipo salvaje, El Tor (A) Cl, clásico (B) Env, ambiental (C) TCR, profago TLC-CTX-RS1. * = CTXΦ ET Cam.

Dado que la función de RecA está intrincadamente asociada con la respuesta SOS y modula la actividad autoproteolítica de LexA, ampliamos nuestro estudio para descifrar el papel de RecA en la replicación de CTXΦ. Para hacer esto, todos los elementos genéticos, a saber, CTXΦ ET, RS2 ET, RS2 Cl y RS2 Env, se introdujeron en el recA- BS1 eliminada y se compararon los números de transconjugantes en las placas de selección. Se obtuvieron números similares de transconjugantes que llevan genomas de fagos replicativos e integradores o módulos RS en presencia de RecA funcional (Apéndice SI, Tabla S2). Luego borramos el recA gen en N16961 e introdujo CTXΦ ET, RS2 ET, RS2 Cl y RS2 Env para monitorear la eficiencia de replicación de diferentes elementos derivados de fagos. Para nuestra sorpresa, aunque no se obtuvo ningún transconjugante para el elemento CTXΦ ET o RS2 ET en ausencia de recA, los transconjugantes para el elemento RS2 Cl (4,6 × 10 5) o RS2 Env (5 × 10 4) se obtuvieron utilizando el mismo V. cholerae cepa mutante (Fig. 6). Además, confirmamos este fenotipo utilizando la cepa BS11 derivada de N16961, que carece de recA y todos los profagos. Una vez que se introdujo CTXΦ ET, también mostró inmunidad contra la reinfección con el tipo similar de CTXΦ (Fig. 6). También observamos fenotipos similares en clásico (O395) y ambiental (VCE232) V. cholerae cepas cuando introdujimos el módulo de integración y replicación CTXΦ Cl o CTXΦ Env a las cepas que carecían recA gen pero que contiene CTXΦ Cl o CTXΦ Env en el cromosoma, respectivamente (Fig.6 y Apéndice SI, Tabla S2). En ambos casos, CTXΦ puede replicarse en ausencia de recA pero presencia de diferentes biotipos de profagos CTX en el cromosoma. También nos aseguramos de que el proceso de transmisión no se reduzca en ausencia de recA función genética mediante el uso de un plásmido conjugativo replicativo pFX497 (Apéndice SI, Tabla S1) como control, que dio un número similar de transconjugantes en presencia o ausencia de recA. Sin embargo, la función RecA no se vinculó con la eficiencia de integración de CTXΦ, ya que es capaz de integrarse en el dif sitio con una eficiencia casi igual en presencia o ausencia de la función RecA (Apéndice SI, Tabla S2). The findings of the present study demonstrate that RecA helps CTXΦ replication in the presence of preexisting CTX prophage in the host chromosome.

Contribution of GIs in Modulating Cellular Proteome.

For identification, quantification, and comparison of whole-cell proteomes of wild type V. cholerae strain N16961 and its derivative BB1 devoid of GIs and prophages, we performed experiments using a high-throughput liquid chromatography (LC) system (Eksigent 2D) coupled with Triple TOF 5600 mass spectrometer (AB Sciex). We have identified a total of 1,864 proteins in both strains (Dataset S1). Based on the proteome profile of N16961 and BB1, we categorized the protein pool into three classes: (I) proteins with lower abundance (>1.5 log fold changes) or absent in BB1, (ii) proteins with higher abundance (>1.5 log fold changes) in BB1, and (iii) proteins with similar abundance in both strains. Proteins that are not detectable in BB1 but found in the N16961 strain were analyzed to find their coding sequences. We have identified similar numbers of proteins in N16961 (norte = 1,765) and BB1 (norte = 1,724) strains. A total of 141 proteins were detected only in N16961, of which 41 proteins are encoded by the genes present in Chr2. More than 10 proteins are encoded by the 4 GIs, VPI-1 (norte = 1), VPI-2 (norte = 4), VSP-1 (norte = 3), VSP-2 (norte = 1), and CTXΦ (norte = 2), which were detected in N16961 but not in BB1. We observed that 131 proteins were differentially expressed (log fold change 1.5 and PAG value <0.05) between N16961 and BB1 strains. Out of 131 differentially expressed proteins in BB1, 59 and 72 proteins were up- and down-regulated, respectively. Proteins down-regulated in BB1 belong to uncharacterized proteins (norte = 8), outer membrane proteins (norte = 2), flagellar biosynthetic proteins (norte = 2), aspartate modifying enzymes (norte = 2), and several others. Enzymes involved in succinate metabolic pathways (norte = 3), RNA degradation (norte = 2), and ABC transporters (norte = 2) are up-regulated in the absence of MGEs. Both small- and large-subunit ribosomal proteins are up- and down-regulated in the absence of MGEs. We observed that 61 proteins encoded by the Chr2 were detectable either in N16961 (norte = 25) or BB1 (norte = 36).


Discusión

Most genomic studies on V. cholerae have focused on serogroup O1, but the global genomic landscape for the non-O1/non-O139 serogroups, the genetic diversity of the O-PS gene clusters, and the evolutionary associations with O1 and O139 serogroups have not been adequately studied. Here, we sequenced three strains from two O159 and O170 serogroups, together with 25 strains from 16 other serogroups to reveal their O-PS gene cluster organizations, genomic features and the evolutionary associations among the different serogroups.

The ANI scores between the different strains reflect the level of global similarity among them. Based on our results, serogroups O159 and O39 are most similar in terms of their ANI score, as are serogroups O170 and O89. Among all the representative strains, most share high similarity scores with each other and only serogroup O115 has an ANI score lower than 95% when compared with all the other strains.

O-PS contains genetic signatures that allow the genetic clones of strains within a species to be distinguished. The genes related to O-PS biosynthesis are generally organized together to form a cluster. All the O-PS biosynthesis genes from the 18 serogroups from this study clustered together and were chromosomally located between the gmhD y rjg genes, suggesting that site-specific transfer has occurred among the different serogroups and strains. Within the O-PS gene clusters, several genes are grouped together and appear in the O-PS gene clusters in the different serogroups, possibly showing that frequent recombination has occurred in these gene clusters. Thus, genetic variability in the O-PS biosynthesis genes, coupled with frequent genetic transfers and recombination may have generated the many serogroups of V. cholerae. Serogroups O1 and O139 cause cholera epidemics, but only one gene in the O-PS genetic region of serogroup O159 was found to share sequence homology with a serogroup O1 gene. It is interesting that serogroup O170 shares the most sequence homology in the O-PS genes with O139, suggesting that O139 and O170 O-PS genetic regions have similar sub-structures.

By visualizing their vertices and edges, networks are a useful way of displaying complicated relationships among vertices in an intuitive way, and analysis of a specified network may provide new insights into biological systems. Here, we constructed a relationship network containing different V. cholerae serogroups and their associated O-PS genes. Previous preliminary research has shown there is variety in the O-PS genetic region in the different serogroups [19], and our network analysis on the homologous genes in the present study supports the idea that there is great diversity in the O-antigen among different serogroups, a viewpoint supported by our 2-dimensional hierarchical clustering analysis. This analysis made further efforts to decipher the detailed relationship between the different serogroups and the contributions of the constituent O-PS genes in each serogroup. The O-PS gene cluster size and gene count showed great divergence among the serogroups. Except for the left and right junction genes in the wb* regions encoding O-PS synthesis, no genes were shared by all the serogroups, further indicating the genetic diversity of the O-PS in V. cholerae. Based on the network analysis, some genes shared by more than two serogroups were identified, showing that exchange and recombination has occurred in the genes and even in the gene clusters among the O-PS genetic regions from the different serogroups. This is further supported by the finding that the O-PS genetic regions comprise the combinations of several smaller gene sets with different origins [20]. Our data have revealed that the O-PS biosynthesis gene pool contains 405 homologous gene clusters, and the network analysis results suggest the hot-spots for serogroups or homologous genes that link other serogroups or homologous genes to a high degree. We suggest that the genes in the gene pool facilitate O-antigen shifts in the different V. cholerae serogroups. Serogroup conversion of the O1 recipient by the O139 donor has been validated in the laboratory, and it is proposed that the exchange of serogroup-specific gene clusters could potentially occur between the different O serogroups of V. cholerae [21].

Our phylogenetic analysis revealed that most toxigenic O1 V. cholerae strains and two classical strains form two separate clusters in the tree. One O139 strain clustered together with most toxigenic O1 V. cholerae strains. Two non-O1, non-O139 strains, V52 (O37) and 981–75 (O65), appear in the same cluster with toxigenic O1 V. cholerae strains, indicating the possibility of O serogroup conversions from O1 to non-O1/non-O139 [20, 22]. Most of the non-O1/non-O139 strains were distributed in the other part of the tree, a finding consistent with that of a previous study [20]. Furthermore, we investigated whether the O-PS biosynthesis gene clusters had undergone co-evolution with the whole genomes in the different V. cholerae serogroups. The genomes and O-PS genes had different phylogenic structures in these strains, revealing that asynchronous genetic variation had occurred during their evolution. We also found that several serogroup pairs had consistent relationships between core-genes or pan-genes and the O-PS genetic region. The consistency between the core gene-based and O-antigen region-based genetic distance indicates that these serogroups had the same common ancestors before gaining similar O-PS genetic regions. In addition, the consistency between the pan gene-based and O-PS genetic region-based distance indicates that these serogroups have undergone some horizontal gene transfer events and acquired similar foreign genes before gaining similar O-PS genetic regions.

The virulence-related genes in the V. cholerae strains displayed the highest levels of sequence similarity with those from P. aeruginosa, V. vulnificus, H. somnus y H. influenzae. Como V. cholerae has an aboriginal habitat in the environment, these data suggest that V. cholerae can exchange virulence-related genes with the above-named species under certain environmental conditions.

Changes that occur in mobile genetic elements may relate to the emergence, drug resistance, fitness and virulence of a strain. Here, we analyzed the profiles of the mobile genetic elements (i.e., VPI-1, VPI-2, VSP- I, VSP-II, SXT and CT) in the different representative strains. We found O159 had a nearly complete VSP-II and partial VPI-1 and VPI-2 sequences, whereas the O170 strain carried partial VPI- 1 and VPI- 2 sequences. VSP-II is considered to be a genetic marker of epidemic V. cholerae therefore, gaining VSP- II may allow a strain to obtain a survival advantage during epidemics [23]. VPI is one of two essential virulence gene clusters in epidemic-causing toxigenic V. cholerae. Several non-O1/non-O139 strains contain full or partial VPI-1 and VPI-2 islands, indicating their potential to evolve into epidemic strains. Because alteration of the O-antigen in pathogenic strains will boost the emergence of new epidemic strains, a combined description of the O-PS genetic region in the non-O1/non-O139 serogroups and their virulence elements, such as CT and TCP, will provide further information on the genesis mechanism of new emerging strains.

Positive selection is known to be an important aspect of the evolution of many pathogens [24, 25]. Indeed, one study showed that the diversification of clinical and environmental V. cholerae isolates from Haiti was driven by positive selection [26]. Selection pressure analysis of strains within the different V. cholerae serogroups should provide detailed information on their evolutionary trends. Here, we found that several of the strains share genes that appear to have evolved under positive selection and are involved in environmental adaptation (e.g., chemotaxis, Na + resistance and cell wall synthesis). These functions may represent the common mechanisms used by strains within the different serogroups to adapt to environmental changes. Serogroup-specific selected genes were also found, and some positively-selected genes may exist in more than one serogroup. Thus, the genetic complexity of the different serogroups and strains may reflect their adaptability to different niches.


Availability of a database containing the proteins of Vibrio cholerae and their corresponding gene sequences - Biology

We showed previously that chitin catabolism by the marine bacterium Vibrio furnissii involves at least three signal transduction systems and many genes, several of which were molecularly cloned, and the corresponding proteins were characterized. The predicted amino acid sequences of these proteins showed a high degree of identity to the corresponding proteins from Vibrio cholerae, whose complete genomic sequence has recently been determined. We have therefore initiated studies with V. cholerae. We report here a novel ATP-dependent glucosamine kinase of V. cholerae encoded by a gene designated gspK. The protein, GspK (31.6 kDa), was purified to apparent homogeneity from recombinant Escherichia coli. The product of the reaction was shown to be GlcN-6-P by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI mass spectrometry) and NMR. los Kmetro values for GlcN, ATP, and MgCl2 were 0.45, 2.4, and 2.2 m m , respectively, and the Vmax values were in the range 180–200 nmol/μg/min (∼6 nmol/pmol/min). Kinase activity was not observed with any other sugar, including: galactosamine, mannosamine, Glc, GlcNAc, GalNAc, mannose, 2-deoxyglucose, and oligosaccharides of chitosan. The enzyme is also ATP-specific. The kinase can be used to specifically determine micro quantities of GlcN in acid hydrolysates of glycoconjugates. The physiological function of this enzyme remains to be determined.

Published, JBC Papers in Press, February 15, 2002, DOI 10.1074/jbc.M107953200

This work was supported by Grant GM51215 from the National Institutes of Health.The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. Por lo tanto, el artículo debe estar marcado como “anuncio publicitario”De acuerdo con 18 U.S.C. Sección 1734 únicamente para indicar este hecho.

Present address: ISM Biopolymer, 220 Denison E. Granby, Quebec J2H 2R6, Canada.


Discusión

In this study, we adopted reverse vaccinology based reductive screening and fished out five immunogenic proteins harboring 10 peptide epitopes as potential vaccine candidates in the V. cholerae proteome. Reverse vaccinology is a genome/proteome based approach for vaccine development that has been proved effective (Giuliani et al., 2006). Reductive screening is performed based on parameters i.e., protein essentiality, subcellular localization, host homology and effective immunogenicity for predicting an effective vaccine candidate. A computer-aided screening process is more convenient, accurate and fast in comparison with the contemporary vaccine development which depends on a hit and trial approach. This strategy studies key aspects of the pathogen i.e., genome, essential metabolism, virulence and protein-protein interactions and incorporates this information for determining the prospective vaccine candidates prior to any wet lab experimentations (Naz et al., 2015). One of the key limitation is that this strategy is primarily focused on prediction of peptide epitopes based on amino acid sequences of the proteins. Hence, the long known immunogenic potential of nonprotein antigens (i.e., Lipopolysaccharides) couldn’t be accounted in this strategy (Lüderitz et al., 1982 McGhee et al., 1980 Del Barrio et al., 2015). But the addition of such known epitopes as adjuvants is a good approach for overcoming this limitation (Caucheteux et al., 2017 Noguchi et al., 2017). Another prominent limitation could be the high mutation rate of the viral surface proteins (Steinhauer & Holland, 1987 Echave, Spielman & Wilke, 2016). The prospects of reverse vaccinology approach have been discussed in detail in our previous study (Rashid et al., 2017).

Peptide vaccines theoretically have several advantages over conventional and recently developed DNA vaccines (Ingolotti et al., 2010). Lesser cost and convenient synthesis with improved safety and stability are the key features which have been demonstrated in various studies (Firbas et al., 2006 Jagannath et al., 2009). Conventional vaccines are overburdened with unnecessary antigens which divert immune response resources thus might result in a chaos which lacks the required dedicated for eliminating the threat thus impedes the vaccine efficacy (Czerkinsky & Holmgren, 2015). As in case of cholera, whole cell vaccines were only able to impart varying protective efficiency (39–60%) in studies conducted in Bangladesh and Vietnam (Clemens et al., 1990 Thiem et al., 2006). While live attenuated vaccine was unsuccessful in generating long term protective response (Fournier, 1998). One interesting inconsistency is the comparative efficacy of cholera vaccines in developed and developing countries (Czerkinsky & Holmgren, 2009), while a notable recent exception was observed in South Sudan (Bekolo et al., 2016). Considering these factors, the need for novel strategy is vital to achieve protection against this pathogen.

Reported prioritized targets included lipoprotein NlpD, outer membrane protein OmpU, accessory colonization factor AcfA, putative porin, and outer membrane protein OmpW. These predicted proteins are involved in important virulence mechanisms of V. cholerae. Role of lipoprotein NlpD, has been studied in reference to cell division and intestinal colonization by the pathogen. Septal peptidoglycan (PG) amidase, AmiB is involved in separation of daughter cells at the end of cell division process (Yakhnina, McManus & Bernhardt, 2015). AmiB is regulated by NlpD en V. cholerae (Möll et al., 2014). Both of these processes are important for pathogen’s survival in host intestine. Another predicted potential target accessory colonization factor AcfA is of peculiar interest as it has been subjected to edible vaccine (Sharma et al., 2008). Orientación NlpD y AcfA could provide passive therapeutic potential as immune inactivation would impede the pathogen’s ability to colonize and multiply in the small intestine.

Among these vaccine candidates, we obtained two outer membrane proteins (OMPs), OmpU and OmpW that also serve as antibiotic resistance determinants. In vibrio species OMPs are studied to play vital roles as porins in iron, phosphate and sugar acquisition as well as in bacterial attachment to solid surfaces (Aeckersberg et al., 2001). Tiempo OmpU has been reported to be involved in conferring polymyxin B sulfate resistance (Mathur & Waldor, 2004). We consider OmpU as an important vaccine candidate selected via our computational framework as it is not only involved in host cell invasion but also confers antibiotic resistance (Duperthuy et al., 2011). Moreover, it has also been used as an effective vaccine candidate in other vibrio species such as V. alginolyticus y V. harveyi en Lutjanus erythropterus y Scophthalmus maximus, respectively (Cai et al., 2013 Wang et al., 2011). Such studies provide good examples of how a reverse vaccinology strategy can be used for systematic vaccine design against drug resistant microbial pathogens.

Another important predicted potential vaccine candidate is OmpW. It’s a characteristic outer membrane protein expressed by V. cholerae and has been used to identify infectious agent via different PCR based detection techniques. Studies have reported this protein to be conserved and harbors immunogenic properties (Nandi et al., 2005 Jalajakumari & Manning, 1990). Considering its abilities, OmpW could be a good candidate for developing a broad spectrum and effective vaccine.

Interestingly, when we analyzed our screened results with a recent antibody profiling study of the V. cholerae O1 protein immunome, nine overlapping antigens were observed (Charles et al., 2017). These antigens were: Organic solvent tolerance protein (VC0446), outer membrane protein OmpU (VC0633), toxin co-regulated pilin (VC0828), outer membrane protein OmpV (VC1318), neuraminidase (VC1784), hemolysin-related protein (VC1888), and flagellar proteins/components (VC2142, VC2143, VC2187). Among these nine, outer membrane protein OmpU (VC0633) was common in the most effective antigens reported in the final selection of the both studies. While toxin co-regulated pilin (VC0828) was among our initial screening list but it is reported as one of the most effective by Charles et al. (2017). One possible reason of the screening results could be the difference in the adopted screening strategies. Our strategy was purely computational, with the calculations all derived using only the peptide sequences of the proteins. A shortcoming to this is that it could only be applied for peptide antigens, while on the other hand antigens other than proteins do have their immuno-protective potential i.e., the O polysaccharide, LPS, etc. These overlapping proteins in the two investigations provide confidence to our prediction.


Present address: The 306th Hospital of PLA, Beijing, 100101, China

Present address: CAS key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101, China

Afiliaciones

The 306th Hospital of PLA, Beijing, 100101, China

Yong Yi, Liping Jia, Hua Jing, Hu Xia & Yan Cui

CAS key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, 100101, China

Na Lu, Fei Liu, Jing Li, Ruifen Zhang, Baoli Zhu & Yongfei Hu

Beijing Key Laboratory of Microbial Drug Resistance and Resistome, Beijing, 100101, China

Na Lu, Fei Liu, Jing Li, Ruifen Zhang, Baoli Zhu & Yongfei Hu

Department of Obstetrics and Gynecology, Peking Union Medical College Hospital, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, 100730, China


Fondo

Identification of conserved protein domains that span a wide range of biological functions provide deep insights regarding the origin and evolution of complex biological systems, These versatile conserved domains often have catalytic or structural roles that can be utilized, with small variations, in different contexts. The P-loop-containing nucleotide phosphatase fold represents one such catalytic domain that is utilized in almost every conceivable biological system in all the three superkingdoms of life [1,2]. Folds such as the SH3-like barrels, the PAS-like fold, the OB fold, the double-stranded β-helix, the β-propeller and rubredoxin-like zinc ribbons are predominantly non-catalytic domains that are widely represented in multiple functional contexts, with roles such as small-molecule binding, nucleic-acid binding and interaction with other proteins [3,4,5] (see also the SCOP [6] and CATH [7] databases). Versatile globular domains appear to have emerged fairly early in evolution in various fold classes, such as the α/β or α+β mixed folds, or the all-α and all-β folds [5,8]. Comparative genomics and evolutionary studies indicate that many of these versatile folds probably emerged in contexts related to RNA binding in the ancient translation system and were subsequently re-utilized in other biological systems [9,10].

Of particular interest in this context are the small all-β folds that assume conformations such as barrels or β-helices [3,4]. These structures have considerable potential for functional versatility, because they are able either to accommodate small molecules within cavities formed by the curved β-sheets or to interact with various larger molecules, especially nucleic acids or proteins, via the external surfaces of the sheets. A few ancient and widespread β-rich folds such as the SH3-like barrel and the OB fold appear to have colonized multiple functional niches early in evolution, although their earliest versions may have had roles related to RNA metabolism [9,11,12,13]. We were interested in identifying other such functionally versatile β-rich folds that could be traced back to the early stages of life's evolution. The availability of extensive genome sequence data and advances in structure determination over recent years allow the successful application of comparative genomics, sequence and structure comparisons to identify any such folds that may be somewhat less widely represented than the OB or SH3-like folds.

Here, we identify one such β-barrel fold typified by the globular domain of the H subunit of the photosynthetic reaction center (PRC-H) from purple proteobacteria such as Rhodopseudomonas viridis [14,15]. The purple bacterial photosynthetic reaction center consists of three primary subunits, of which PRC-L and PRC-M primarily bind the pigments involved in photochemistry, whereas PRC-H appears to be a key regulator of electron transfer between the quinones in photosynthetic reaction centers [16]. So far, homologs of the H subunit have only been found in photosynthetic proteobacteria [17,18,19] and the carboxy-terminal globular domain of PRC-H shows a distinct β-barrel fold that is structurally unrelated to other characterized β-barrels. This raises the important question of the evolutionary provenance of this unique domain. Here we use sequence-profile analysis and comparative genomics to show that the β-barrel domain of PRC-H defines a novel, widespread superfamily of β-barrel domains that is represented in several bacterial, plant and archaeal genomes. We also show that this β-barrel domain is found in the conserved protein RimM, which is involved in RNA processing and ribosomal assembly in the course of translation. Thus we provide evidence for an unexpected evolutionary connection between RNA metabolism, translation and the redox reactions in photosynthesis in the form of a shared functionally versatile β-barrel domain.


Discusión

The genomic island of V. parahaemolyticus TS 8-11-4 was deemed a PAI due to the presence of virulence genes on this island, despite its environmental origin (Schmidt and Hensel 2004 Hasan et al. 2010 Dobrindt et al. 2004). The thermostable direct hemolysin gene (tdh) was found on this island, as well as genes involved in the type three secretion system II (T3SS2). Ambos tdh gene and T3SS2 complex are the two major virulence factors implicated in V. parahaemolyticus pathogenesis (Makino et al. 2003 Park et al. 2004 Yanagihara et al. 2010). A collagenase gene was found on the island collagenase is thought to be involved in V. parahaemolyticus virulence (Gode-Portratz et al. 2011). The genomic island of V. parahaemolyticus strain TS-8-11-4 is a PAI, and more specifically, because it contains tdh and T3SS2 genes, we designate this island as a VPAI-7 (VPaIα or tdhVPA) (Makino et al. 2003 Sugiyama et al. 2008 Xu et al. 2017).

Four genes involved in capsule production, as well as one integrase gene, and a Na + /H + antiporter (nhaA) were also found on this PAI. Capsules aid pathogens in evasion of host immune defenses, establishing infections, and survival in harsh environments, such as the stomach. V. parahaemolyticus virulence is correlated with capsule production (Broberg et al. 2011 Letchumanan et al. 2014). One capsule gene had high homology with Gram positive capsule production genes. This is interesting because vibrios are Gram negative organisms, so this gene may have been acquired laterally. An integrase gene was found near the center of the island. Integrase genes are associated with PAIs and function to integrate foreign DNA into the genome (Hacker and Kaper 2000). Usually VPAI-7 does not contain an integrase gene, but a few transposon genes instead (Ceccarelli et al. 2013). Finally, we determined that a nhaA gene is located on this genomic island. nhaA genes encode Na + /H + antiporters, which transport ions to balance pH. Na + /H + antiporters aid V. cholerae in environmental persistence (Vimont and Berche 2000) and are essential for Yersinia pestis virulence (Minato et al. 2013).

Similar a V. parahaemolyticus, the two islands found for the V. vulnificus WR-2-BW strain are characterized as PAIs due to the presence of virulence genes and virulence-related genes. Two of these genes had virulence-related functions, a putative LPS biosynthesis protein gene and an O-antigen flippase wzx gene. These genes are virulence-associated factors, as they do not directly cause host cell damage, but they do contribute to pathogenesis, aiding in the establishment of infections. Lipopolysaccharide (LPS) is a main component of the outer membrane of Gram negative bacteria, and is a known pyrogen (fever-producing agent) (McPherson et al. 1991 Jones and Oliver 2009). Phylogenies show that the LPS biosynthesis protein gene from V. vulnificus WR-2-BW was closely related to an LPS biosynthesis protein gene from a Vibrio coralliilyticus especies. The O-antigen flippase wzx gene is part of the major class of O-antigen gene clusters, and it encodes a hydrophobic protein with 12 potential transmembrane segments (Liu et al. 1996).

A cytolysin secretion gene, vvhB, was found also found on the 143 kbp V. vulnificus isla. Cytolysins lyse erythrocytes by forming small pores in the cytoplasmic membrane or binding to cholesterol to interrupt potassium and sodium ion channels (Choi et al. 2002). En V. vulnificus, the expression and mechanism of cytolysins vvhA y vvhB are not fully understood, however, they are both believed to play a role in pathogenicity (Choi et al. 2002). They are homologous to a known V. cholerae El Tor hemolysin (Choi et al. 2002 Yamamoto et al. 1990). Phylogenies show that the vvhB gene in the V. vulnificus WR-2-BW strain was 99% identical to other V. vulnificus vvhB genes from other strains.

Other genes of interest on the 143 kbp PAI include a chitinase gene, tldD/tldE proteolytic complex genes, and type IV secretory pathway components. En Escherichia coli, it was shown that the TldD and TldE proteins could be involved in regulating gyrase function as well as aiding in proteolytic activity (Allali et al. 2002). The chitinase gene had a 99% blast identity score to the chitinase gene found in the V. vulnificus YJ016 strain however, the chitinase gene in YJ016 is located on the first chromosome and WR-2-BW’s chitinase gene is located in the second chromosome. Chitinous exoskeletal materials of invertebrates can be a source of carbon and nitrogen for bacteria vibrios in particular have a well-known association with marine copepods (Kaneko and Colwell 1975 Lovell 2017). V. cholerae has a well-studied association with copepods, which commonly serve as a vector of cholera infections in Bangladesh water systems (Tamplin et al. 1990). Chitinase has been identified as part of the mechanism for adsorption and attachment to copepods, which relates to its ability to colonize its host and degrade the host exoskeleton, increasing the overall ecological fitness of the vibrios (Huq et al. 1983 Nalin et al. 1979 Bhowmick et al. 2006).

Vibrio diabolicus had a large genomic island that did not contain any virulence factors or virulence associated genes, which we defined as a fitness island, as it contained genes that would aid the organism in persistence in the environment. Toxin–antitoxin (TA) systems are found either on plasmids, genomic islands, or within the chromosome and are made up of closely linked toxin and antitoxin genes. The encoded labile antitoxin protects the host from the stable toxin, while competitor cells that do not have the TA system (and respective antitoxin) are eliminated (Hayes 2003 Van Melderen and Saavedra 2009). Sometimes TA systems are referred to as “addiction modules” because the host cell is dependent on the antitoxin (Van Melderen and Saavedra 2009). The toxin and respective antitoxin loci are usually found neighboring each other, often overlapping (Hayes 2003). Seven type II TA toxins were found on JBS-8-11-1’s fitness island, along with their neighboring respective antitoxins. Type I TAs include RNA antitoxins, while type II TAs have protein antitoxins (Hayes 2003). los relE, yafQ, y yoeB toxin genes encode mRNA interferase endoribonucleases all three of these toxin genes were detected on this fitness island. los Doc toxin gene (death on curing) inhibits translation by blocking translation elongation at the 30S ribosomal subunit (Lui et al. 2008) three copies of the Doc toxin gene and three copies of its antitoxin partner gene, phd (prevent host death) were found on JBS-8-11-1’s fitness island. Doc toxin genes and phd antitoxin genes are widespread in vibrios and were also found on V. parahaemolyticus strain TS-8-11-4’s PAI as well as V. vulnificus strain WR-2-BW’s PAI (Fig. 2).

Maximum-likelihood phylogeny (Kimura 2-parameter model) of Doc toxin genes and phd antitoxin genes. Bold indicates sequences obtained from this study. The bootstrap values represent 1000 replications, and values of less than 50 are not shown. The reference sequences were acquired from NCBI GenBank

Lateral gene transfer in environmental strains

PAIs are present in environmental Vibrio strains and are most likely acquired via lateral gene transfer. All four of the islands described here have significant lower GC content than the rest of the genome, providing evidence that these islands originated from a foreign source and were transferred into these genomes relatively recently. Additional evidence includes mobile genetic elements, such as phage and plasmid genes, integrases, and transposons. Virulence loci on VPAI-7 have been detected in environmental species that do not cause human infections: Vibrio mimicus, Vibrio harveyi, y Vibrio natriegens (Gennari et al. 2011 Klein et al. 2014). Clearly, lateral transfer of individual virulence loci and/or entire PAIs is occurring between and among environmental vibrios. It is well documented that V. cholerae enters a natural competency state in the presence of chitin or under low-nutrient conditions (Hazen et al. 2010 Metzger and Blokesch 2016) however, less is known about uptake of exogenous DNA by other Vibrio especies. Further studies examining the rates of lateral transfer among vibrios in the environment are needed. Vibrios survive, persist and can undergo rapid population expansions (bloom) in coastal ecosystems. Consequently, the pathogenicity loci (and potential of said loci to be transferred laterally) of naturally occurring environmental strains are clearly important.


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