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La función de corrección de las polimerasas de coronavirus

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Escuché que la familia Coronavirus tiene una función de corrección y edición en sus enzimas polimerasas que pueden reconocer y eliminar mutaciones. Obviamente, esto es desastroso para la población de personas infectadas. ¿Es esto cierto y, de ser así, sería posible eliminar la subunidad de corrección de pruebas y edición de forma selectiva para que la carga mutacional aumentara progresivamente en la población viral? ¿Podría esto conducir a algo como el Trinquete de Muller y atenuar la virulencia en la población o todavía habría un mecanismo para eliminar los virus mutados de la población y retener la virulencia a lo largo del tiempo?


Muchos en la comunidad científica se han movilizado para comprender el virus que está causando la pandemia de la enfermedad mundial del coronavirus 2019 (COVID-19). Gao et al. centrado en un complejo que juega un papel clave en el ciclo de replicación y transcripción del virus. Utilizaron microscopía crioelectrónica para determinar una estructura de resolución de 2.9 angstrom de la ARN polimerasa nsp12 dependiente de ARN, que cataliza la síntesis de ARN viral, en complejo con dos cofactores, nsp7 y nsp8. nsp12 es un objetivo para los inhibidores antivirales análogos de nucleótidos como el remdesivir, y la estructura puede proporcionar una base para diseñar nuevas terapias antivirales.

Un nuevo brote de coronavirus [síndrome respiratorio agudo severo – coronavirus 2 (SARS-CoV-2)] ha provocado una pandemia mundial de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), que ha provocado decenas de miles de infecciones y miles de muertes en todo el mundo. La ARN polimerasa dependiente de ARN [(RdRp), también denominada nsp12] es el componente central de la replicación coronaviral y la maquinaria de transcripción, y parece ser un objetivo principal del medicamento antiviral remdesivir. Divulgamos la estructura de microscopía crioelectrónica del virus COVID-19 nsp12 de longitud completa en un complejo con los cofactores nsp7 y nsp8 a una resolución de 2.9-angstrom. Además de la arquitectura conservada del núcleo de la polimerasa de la familia de la polimerasa viral, nsp12 posee un dominio de horquilla β recientemente identificado en su extremo N terminal. Un modelo de análisis comparativo muestra cómo remdesivir se une a esta polimerasa. La estructura proporciona una base para el diseño de nuevas terapias antivirales que se dirigen a la RdRp viral.

La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es causada por un nuevo coronavirus [síndrome respiratorio agudo severo – coronavirus 2 (SARS-CoV-2)] que surgió en diciembre de 2019 (13) y desde entonces se ha convertido en una pandemia mundial. Se informa que el virus COVID-19 es un nuevo miembro del género betacoronavirus y está estrechamente relacionado con el síndrome respiratorio agudo severo-coronavirus (SARS-CoV) y varios coronavirus de murciélago (4). En comparación con el SARS-CoV y el síndrome respiratorio de Oriente Medio-coronavirus (MERS-CoV), el virus COVID-19 exhibe una transmisión más rápida de persona a persona, lo que llevó a la Organización Mundial de la Salud a declarar una emergencia de salud pública mundial (1, 2).

Los coronavirus (CoV) emplean una maquinaria de múltiples subunidades para la replicación y la transcripción. Un conjunto de proteínas no estructurales (nsps) producidas como productos de escisión de las poliproteínas virales ORF1a y ORF1ab (5) se ensambla para facilitar la replicación y transcripción viral. Un componente clave, la ARN polimerasa dependiente de ARN [(RdRp), también conocida como nsp12], cataliza la síntesis de ARN viral y, por lo tanto, desempeña un papel central en el ciclo de replicación y transcripción del virus COVID-19, posiblemente con la ayuda de nsp7 y nsp8 como cofactores (6). Por lo tanto, nsp12 se considera un objetivo principal para los inhibidores antivirales análogos de nucleótidos como remdesivir, que muestra potencial para el tratamiento de infecciones virales COVID-19 (7, 8). Para informar el diseño del fármaco, determinamos la estructura de nsp12, en complejo con sus cofactores nsp7 y nsp8, mediante microscopía crioelectrónica (crio-EM) utilizando dos protocolos diferentes: uno en ausencia de ditiotreitol (DTT) (conjunto de datos 1) y el otro en presencia de TDT (conjunto de datos 2).

El virus COVID-19 de longitud completa expresado en bacterias nsp12 (residuos S1 a Q932) se incubó con nsp7 (residuos S1 a Q83) y nsp8 (residuos A1 a Q198), y luego se purificó el complejo (figura S1). Se prepararon rejillas Cryo-EM utilizando este complejo, y el cribado preliminar reveló una excelente densidad de partículas con buena dispersión. Después de la recolección y el procesamiento de 7994 películas de micrografías, obtuvimos una reconstrucción tridimensional con resolución de 2.9 Å de un monómero nsp12 en complejo con un par nsp7-nsp8 y un monómero nsp8, como se observó previamente para el SARS-CoV (9). Además del complejo nsp12-nsp7-nsp8, también observamos clases de partículas individuales correspondientes al dímero nsp12-nsp8, así como monómeros nsp12 individuales, pero estos no producen reconstrucciones de resolución atómica (fig. S2). Sin embargo, la reconstrucción compleja nsp12-nsp7-nsp8 proporciona la información estructural para un análisis estructural completo.

La estructura del virus COVID-19 nsp12 contiene un dominio RdRp derecho (residuos S367 a F920) y un dominio de extensión N-terminal específico de nidovirus (residuos D60 a R249) que adopta una nucleotidiltransferasa asociada a nidovirus RdRp (NiRAN) (10) arquitectura. El dominio de polimerasa y el dominio NiRAN están conectados por un dominio de interfaz (residuos A250 a R365) (Fig. 1, A y B). Una horquilla β N-terminal adicional (residuos D29 a K50), construida con la guía de un mapa crio-EM inequívoco (fig. S3A), se inserta en la ranura sujeta por el dominio NiRAN y el subdominio de la palma en el dominio RdRp (Fig. .2). El par nsp7-nsp8 muestra una estructura conservada similar a la del par SARS-CoV nsp7-nsp8 (9, 11). La orientación de la hélice N-terminal del monómero nsp8 separado unido a nsp12 se desplaza en comparación con la del par nsp7-nsp8 (figura S4A). Los 13 residuos de aminoácidos adicionales resueltos en el N-terminal de nsp8 muestran que el eje largo de su conocida forma de palo de golf está doblado (fig. S4B).

(A) Organización del dominio del virus COVID-19 nsp12. Los bordes entre dominios están etiquetados con números de residuo. La porción N-terminal sin densidad de mapa crio-EM y los residuos C-terminal que no se pueden observar en el mapa no se incluyen en la asignación. Los motivos de polimerasa se colorean como sigue: motivo A, motivo amarillo B, motivo rojo C, motivo verde D, motivo violeta E, motivo cian F, azul y motivo G, marrón claro. (B) Diagrama de cinta de la cadena polipeptídica nsp12 del virus COVID-19 en tres vistas perpendiculares. Los dominios tienen el mismo color que en (A). El nsp8 individual (nsp8-1) unido a nsp12 y el del par nsp7-nsp8 (nsp8-2) se muestran en gris, el nsp7 está en rosa. El panel inferior izquierdo muestra una descripción general de la reconstrucción crio-EM del complejo nsp12-nsp7-nsp8.

(A) Estructura general del dominio NiRAN N-terminal y horquilla β del virus COVID-19 nsp12. El dominio NiRAN N-terminal y la horquilla β del virus COVID-19 nsp12 se muestran como dibujos animados amarillos y cian, respectivamente, mientras que las otras regiones del virus COVID-19 nsp12 se muestran como una superficie molecular con el mismo esquema de color utilizado en la Fig. 1. El dominio NiRAN de SARS-CoV nsp12 se superpone a su contraparte en el virus COVID-19 nsp12 y se muestra en violeta. (B) Interacciones clave entre la horquilla β y otros dominios. La horquilla β se muestra como un tubo cian con sus residuos clave en modo de barra. Estos tienen los contactos más cercanos con otros dominios del virus COVID-19 nsp12. Los residuos que interactúan en el subdominio de la palma y los dedos del dominio RdRp y el dominio NiRAN se identifican mediante las etiquetas. Las abreviaturas de una sola letra para los residuos de aminoácidos son las siguientes: A, Ala C, Cys D, Asp E, Glu F, Phe G, Gly H, His I, Ile K, Lys L, Leu M, Met N, Asn P , Pro Q, Gln R, Arg S, Ser T, Thr V, Val W, Trp e Y, Tyr.

La arquitectura general del complejo nsp12-nsp7-nsp8 del virus COVID-19 es similar a la del SARS-CoV con un valor de la desviación cuadrática media (RMSD) de 0,82 para 1078 átomos de Cɑ (fig. S4C). Sin embargo, hay características clave que los distinguen. El mapa crio-EM nos permitió construir la estructura completa del virus COVID-19 nsp12, incluidos todos los residuos excepto S1 a D3 y G897 a D910. Por el contrario, los primeros 116 residuos no se resolvieron en SARS-CoV nsp12 (9). La porción del dominio NiRAN resuelto en SARS-CoV (residuos 117 a 249) se compone de seis hélices con una hoja β de tres hebras en el extremo N (9) (Figura 2A). En la estructura del virus COVID-19, resolvimos adicionalmente los residuos A4 a R118. Estos constituyen un bloque estructural con cinco hebras β antiparalelas y dos hélices. Los residuos N215 a D218 forman una cadena β en el virus COVID-19 nsp12, mientras que estos residuos están menos ordenados en el SARS-CoV nsp12. Esta región entra en contacto con la hebra que incluye los residuos V96 a A100, contribuyendo así a la estabilización de su conformación. Como resultado, estas cuatro hebras forman una arquitectura compacta de barril semi-β. Por lo tanto, identificamos los residuos A4 a T28 e Y69 a R249 como el dominio NiRAN coronaviral completo. Con la resolución de los residuos N-terminales, también podemos identificar una horquilla β N-terminal (D29 a K50 Figs. 1A y 2A). Esta horquilla β se inserta en la ranura sujeta por el dominio NiRAN y el subdominio de la palma en el dominio RdRp y forma un conjunto de contactos estrechos para estabilizar la estructura general (Fig. 2B y Fig. S5). También hemos observado que C301 a C306 y C487 a C645 forman enlaces disulfuro en ausencia de DTT (conjunto de datos 1). Sin embargo, en presencia de DTT (conjunto de datos 2), los iones de zinc quelados están presentes en la misma ubicación que la observada en el SARS-CoV (fig. S3B).

El dominio de la polimerasa adopta la arquitectura conservada de la familia de la polimerasa viral (12) y se compone de tres subdominios: un subdominio de dedos (residuos L366 a A581 y K621 a G679), un subdominio de palma (residuos T582 a P620 y T680 a Q815) y un subdominio de pulgar (residuos H816 a E920) (Fig.1 ). Los iones metálicos catalíticos, que se observan en varias estructuras de polimerasas virales que sintetizan ARN (13, 14), no se observan en este trabajo en ausencia de ARN plantilla de cebador y nucleósidos trifosfatos (NTP).

El sitio activo del dominio RdRp del virus COVID-19 está formado por los motivos de polimerasa conservados A a G en el dominio de palma y configurado como otras ARN polimerasas (figuras 1A y 3A y figura S6). El motivo A, compuesto de los residuos 611 a 626 (TPHLMGWDYPKCDRAM), contiene el residuo clásico de unión a cationes divalentes D618, que se conserva en la mayoría de las polimerasas virales, incluido el virus de la hepatitis C (VHC) ns5b (residuo D220) y el poliovirus (PV) 3D pol (residuo D233) (13, 14) (Fig. 3, B y C). El motivo C [residuos 753 a 767 (FSMMILSDDAVVCFN)] contiene los residuos catalíticos [759 a 761 (SDD)] en el turno entre dos cadenas β. Estos residuos catalíticos también se conservan en la mayoría de RdRps virales, por ejemplo, 317 a 319 (GDD) en HCV ns5b y 327 a 329 (GDD) PV 3D pol, siendo el primer residuo serina o glicina.

(A para C) Comparación estructural del virus COVID-19 nsp12 (A), HCV ns5b (ID de PDB: 4WTG) (13) (B) y PV 3D pol (ID PDB: 3OLB) (14) (C). Las tres estructuras se muestran con la misma orientación. Los motivos de la polimerasa (motivos A a G) tienen el mismo esquema de color utilizado en la Fig. 1A. (D) Las rutas de entrada de plantilla, entrada NTP y salida híbrida del producto en el virus COVID-19 nsp12 están etiquetadas en colores pizarra, verde azulado intenso y naranja, respectivamente. Dos iones catalíticos de manganeso (esferas negras), pp-sofosbuvir (esferas de color verde oscuro para átomos de carbono) y plantilla de cebador (naranja) de la estructura de HCV ns5b en el complejo pp-sofosbuvir (ID de PDB: 4WTG) (13) se superponen al virus COVID-19 nsp12 para indicar el sitio catalítico y la posición de unión del nucleótido.

En esta estructura, como en otras ARN polimerasas, las rutas de entrada cebador-plantilla, entrada NTP y salida de la hebra naciente están cargadas positivamente y son accesibles al solvente, y convergen en una cavidad central donde los motivos RdRp median la síntesis de ARN dirigida por plantilla (Fig. . 3D). Las configuraciones de las rutas de entrada plantilla-cebador, el canal de entrada NTP y la ruta de salida de la hebra naciente son similares a las descritas para el SARS-CoV y para otras ARN polimerasas, como la polimerasa VHC y PV (14) (Fig. 3, B y C). El canal de entrada de NTP está formado por un conjunto de residuos hidrófilos, incluidos K545, R553 y R555 en el motivo F. Se espera que la plantilla de ARN entre en el sitio activo compuesto por los motivos A y C a través de un surco sujeto por los motivos F y G. El motivo E y el subdominio del pulgar apoyan la hebra del cebador. El híbrido producto-plantilla sale del sitio activo a través del túnel de salida de ARN en la parte frontal de la polimerasa.

Remdesivir, el único isómero Sp del profármaco fosforamidato de L-alaninato de 2-etilbutilo (15) (fig. S7), se ha informado que inhibe la proliferación del virus COVID-19 y, por lo tanto, tiene potencial clínico (7, 8). Discutiremos brevemente su posible mecanismo de unión e inhibición sobre la base de los resultados de este estudio. La eficacia de los análogos de nucleótidos que terminan la cadena requiere que las RdRps virales reconozcan e incorporen con éxito la forma activa de los inhibidores en la cadena de ARN en crecimiento. El sofosbuvir (monofosfato de 2′-F-2′-C-metiluridina) es un profármaco que se dirige al VHC ns5b y ha sido aprobado para el tratamiento de la infección crónica por VHC (16). Actúa uniéndose al sitio catalítico de la polimerasa ns5b del VHC (12, 16). Dado que remdesivir y sofosbuvir son análogos de nucleótidos y dada la conservación estructural del sitio catalítico entre el virus COVID-19 nsp12 y la polimerasa HCV ns5b (13, 16) (Fig. S7), modelamos la unión de difosfato de remdesivir al virus COVID-19 nsp12 sobre la base de la superposición con sofosbuvir unido a HCV ns5b (Fig. 4A y Fig. S4D). En general, encontramos que el nsp12 del virus COVID-19 tiene la mayor similitud con el estado apo de ns5b. Dados los cambios conformacionales de ns5b en apo, alargamiento y estados inhibidos, parece que los residuos catalíticos D760, D761 y el clásico D618 sufrirán un cambio conformacional para coordinar los cationes divalentes (Fig. 4B). Este último anclará el grupo fosfato del nucleótido o inhibidores entrantes junto con el alostérico R555 en el motivo F (Fig. 4C). En las estructuras del complejo de elongación de HCV ns5b o su complejo con sofosbuvir difosfato (pp-sofosbuvir), una característica clave es que el pp-sofosbuvir incorporado interactúa con N291 (equivalente a N691 en el virus COVID-19). Sin embargo, debido a una sustitución de flúor en su resto de azúcar, el pp-sofosbuvir no es capaz de unirse a la red de enlaces de hidrógeno con S282 y D225 (Fig. 4D), lo cual es necesario para estabilizar el nucleótido natural entrante (13). Sin embargo, remdesivir mantiene intacto un grupo ribosa, por lo que puede utilizar esta red de enlaces de hidrógeno como un sustrato nativo. Además, es probable que T680 en el virus COVID-19 nsp12 también forme enlaces de hidrógeno con el hidroxilo 2 'de remdesivir y, por supuesto, con el NTP natural entrante (Fig. 4D). Además, es probable que la cadena lateral hidrófoba de V557 en el motivo F se apile y estabilice la base de uridina de ARN de plantilla +1 al par de bases con el trifosfato entrante remdesivir (ppp-remdesivir) (Fig. 4E).

(A) Los motivos de la polimerasa están coloreados como en la Fig. 3. Superposición de la estructura de HCV ns5b en complejo con pp-sofosbuvir (ID de PDB: 4WTG) (13) con el virus COVID-19 nsp12 muestra las posibles posiciones de los dos iones catalíticos (esferas púrpuras), el nucleótido cebador (U 0), la hebra molde y el pp-remdesivir entrante en nsp12. (B para mi) Comparación de estructura de HCV apo ns5b o su complejo con UDP y pp-sofosbuvir con el virus COVID-19 nsp12.

La rápida propagación mundial del virus COVID-19 ha enfatizado la necesidad de desarrollar nuevas vacunas y terapias contra el coronavirus. La polimerasa viral nsp12 parece ser un objetivo excelente para nuevas terapias, especialmente dado el hecho de que los inhibidores de plomo ya existen en forma de compuestos como el remdesivir. Teniendo en cuenta la similitud estructural de los análogos de nucleósidos, el modo de unión y el mecanismo de inhibición discutidos aquí también pueden ser aplicables a otros fármacos similares o candidatos a fármacos como el favipiravir, que ha demostrado ser eficaz en ensayos clínicos (17). Este objetivo, además de otros objetivos farmacológicos prometedores, como la proteasa principal, podría apoyar el desarrollo de un cóctel de tratamientos anti-coronavirus que potencialmente se pueden utilizar para el descubrimiento de antivirales de amplio espectro.


El coronavirus está mutando. Pero eso puede no ser un problema para los humanos

Una imagen coloreada de células de un paciente infectado con el coronavirus SARS-CoV-2. Las partículas de virus son de color rosa. La imagen fue capturada a partir de una micrografía electrónica de barrido. NIAID / Flickr ocultar leyenda

Una imagen coloreada de células de un paciente infectado con el coronavirus SARS-CoV-2. Las partículas de virus son de color rosa. La imagen fue capturada a partir de una micrografía electrónica de barrido.

A medida que el nuevo coronavirus continúa propagándose por todo el mundo, los investigadores dicen que el virus está cambiando ligeramente su composición genética. ¿Pero eso significa que se está volviendo más peligroso para los humanos? ¿Y cuál sería el impacto en las futuras vacunas?

"En el sentido literal de 'está cambiando genéticamente', la respuesta es absolutamente sí", dice Marc Lipsitch, epidemiólogo de enfermedades infecciosas de la Universidad de Harvard. "Lo que está en cuestión es si ha habido algún cambio que sea importante para el curso de la enfermedad o la transmisibilidad u otras cosas que nos preocupan a los seres humanos".

Hasta ahora, "no hay evidencia creíble de un cambio en la biología del virus para bien o para mal", dice Lipsitch.

Los coronavirus, como todos los virus, cambian pequeñas partes de su código genético todo el tiempo.

"Los virus mutan naturalmente como parte de su ciclo de vida", dice Ewan Harrison, gerente de proyectos científicos del COVID-19 Genomics UK Consortium, un nuevo proyecto que rastrea el virus en el Reino Unido.

Como la gripe y el sarampión, el coronavirus es un virus de ARN. Es un paquete microscópico de instrucciones genéticas empaquetadas en una capa de proteína. Cuando un virus infecta a una persona, la cadena de instrucciones genéticas permite que el virus se propague indicándole cómo replicarse una vez que ingresa a una célula. El virus hace copias de sí mismo y las expulsa a otras células del cuerpo. Las dosis infecciosas del virus pueden toserse en gotitas y otras personas pueden inhalarlas.

Inevitablemente, los virus "cometen errores en sus genomas" cuando se copian a sí mismos, dice Harrison. Esos cambios pueden acumularse y trasladarse a futuras copias del virus. Los investigadores están utilizando estos pequeños cambios acumulativos para rastrear la ruta del virus a través de grupos de personas.

Hasta ahora, los investigadores que están rastreando los cambios genéticos en el SARS-CoV-2, el nombre oficial del coronavirus, dicen que parece relativamente estable. Adquiere alrededor de dos mutaciones al mes durante este proceso de propagación, dice Harrison, alrededor de un tercio a la mitad de la tasa de la gripe.

Los coronavirus se diferencian de los virus de la gripe en otra forma clave que reduce el número de mutaciones. Corrigen sus propios genomas cuando se copian a sí mismos, eliminando las cosas que no parecen correctas. "Mantienen esta capacidad de mantener su genoma prácticamente intacto", dice Vineet Menachery, virólogo de la Rama Médica de la Universidad de Texas. "Las mutaciones que incorporan son relativamente raras".

Esta función adicional de corrección de pruebas significa que los coronavirus también son uno de los virus de ARN más grandes. Tienen unos 30.000 nucleótidos de largo, el doble del tamaño de los virus de la gripe. Pero con 125 nanómetros de ancho, todavía son microscópicos, 800 de ellos podrían caber en el ancho de un cabello humano.

No obstante, su tamaño relativamente mayor significa que "tienen muchas más herramientas en su cinturón de herramientas" en comparación con otros virus de ARN, dice Menachery; en otras palabras, más capacidad para combatir el sistema inmunológico de un huésped y hacer copias de sí mismos.

Los investigadores están atentos a los cambios que podrían afectar el comportamiento del coronavirus en los seres humanos. Por ejemplo, si el coronavirus desarrolló formas de bloquear partes de nuestro sistema inmunológico, podría esconderse en nuestros cuerpos y establecerse mejor. Si evolucionara para unirse con más fuerza a las células humanas, podría ingresar a ellas de manera más eficiente y replicarse más rápidamente.

Pero no es como si el coronavirus necesitara volverse más potente para sobrevivir y prosperar. Ya se está replicando en todo el mundo con mucho éxito, dice Justin Bahl, biólogo evolutivo de la Universidad de Georgia. "Los virus en sí mismos no están en realidad bajo mucha presión para cambiar".

Las presiones selectivas podrían provenir de la introducción de tratamientos y vacunas que sean efectivos contra un grupo reducido de cepas de coronavirus. Si eso sucede, es probable que proliferen las cepas que no son el objetivo de estas medidas.

Los pequeños cambios genéticos que los investigadores han observado hasta ahora no parecen cambiar la función del virus. "No creo que vayamos a ver nuevos rasgos importantes, pero sí creo que veremos surgir diferentes variantes en la población", dice Bahl.

Y esa tasa de cambio más lenta es potencialmente una buena noticia para los tratamientos y las vacunas. Los investigadores creen que una vez que una persona obtiene inmunidad contra el SARS-CoV-2, ya sea recuperándose de una infección o recibiendo una vacuna en el futuro, probablemente estará protegida contra las cepas en circulación durante "años en lugar de meses", predice Trevor Bedford. un biólogo evolutivo del Fred Hutchinson Cancer Research Center, en una evaluación compartida en Twitter.

Proyectos como el COVID-19 Genomics UK Consortium utilizarán estas derivaciones genéticas para rastrear el camino del virus y averiguar si hay hospitales o centros comunitarios que sean puntos calientes de contagio, según Harrison. Esto les dará a los funcionarios de salud pública una idea de dónde y cómo se está transmitiendo el virus ahora.

¿Aumentará el coronavirus cuando las escuelas vuelvan a abrir? ¿Surgirán nuevas cepas que desarrollen resistencia a los medicamentos o vacunas que se introduzcan? Para responder a estas preguntas, dice Harrison, el plan a largo plazo es rastrear el virus en tiempo real y ver cómo cambia a medida que se propaga.


Proteasas de coronavirus

Los investigadores están utilizando activamente estas estructuras para buscar compuestos que bloqueen la acción de las proteasas, para su uso como fármacos antivirales. La diversidad de coronavirus plantea un gran desafío con este esfuerzo: los coronavirus se han clasificado en cuatro géneros separados, y los estudios de secuencia y estructura han demostrado que las proteasas de estos virus pueden ser muy diferentes, por lo que los medicamentos diseñados para combatir uno pueden no ser efectivos contra otros. Una forma posible de abordar este desafío es intentar diseñar un inhibidor de amplio espectro dirigido contra el coronavirus de murciélago progenitor, como el que se muestra aquí en la entrada 4yoi de la PDB, que luego puede proporcionar una ventaja para descubrir inhibidores contra virus emergentes . La cisteína y la histidina del sitio activo se muestran en la ilustración, con un inhibidor en turquesa. Para explorar esta estructura con más detalle, haga clic en la imagen para ver un JSmol interactivo.

Temas para mayor discusión

  1. Una forma octamérica inusual de la proteasa principal puede estar involucrada en su maduración. Puede verlo en la entrada de PDB 3iwm.
  2. Puede comparar los pliegues de las proteasas principales del coronavirus y las proteasas de serina utilizando la herramienta "Alineación de estructura". Intente usar tripsinógeno (entrada PDB 1tgs), de modo que toda la enzima sea una cadena para la alineación.

Recursos relacionados con el PDB-101

Referencias

  1. Cui, J., Li, F., Shi, Z.L. (2019) Origen y evolución de coronavirus patógenos. Nat. Rev. Microbiol. 17, 181-192.
  2. 4yoi: St John, SE, Tomar, S., Stauffer, SR, Mesecar, AD (2015) Dirigiéndose a virus zoonóticos: inhibición basada en la estructura de la proteasa similar a 3C del coronavirus de murciélago HKU4: el probable reservorio del coronavirus humano que causa el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS). Bioorg.Med.Chem. 23: 6036-6048
  3. 4ow0: Baez-Santos, YM, Barraza, SJ, Wilson, MW, Agius, MP, Mielech, AM, Davis, NM, Baker, SC, Larsen, SD, Mesecar, AD (2014) Evaluación estructural y biológica de rayos X de una serie de inhibidores potentes y altamente selectivos de proteasas similares a la papaína del coronavirus humano. J.Med.Chem. 57: 2393-2412
  4. Hilgenfeld, R. (2014) Del SARS al MERS: los estudios cristalográficos sobre las proteasas coronavirales permiten el diseño de fármacos antivirales. FEBS J. 281,4085-4096
  5. 1q2w: Pollack, A. (2003) La compañía dice que mapeó parte del virus del SARS. New York Times, 30 de julio, sección C, página 2.

Febrero de 2020, David Goodsell

Acerca de PDB-101

PDB-101 ayuda a profesores, estudiantes y al público en general a explorar el mundo 3D de proteínas y ácidos nucleicos. Conocer sus diversas formas y funciones ayuda a comprender todos los aspectos de la biomedicina y la agricultura, desde la síntesis de proteínas hasta la salud y la enfermedad hasta la energía biológica.

¿Por qué PDB-101? Investigadores de todo el mundo hacen que estas estructuras 3D estén disponibles gratuitamente en el archivo Protein Data Bank (PDB). PDB-101 crea materiales introductorios para ayudar a los principiantes a iniciarse en la materia ("101", como en un curso de nivel de entrada), así como recursos para el aprendizaje extendido.


1: Replicación, transcripción y traducción del ADN

A. Función: la secuencia de bases de ADN codifica información para la secuencia de aminoácidos de las proteínas. Código genético: relación 1 a 1 entre un codón (secuencia específica de 3 bases) y 1 aminoácido. Dogma central de la genética / flujo de información en las células - Figura fundamental: Flujo de información genética p 1. El ADN se replicará y se transmitirá a las "células hijas"

B. Estructura del ADN: figura 8.3 de doble hebra (2 hebras de ADN), helicoidal y ldquodouble helix y rdquo, antiparalela

1. Dos hebras unidas por enlaces de hidrógeno entre bases complementarias dentro de la hélice
2. Los fuertes enlaces fosfodiéster covalentes de la cadena principal externa y ldquosugar-phosphate & rdquo enlazan nucleótidos
3. Hebras de ADN: polímeros de nucleótidos
4. Nucleótidos: 3 componentes. Azúcar = desoxirribosa, fosfato, base nitrogenada
5. Bases nitrogenadas de ADN

una. purinas (2 anillos) = adenina (A) y guanina (G) pirimidinas (1 anillo) = timina (T) y citosina (C)
B. Reglas de Chagraff & rsquos: cantidad de A = T y cantidad de C = G esto se debe a reglas complementarias de emparejamiento de bases

A = T forman 2 enlaces de hidrógeno
G = C forma 3 enlaces de hidrógeno

*C. El apareamiento de bases complementarias permite la replicación precisa del ADN.

6. Desoxirribosa: pentosa de 5 carbonos. C1 'unido covalentemente a una base nitrogenada.

C3 & rsquo = libre OH (cola)
C5 y rsquo ligados al grupo fosfato (cabeza)

7. Cromosomas procarióticos ver figura La mayoría de las bacterias tienen un solo cromosoma circular. 1 copia de cromosomas = & ldquohaploid cells & rdquo (la mayoría de las células humanas tienen 2 copias de cromosomas lineales y se llaman & ldquodiploid cells & rdquo see & ldquoeukaryotic cromosomes).

8. Topoisomerasas y girasa bacteriana

-Topoisomerasas Enzimas que & ldquosupercoil & rdquo ADN o alivian el superenrollamiento de diferentes tipos de toposiomerasas en E. coli.
Superenrollamientos de ADN tipo I / III y rdquo y ldquorelax y rdquo
Tipo II = Girasa bacteriana: introduce superenrollamientos negativos
& ldquoA través de la acción de las topoisomerasas, la molécula de ADN se puede enrollar y relajar alternativamente. Debido a que el enrollado es necesario para empaquetar el ADN en los confines de una célula y la relajación es necesaria para que el ADN se pueda replicar (y transcribir), estos dos procesos complementarios ... juegan un papel importante en el comportamiento del ADN en la célula. & Ldquo Brock Biology of Microorganismos 8a edición p 185)

-La girasa bacteriana participa en el superenrollamiento / alivio del superenrollamiento del ADN

-antibióticos quinolonas (p. ej., ácido nalidíxico) y fluoroquinolonas (como ciprofloxacina) y novobiocina inhiben la girasa bacteriana e interfieren con la replicación / transcripción del ADN, ver pág.

C. Síntesis de ADN por ADN polimerasas fig ___ Tabla _____

1. La ADN polimerasa requiere una hebra de plantilla (guía), una hebra de cebador con un grupo 3 & rsquoOH libre, sustratos / precursores activados = nucleósidos trifosfatos

* 2. ADN replicado en dirección 5 & rsquo a 3 & rsquo (5 & rsquo- & gt3 & rsquo). Los nucleótidos entrantes solo se pueden agregar a la cola 3 y rsquoOH de una cadena de ADN en crecimiento

3. El oxígeno de los grupos 3 & rsquoOH realiza un ataque nucleofílico en el átomo de fósforo más interno del nucleósido trifosfato entrante. El pirofosfato se separa y será hidrolizado por las fosfatasas celulares con la liberación de energía para impulsar la síntesis. El nucleótido está unido a la cadena del cebador mediante un enlace fosfodiéster (enlace éster = enlace entre el alcohol y el ácido)

4. Si no hay 3 & rsquoOH presente, la cadena de ADN no se puede alargar = terminación de la cadena de ADN. Uso de trifosfatos de didesoxinucleósidos como análogos de bases y en reacciones de secuenciación de ADN.

II. Replicación del cromosoma bacteriano higo ____

A. Recordar el cromosoma bacteriano: ADN bicatenario circular singular en el citoplasma

B. La replicación del ADN comienza en un sitio específico & ldquoori & rdquo = origen de replicación

C. La replicación del ADN procede bidireccionalmente desde ori, con formación de burbuja de replicación y 2 horquillas de replicación. Horquillas de replicación = regiones donde d.s. ADN desenrollado, forma s.s. Plantillas de ADN, la ADN polimerasa hace una copia complementaria de la plantilla de ssDNA parental.

D. La replicación del ADN es semiconservativa. 1 hebra de ADN padre & ldquoold & rdquo se utiliza como plantilla o guía para la síntesis de 1 nueva cadena de ADN hija. -Resultado: 1 cromosoma padre - & gt 2 cromosomas hijas. Cada cromosoma hijo es una copia del cromosoma padre. Cada cromosoma hijo consta de 1 hebra de ADN padre antiguo y 1 hebra de ADN hija nueva. Se & ldquoconserved & rdquo 1 hebra parental en cada nuevo cromosoma hijo

E. Enzimas / proteínas involucradas en la síntesis de ADN. CONOZCA PARA EXAMEN. Fig 8___ Tabla ___

1. * Topoisomerasas, por ejemplo, girasa bacteriana involucrada en el superenrollamiento / alivio del ADN de
superenrollamiento (objetivo de quinolonas, p. ej., ciprofloxacina y ldquocipro y rdquo utilizados para tratar / prevenir
ántrax por inhalación)

1. Helicasa: desenrolla el ADN ds, rompe los enlaces H entre las bases, forma la plantilla de ADN ss

2. Las proteínas de unión de una sola hebra SSBP se unen, estabilizan y protegen el ssDNA

3. ARN Primasa: una ARN polimerasa que no requiere una hebra de cebador para comenzar.
síntesis de cebadores. Sintetiza una cadena de cebador de ARN complementario corto con 3 & rsquoOH libre
grupo usando ADN ss como plantilla. Crea un cebador de ARN, lo que permite que la ADN polimerasa
iniciar la síntesis de ADN. (La ARN polimerasa no es "a prueba de lectura" y, por lo tanto, puede hacer
muchos errores).

4-5. ADN polimerasa: requiere una cadena de cebador, una plantilla y un nucleósido activado
trifosfatos (dATP, dTTP, DCTP, dGTP). Debe tener una plantilla de ADN. Sintetiza ADN complementario
hebra utilizando la hebra madre como plantilla / guía. La ADN polimerasa tiene & ldquoproofreading & rdquo; ellos & ldquocheck & rdquo
cada nucleótido que agregan, elimine si es incorrecto y agregue el nucleótido correcto. Las ADN polimerasas tienen un alto
fidelidad, cometen muy pocos errores. Tasas de errores originales 10-4 después de la corrección de pruebas, tasa de errores =
10-9, es decir, una base incorrecta en cada 109 bases agregadas E. coli: La ADN polimerasa III realiza la mayor parte de la síntesis de ADN
ADN polimerasa I: eliminará el cebador de ARN y lo reemplazará con la secuencia de ADN

6. Ligasa: une secuencias cortas de ADN (llamadas fragmentos de Okazaki) juntas en y ldquolagging
strand & rdquo deberes ver inhibición de la síntesis de ácido nucleico. ¿Qué son los análogos de nucleótidos? ¿Cuáles son sus usos?

Comparar y contrastar ADN polimerasas bacterianas y ARN polimerasas
Nota: ss = hebra sencilla ds = hebra doble P = fosfato
Visión general:

Las ADN polimerasas sintetizan ADN complementario utilizando una plantilla / guía de ADN
adn
por ejemplo, secuencia de bases de plantilla de ssDNA: A T A G G C
Secuencia de ADN complementaria T A T C C G adn
sintetizado por ADN polimerasa


Las ARN polimerasas sintetizan secuencias de ARN complementarias utilizando ADN como plantilla / guía
adn
por ejemplo, secuencia de bases de plantilla de ssDNA: A T A G G C
Secuencia de ARN complementaria U A U C C G rna
sintetizado por ARN polimerasa


La síntesis de ADN y ARN requiere la entrada de energía, tanto ATP como precursores cargados.

Comparar y contrastar la ADN polimerasa y la ARN polimerasa celular
------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ADN polimerasa ARN polimerasa
Plantilla / guía ss DNA ssDNA
Sintetizar ADN complementario ARN complementario
Precursores cargados desoxiadenosina tri-P = dATP adenosina tri-P = ATP
deoxythymidine tri-P=dTTP uridine tri-P=UTP
deoxycytodine tri-P= dCTP cytodine tri-P=CTP
deoxyguanosine tri-P=dGTP guanosine tri-P=GTP
primer required? yes no
proofreading/editing? sí * no


*DNA polymerase proofreading/editting
Polymerases have a &rdquonormal&rdquo or &ldquointrinsic&rdquo mistake rate of approximately 10 -4 &ndash 10 -5 nucleotides (this means the polymerases introduce the incorrect nucleotide every 10,000 to 100, 000 nucleotides). DNA polymerases have the ability to &ldquoproofread
and edit&rdquo their mistakes. If they introduce the wrong nucleotide, they can remove or &ldquoexcise&rdquo the wrong nucleotide and try again to make a correct match. This reduces the mistake rate of DNA polymerases to approximately 10 -9 &ndash 10 -10 (or only one incorrect
nucleotide every 1,000,000,000 &ndash 10,000,000,000 nucleotides). RNA polymerase cannot proofread or edit so RNA polymerase make many mistakes (one reason many RNA viruses, for example HIV, mutate so rapidly. more later)

Transcription Prokaryotic


Review flow of information in cell
DNA--------> RNA --------->Protein

replication transcription translation

I. Codigo genetico: one to one relationship between specific codon (specific 3 base sequence) and an amino acid

II. Bacterial Transcription: use of DNA as template/guide to synthesize complementary RNA.
DNA info is rewritten in RNA sequence. Fig ___

A. First step in gene expression

B. Products of transcription

1. messenger RNA=mRNA: will be translated into specific amino acid
sequence of a protein
2. transfer RNA=tRNA: actual &ldquotranslator&rdquo molecule, recognizes both a
specific codon and specific amino acid
3. ribosomal RNA=rRNA: combined with ribosomal proteins, will form
the ribosome, the &ldquoworkbench&rdquo at which mRNA is translated into a specific amino acid
sequence/polypeptide/protein

4. additional RNA products

III. Promoters and Bacterial RNA polymerases

UNA. Promotores: specific DNA sequences which signal the &ldquostart&rdquo points for gene
transcripción. Sigma factor/subunit of RNA polymerase binds to promoters to
initiate transcription

B. Bacterial RNA polymerases: enzyme complex which recognizes DNA promoters, binds
to promoter and synthesizes complementary RNA copy using DNA as
template/guide

E. coli RNA Polymerase: 2 subunits, sigma subunit and core

una. sigma subunit/factor= &ldquobrains&rdquo of RNA polymerase. Viajes
along DNA until it reaches a promoter, binds promoter

B. core subunit: binds to sigma attached at promoter. &ldquoWorkhorse&rdquo
of RNA polymerase, carries out actual RNA synthesis. Requiere
activated precursors and template strand, DOES NOT REQUIRE
PRIMER (compare to DNA Polymerase). Synthesizes RNA in 5&rsquo -
to->3&rsquo , similar to DNA polymerase. No proofreading ability
therefore will make more mistakes than DNA Polymerase

C. sigma subunit will drop off after the first few ribonucleotides
have been linked together, core continues alone. Note: core would
start transcription randomly of DNA without direction of sigma
subunit. ARNm policistrónico (prok. only)

IV. Termination of transcription (over-simplified)

Terminators: DNA sequences which signal transcription stop signals. ARN
polymerase releases DNA when transcription terminator sequence encountered
Homework Describe antimicrobial drugs which bind to and inhibit function of bacterial RNA
polymerases (answer: rifampin _used to treat which pathogen?)

Bacterial Translation fig

Translation: RNA base sequence translated into amino acid sequence of protein. mRNA is template for
polypeptide synthesis. Second step in gene expression.

A.Translation of mRNA into a polypeptide chain is possible because of the genetic code:

1. genetic code: One to one relationship between a codon (specific sequence of 3 bases)
and a specific amino acid. Figure __ Genetic code table

ejemplos
mRNAcodon=amino acid
GAC=aspartate
CCU=proline
UUG=leucine
Genetic code: Redundant (more than one codon for each amino acid) yet specific (each codon
encodes info for 1 amino acid only). Universal most cellular organisms use same genetic code
some exceptions

B. Translation requires tRNA, amino acids, ATP/GTP, ribosomes and mRNA

C. tRNA =transfer RNA. Adaptor/translator molecule. Only molecule which can "recognize" correct amino acid AND correct codon

1. structure: ss RNA, stem and loop

una. amino acid attachment site at one end
B. anticodon which "recognizes"(forms H bonds with) codon of mRNA

2. *45 different tRNA&rsquos for 20 different amino acids &ldquowobble&rdquo permits some tRNA&rsquos to bind to more than one codon (&ldquorelaxed&rdquo/improper base painring between 3 base of codon and anticodon)

D. amino acyl tRNA synthetases* : &ldquoload&rdquo proper amino acid on proper tRNA= amino acid activation. 20 different transferases for 20 different amino acids/tRNA&rsquos amino acid x+ ATP + tRNAx--> tRNAx:amino acid x + AMP + 2 P* &ldquocharged tRNA&rdquo or &ldquoactivated amino acid&rdquo

E. Ribosomes: 70S in prokaryotes. 2 subunits 30S (small subunit) + 50S (large subunit) S=Svedberg Unit, use to express sedimentation rates, ultracentrifugation

made of rRNA and ribosomal proteins. &ldquoWorkbench&rdquo at which mRNA will be translated into a polypeptide. 16s rRNA binds RBS (Ribosomal Binding Site on mRNA). 23s rRNA acts a ribozyme, forms peptide bonds between amino acids E, P and A sites.

F. Mechanics of translation: text. GTP is hydrolyzed during translation

Translation Initiation (note: tRNA-f met may first bind 30S subunit before 30S subunit binds RBS)

1. 30S subunit recognizes ribosomal binding site RBS/Shine-Dalgarno sequence. Complementary to 16s rRNA sequence of ribosome.
2. Translation begins at start codon AUG closest to ribosomal binding site
3. An initiator tRNA:methionine ( more precisely a formyl methionine in bacteria) enters the &ldquoP&rdquo or peptidyl binding site of the ribosome. A tRNA fits into the binding site when its anticodon base-pairs with the mRNA codon
4. The larger ribosomal 50S subunit then binds the complex
5. Additional proteins called initiation factors are required to bring all components together

Translation Elongation: amino acids are added one by one to first amino acid. Additional protein
elongation factors required

1. A second appropriately charged tRNA enters the &ldquoA&rdquo or aminoacyl binding site of the ribosome, bearing the next amino acid.
2. Peptide bond formation. 23s rRNA of large subunit catalyzes formation of peptide bond between amino acid at P site and amino acid at A site (rRNA acts as a &ldquoribozyme&rdquo, RNA catalyst) -amino acid of tRNA at P site is transferred to amino acid bond of tRNA at A site
3. Now ribosome moves &ldquodownstream&rdquo by one codon. tRNA carrying dipeptide is now in P site, A site is empty.
4. New appropriately amino acid charged tRNA enters A site
5. Ribosome catalyzes peptide bond formation between dipeptide and new incoming amino acid. Tripeptide is carried by tRNA at A site
6. Translocation:
7. Requires energy (GTP )

1. Ribosome reaches one of 3 nonsense codons/stop codons: UAA, UGA, UAG
2. Release factor binds A site, causes polypeptide and ribosome to be released from mRNA (by activation of ribozyme)

G. Polycistronic mRNA in prokaryotes permit coordinated gene expression in prokaryotes

mRNA encodes more than one gene so ribosomes can coordinately produce several
different proteins. For example 3 genes for proteins involved in lactose transport/metabolism in E. coli are
transcribed into a single mRNA molecule. Ribosomes translate all 3 into proteins at same time

H. Simultaneous transcription and translation in prokaryotes only. Ribosomes can bind mRNA and begin translation before transcription is finished. Very efficient. Fig ____


Abstracto

We are attempting to understand the processes required to accurately replicate the repetitive DNA sequences whose instability is associated with several human diseases. Here we test the hypothesis that the contribution of exonucleolytic proofreading to frameshift fidelity during replication of repetitive DNA sequences diminishes as the number of repeats in the sequence increases. The error rates of proofreading-proficient T7, T4, and Pyrococcus furiosis DNA polymerases are compared to their exonuclease-deficient derivatives, for +1 and −1 base errors in homopolymeric repeat sequences of three to eight base pairs. All three exonuclease-deficient polymerases produce frameshift errors during synthesis at rates that increase as a function of run length, suggesting the involvement of misaligned intermediates. Their wild-type counterparts are all much more accurate, suggesting that the majority of the intermediates are corrected by proofreading. However, the contribution of the exonuclease to fidelity decreases substantially as the length of the homopolymeric run increases. For example, the exonuclease enhances the frameshift fidelity of T7 DNA polymerase in a run of three A·T base pairs by 160-fold, similar to its contribution to base substitution fidelity. However, in a run of eight consecutive A·T base pairs, the exonuclease only enhances frameshift fidelity by 7-fold. A similar pattern was observed with T4 and Pfu DNA polymerases. Thus, both polymerase selectivity and exonucleolytic proofreading efficiency are diminished during replication of repetitive sequences. This may place an increased relative burden on post-replication repair processes to reduce rates of addition and deletion mutations in organisms whose genome contains abundant simple repeat DNA sequences.

A quién debe dirigirse la correspondencia. Phone: (919)-541-2644. Fax: (919)-541-7613. Email: [email protected]


From Bats to Human Lungs, the Evolution of a Coronavirus

For thousands of years, a parasite with no name lived happily among horseshoe bats in southern China. The bats had evolved to the point that they did not notice they went about their nightly flights unbothered. One day, the parasite—an ancestor of the coronavirus, SARS-CoV-2—had an opportunity to expand its realm. Perhaps it was a pangolin, the scaly anteater, an endangered species that is a victim of incessant wildlife trafficking and sold, often secretly, in live-animal markets throughout Southeast Asia and China. Or not. The genetic pathway remains unclear. But to survive in a new species, whatever it was, the virus had to mutate dramatically. It might even have taken a segment of a different coronavirus strain that already inhabited its new host, and morphed into a hybrid—a better, stronger version of itself, a pathogenic Everyman capable of thriving in diverse species. More recently, the coronavirus found a new species: ours. Perhaps a weary traveller rubbed his eyes, or scratched his nose, or was anxiously, unconsciously, biting his fingernails. One tiny, invisible blob of virus. One human face. And here we are, battling a global pandemic.

The world’s confirmed cases (those with a positive lab test for COVID-19, the disease caused by SARS-CoV-2) doubled in seven days, from nearly two hundred and thirteen thousand, on March 19th, to four hundred and sixty-seven thousand, on March 26th. Nearly twenty-one thousand people have died. The United States now has more confirmed cases than any country on earth, with more than eighty thousand on March 26th. These numbers are a fraction of the real, unknown total in this country and around the world, and the numbers will keep going up. Scientists behind a new study, published earlier this month in the journal Ciencias, have found that for every confirmed case there are likely five to ten more people in the community with an undetected infection. This will likely remain the case. “The testing is not near adequate,” one of the study’s authors, Jeffrey Shaman, an environmental-health sciences professor at Columbia University, said. Comments from emergency-room doctors have been circulating on social media like S.O.S. flares. One, from Daniele Macchini, a doctor in Bergamo, north of Milan, described the situation as a “tsunami that has overwhelmed us.”

Scientists first discovered that coronaviruses originate among bats following the outbreak of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) in 2003. Jonathan Epstein, an epidemiologist at the EcoHealth Alliance in New York who studies zoonotic viruses—those that can jump from animals to people—was part of a research team that went hunting for the source in China’s Guangdong Province, where simultaneous SARS outbreaks had occurred, suggesting multiple spillovers from animals to people. At first, health officials believed palm civets, a mongoose-like species commonly eaten in parts of China, were responsible, as they were widely sold at markets connected to the SARS outbreak, and tested positive for the virus. But civets bred elsewhere in Guangdong had no antibodies for the virus, indicating that the market animals were only an intermediary, highly infectious host. Epstein and others suspected that bats, which are ubiquitous in the area’s rural, agricultural hills, and were, at the time, also sold from cages at Guangdong’s wet markets, might be the coronavirus’s natural reservoir.

The researchers travelled through the countryside, setting up field labs inside limestone caverns and taking swabs from dozens of bats through the night. After months of investigation, Epstein’s team discovered four species of horseshoe bats that carried coronaviruses similar to SARS, one of which carried a coronavirus that was, genetically, a more than ninety per cent match. “They were found in all of the locations where SARS clusters were happening,” he said.

After years of further bat surveillance, researchers eventually found the direct coronavirus antecedent to SARS, as well as hundreds of other coronaviruses circulating among some of the fourteen hundred bats species that live on six continents. Coronaviruses, and other virus families, it turns out, have been co-evolving with bats for the entire span of human civilization, and possibly much longer. As the coronavirus family grows, different strains simultaneously co-infect individual bats, turning their little bodies into virus blenders, creating new strains of every sort, some more powerful than others. This process happens without making bats sick—a phenomenon that scientists have linked to bats’ singular ability, among mammals, to fly. The feat takes a severe toll, such that their immune systems have evolved a better way to repair cell damage and to fight off viruses without provoking further inflammation. But when these viruses leap into a new species—whether a pangolin or a civet or a human—the result can be severe, sometimes deadly, sickness.

In 2013, Epstein’s main collaborator in China, Shi Zheng-Li, sequenced a coronavirus found in bats, which, in January, she discovered shares ninety-six per cent of its genome with SARS-CoV-2. The two viruses have a common ancestor that dates back thirty to fifty years, but the absence of a perfect match suggests that further mutation took place in other bat colonies, and then in an intermediate host. When forty-one severe cases of pneumonia were first announced in Wuhan, in December, many of them were connected to a wet market with a notorious wildlife section. Animals are stacked in cages—rabbits on top of civets on top of ferret-badgers. “That’s just a gravitational exchange of fecal matter and viruses,” Epstein said. Chinese authorities reported that they tested animals at the market—all of which came back negative—but they have not specified which animals they tested, information that is crucial for Epstein’s detective work. Authorities later found the virus in samples taken from the market’s tables and gutters. But, because not all of the first patients were tied to the market, nor were they connected to one another, Epstein said, “it raised the question of, well, perhaps those forty-one weren’t the first cases.”

Analyses of the SARS-CoV-2 genome indicate a single spillover event, meaning the virus jumped only once from an animal to a person, which makes it likely that the virus was circulating among people before December. Unless more information about the animals at the Wuhan market is released, the transmission chain may never be clear. There are, however, numerous possibilities. A bat hunter or a wildlife trafficker might have brought the virus to the market. Pangolins happen to carry a coronavirus, which they might have picked up from bats years ago, and which is, in one crucial part of its genome, virtually identical to SARS-CoV-2. But no one has yet found evidence that pangolins were at the Wuhan market, or even that venders there trafficked pangolins. “We’ve created circumstances in our world somehow that allows for these viruses, which would otherwise not be known to cause any problems, to get into human populations,” Mark Denison, the director of pediatric infectious diseases at Vanderbilt University Medical Center’s Institute for Infection, Immunology, and Inflammation, told me. “And this one happened to say, ‘I really like it here.’ ”

The new coronavirus is an elusive killer. Since people have never seen this strain before, there is much about it that remains a mystery. But, in just the past few weeks, genetic sleuthing, atomic-level imaging, computer modelling, and prior research on other types of coronaviruses, including SARS y MERS (Middle East Respiratory Syndrome), have helped researchers to quickly learn an extraordinary amount—particularly what might treat or eradicate it, through social-distancing measures, antiviral drugs, and, eventually, a vaccine. Since January, nearly eight hundred papers about the virus have been posted on BIORxiv, a preprint server for studies that have not yet been peer-reviewed. More than a thousand coronavirus genome sequences, from different cases around the world, have been shared in public databases. “It’s insane,” Kristian Andersen, a professor in the Department of Immunology and Microbiology at Scripps Research, told me. “Almost the entire scientific field is focussed on this virus now. We’re talking about a warlike situation.”

There are endless viruses in our midst, made either of RNA or DNA. DNA viruses, which exist in much greater abundance around the planet, are capable of causing systemic diseases that are endemic, latent, and persistent—like the herpes viruses (which includes chicken pox), hepatitis B, and the papilloma viruses that cause cancer. “DNA viruses are the ones that live with us and stay with us,” Denison said. “They’re lifelong.” Retroviruses, like H.I.V., have RNA in their genomes but behave like DNA viruses in the host. RNA viruses, on the other hand, have simpler structures and mutate rapidly. “Viruses mutate quickly, and they can retain advantageous traits,” Epstein told me. “A virus that’s more promiscuous, more generalist, that can inhabit and propagate in lots of other hosts ultimately has a better chance of surviving.” They also tend to cause epidemics—such as measles, Ebola, Zika, and a raft of respiratory infections, including influenza and coronaviruses. Paul Turner, a Rachel Carson professor of ecology and evolutionary biology at Yale University, told me, “They’re the ones that surprise us the most and do the most damage.”

Scientists discovered the coronavirus family in the nineteen-fifties, while peering through early electron microscopes at samples taken from chickens suffering from infectious bronchitis. The coronavirus’s RNA, its genetic code, is swathed in three different kinds of proteins, one of which decorates the virus’s surface with mushroom-like spikes, giving the virus the eponymous appearance of a crown. Scientists found other coronaviruses that caused disease in pigs and cows, and then, in the mid-nineteen-sixties, two more that caused a common cold in people. (Later, widespread screening identified two more human coronaviruses, responsible for colds.) These four common-cold viruses might have come, long ago, from animals, but they are now entirely human viruses, responsible for fifteen to thirty per cent of the seasonal colds in a given year. We are their natural reservoir, just as bats are the natural reservoir for hundreds of other coronaviruses. But, since they did not seem to cause severe disease, they were mostly ignored. In 2003, a conference for nidovirales (the taxonomic order under which coronaviruses fall) was nearly cancelled, due to lack of interest. Luego SARS emerged, leaping from bats to civets to people. The conference sold out.

SARS is closely related to the new virus we currently face. Whereas common-cold coronaviruses tend to infect only the upper respiratory tract (mainly the nose and throat), making them highly contagious, SARS primarily infects the lower respiratory system (the lungs), and therefore causes a much more lethal disease, with a fatality rate of approximately ten per cent. (MERS, which emerged in Saudi Arabia, in 2012, and was transmitted from bats to camels to people, also caused severe disease in the lower respiratory system, with a thirty-seven per cent fatality rate.) SARS-CoV-2 behaves like a monstrous mutant hybrid of all the human coronaviruses that came before it. It can infect and replicate throughout our airways. “That’s why it is so bad,” Stanley Perlman, a professor of microbiology and immunology who has been studying coronaviruses for more than three decades, told me. “It has the lower-respiratory severity of SARS y MERS coronaviruses, and the transmissibility of cold coronaviruses.”

Una razón por la que SARS-CoV-2 may be so versatile, and therefore so successful, has to do with its particular talent for binding and fusing with lung cells. All coronaviruses use their spike proteins to gain entry to human cells, through a complex, multistep process. First, if one imagines the spike’s mushroom shape, the cap acts like a molecular key, fitting into our cells’ locks. Scientists call these locks receptors. En SARS-CoV-2, the cap binds perfectly to a receptor called the ACE-2, which can be found in various parts of the human body, including the lungs and kidney cells. Coronaviruses attack the respiratory system because their ACE-2 receptors are so accessible to the outside world. “The virus just hops in,” Perlman told me, “whereas it’s not easy to get to the kidney.”

While the first SARS virus attached to the ACE-2 receptor, as well, SARS-CoV-2 binds to it ten times more efficiently, Kizzmekia Corbett, the scientific lead of the coronavirus program at the National Institutes of Health Vaccine Research Center, told me. “The binding is tighter, which could potentially mean that the beginning of the infection process is just more efficient.” SARS-CoV-2 also seems to have a unique ability, which SARS y MERS did not have, to use enzymes from our human tissue—including one, widely available in our bodies, named furin—to sever the spike protein’s cap from its stem. Only then can the stem fuse the virus membrane and the human-cell membrane together, allowing the virus to spit its RNA into the cell. According to Lisa Gralinski, an assistant professor in the Department of Epidemiology at the University of North Carolina at Chapel Hill, this supercharged ability to bind to the ACE-2 receptor, and to use human enzymes to activate fusion, “could aid a lot in the transmissibility of this new virus and in seeding infections at a higher level.”

Once a coronavirus enters a person—lodging itself in the upper respiratory system and hijacking the cell’s hardware—it rapidly replicates. When most RNA viruses replicate themselves in a host, the process is quick and dirty, as they have no proofreading mechanism. This can lead to frequent and random mutations. “But the vast majority of those mutations just kill the virus immediately,” Andersen told me. Unlike other RNA viruses, however, coronaviruses hacer have some capacity to check for errors when they replicate. “They have an enzyme that actually corrects mistakes,” Denison told me.

It was Denison’s lab at Vanderbilt that first confirmed, in experiments on live viruses, the existence of this enzyme, which makes coronaviruses, in a sense, cunning mutators. The viruses can remain stable in a host when there is no selective pressure to change, but rapidly evolve when necessary. Each time they leap into a new species, for example, they are able to hastily transform in order to survive in the new environment, with its new physiology and a new immune system to battle. Once the virus is spreading easily within a species, though, its attitude is, “I’m happy, I’m good, no need to change,” Denison said. That seems to be playing out now in humans as SARS-CoV-2 circles the globe, there are slight variations among its strains, but none of them seem to affect the virus’s behavior. “This is not a virus that is rapidly adapting. It’s like the best car in the Indy 500. It’s out in front and there is no obstacle in its path. So there is no benefit to changing that car.”

A virus replicates in order to shed from its host—through mucus, snot, phlegm, and even our breath—as soon as possible, in great quantities, so that it can keep spreading. The coronavirus happens to be a brilliant shedder. A preprint study by German researchers, published earlier this month, and one of the first outside China to examine data from patients diagnosed with COVID-19, found clear evidence that infected people shed the coronavirus at significant rates before they develop symptoms. In effect—possibly due to that supercharged ability to bind and fuse to our cells—the virus wears an invisibility cloak. Scientists recently estimated that undocumented cases of COVID-19, or infected people with mild symptoms, are fifty-five per cent as contagious as severe cases. Another study found that in more severe cases (requiring hospitalization), patients shed the virus from their respiratory tracts for as long as thirty-seven days.

Outside a host, in parasitical purgatory, a virus is inert, not quite alive, but not dead, either. A hundred million coronavirus particles could fit on the head of a pin—typically, thousands or tens of thousands are necessary to infect an animal or a person—and they might remain viable for long stretches. Researchers at the Virus Ecology Unit of Rocky Mountain Laboratories, in Montana, a facility connected to the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, have found that the virus can linger on copper for four hours, on a piece of cardboard for twenty-four hours, and on plastic or stainless steel for as long as three days. They also found that the virus can survive, for three hours, floating through the air, transmitted by the tiny respiratory droplets an infected person exhales, sneezes, or coughs out. (Other research suggests the virus might be able to exist as an aerosol, but only in very limited conditions.) Most virus particles, though, seem to lose their virulency fairly quickly. The infection window is highest in the first ten minutes. Still, the risk of infection has turned many of us, understandably, into germophobes.

All a virus wants is an endless chain of hosts. Contagion is the evolutionary end goal. Based on experiments so far, researchers estimate that COVID-19 is slightly more communicable than the common flu and less communicable than the most highly infectious viruses, like measles, with which a single sick person can infect around twelve other people. There are likely coronavirus super-spreaders—people who, for whatever reason, are almost entirely asymptomatic but transmit the disease to many other people. But pinning down an exact infection rate, at this point, is an impossible task. “We tend to focus on these absolute numbers as telling us how worried we should be,” Denison said. “Look, it’s like flooding. You know, is it up to my knees or is it up to my chin? It doesn’t matter. I need to do something to try to make sure I’m not gonna drive my car into the flood.”

In many places, we already have driven into the flood. As hundreds of people die each day, hospitals are running out of supplies, beds, and ventilators. In these severe COVID-19 cases, according to scientists’ current understanding, the disease may have more to do with a haywire immune response to the virus than anything else. Because the virus can gain a foothold in our lower respiratory system while still wearing that invisibility cloak, it “basically beats the immune system to the punch and starts replicating too rapidly,” Perlman said. When the immune system finally does register its presence, it might go into overdrive, and send everything in its arsenal to attack, since it has no specific antibodies to fight these strange new invaders. “It’s like pouring gas on the fire,” Denison told me. The lung tissue swells and fills with fluid. Breathing is restricted, as is the exchange of oxygen. “The host immune response just gets triggered to such an extreme level, and then builds on itself and builds on itself until ultimately the body kind of goes into shock,” Gralinski said. It is almost like an autoimmune disease the immune system is attacking parts of the body that it should not.

This type of response might be why the elderly are, on the whole, more vulnerable to COVID-19, just as they were to the SARS outbreak in 2003. (In that outbreak, there were almost no deaths among children under the age of thirteen, and, when kids did get sick, the disease was, on average, milder than what affected adults.) When studying SARS in mice models, Denison told me that he has observed a phenomenon known as “immune senescence,” in which older mice no longer had the capacity to respond in a balanced way to a new virus their immune systems’ overreaction then caused even more severe disease. This occurred in some of the worst cases during the first SARS outbreak, too, Denison said, and explains why antiviral drugs may be significantly more helpful at the onset of illness, before the immune system has had a chance to wreak havoc.

In the last decade, Denison’s lab and collaborators at the University of North Carolina have been researching antiviral treatments to try to find something that worked not just against SARS y MERS but for a new coronavirus which, they knew, would inevitably arrive. Together, they did much of the early research into the drug now known as Remdesivir, which is currently in development by Gilead and in studies on infected patients, and another antiviral drug compound, known as NHC. Both drugs, in animal models, were able to bypass, avoid, or block the coronavirus’s proofreading function, which helped stop the virus from replicating successfully in the body. “They worked very effectively against all the coronaviruses that we’ve tested,” Denison told me.

Coronaviruses likely have that proofreading enzyme because they are huge—one of the largest RNA viruses in existence—and they need a mechanism that maintains such a long genome’s structure. From our perspective, the benefit of such a big genome, Andersen told me, “is that the more genes and protein products a virus has, the more opportunities we have to design specific treatments against them.” For instance, the virus’s unique ability to use the human enzyme furin offers promise for antiviral drugs that act as furin inhibitors.

COVID-19, while still new to us hosts, will continue to be responsible for widespread infection and death. But, Epstein said, “Over time, as viruses evolve with their natural habitats, they tend to cause less severe disease. And that is good for both the host and the virus.” The more virulent strains might burn out (which, however, means many more awful deaths), while the remaining hosts might build up some immunity. More immediately, and urgently, the virus’s stability—how much it is thriving among us right now, and mutating only minimally—bodes well for the performance of antiviral drugs and, eventually, a vaccine. If the growing number of mitigation measures—this unprecedented national and international shutdown—are held in place for enough time, the speed at which the virus is spreading should slow, giving hospitals and health workers some relief. “The virus is our teacher,” Denison told me. It has spent thousands of years evolving to get where it is. We’re now just rushing to catch up.


The pace of evolution

Mutations may happen randomly, but the rate at which they occur depends on the virus. The enzymes that copy DNA viruses, called DNA polymerases, can proofread and fix errors in the resulting strings of genetic letters, leaving few mutations in each generation of copies.

But RNA viruses, like SARS-CoV-2, are the evolutionary gamblers of the microscopic world. The RNA polymerase that copies the virus’s genes generally lacks proofreading skills, which makes RNA viruses prone to high mutation rates—up to a million times greater than the DNA-containing cells of their hosts.

Coronaviruses have a slightly lower mutation rate than many other RNA viruses because they can do some light genetic proofreading. “But it’s not enough that it prevents these mutations from accumulating,” says virologist Louis Mansky, the director for the Institute for Molecular Virology at the University of Minnesota. So as the novel coronavirus ran amok around the world, it was inevitable that a range of variants would arise.

The true mutation rate of a virus is difficult to measure though. “Most of those mutations are going to be lethal to the virus, and you’ll never see them in the actively growing, evolving virus population,” Mansky says.

Instead, genetic surveys of sick people can help determine what’s known as the fixation rate, which is a measure of how often accumulated mutations become “fixed” within a viral population. Unlike mutation rate, this is measured over a period of time. So the more a virus spreads, the more opportunities it has to replicate, the higher its fixation rate will be, and the more the virus will evolve, Duffy says.

For SARS-CoV-2, scientists estimate that one mutation becomes established in the population every 11 days or so. But this process may not always happen at a steady pace.

In December 2020, the variant B.1.1.7 caught scientists’ attention when its 23 mutations seemed to suddenly crop up as the virus rampaged through Kent. Some scientists speculate that a chronically ill patient provided more opportunities for replication and mutation, and the use of therapies such as convalescent plasma may have pressured the virus to evolve. Not every change was necessarily useful to the virus, Duffy notes, yet some mutations that emerged allowed the variant to spread rapidly.


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Aplicaciones

  • DNA labeling by nick translation
  • DNA end blunting of 5'- and 3'-overhangs
  • cDNA synthesis from DNA or RNA template

Fuente

Almacenamiento

Unit definition

One unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the incorporation of 10 nmol of total nucleotides into acid-insoluble product in 30 minutes at 37°C and pH 7.4, using poly d(A-T) as the template-primer.

Concentración

Product citations

Friedberg, E. C. The eureka enzyme: the discovery of DNA polymerase. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 143&ndash7 (2006).

Lehman, I. R., Bessman, M. J., Simms, E. S. & Kornberg, A. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 233, 163&ndash70 (1958).

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