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Electroporación vs pistolas genéticas

Electroporación vs pistolas genéticas


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¿Cuáles son los pros y los contras de usar electroporadores (izquierda) y pistolas de genes (derecha) para la transformación en términos de:

  • Precio
  • Organismo objetivo
  • Eficacia
  • Facilidad de uso
  • Mantenimiento

No soy un experto en armas genéticas, pero intentaré dar mi respuesta a esta pregunta de todos modos.

En cuanto al precio, ambos son relativamente baratos. Los consumibles de los electroporadores son solo las cubetas, cuestan entre 5 y 10 dólares / cada una. Las pistolas genéticas utilizan microperlas como balas y dependiendo del material cuestan entre 200 y 300 dólares el microgramo, 10-50 dólares el disparo, un poco más caro que la electroporación.

En cuanto a los organismos, las pistolas se utilizan principalmente para células vegetales y algunos otros organismos "difíciles de electroporar". No tendría una lista adecuada de ellos, pero aproximadamente, si trabaja con bacterias, levaduras y células de mamíferos, elija un electroporador. Si necesita trabajar con tejidos u organismos completos como gusanos / insectos / plantas, entonces busque un arma, definitivamente no puede electroporar una hoja. Pero, en general, consulte la literatura sobre cuál es actualmente el mejor método para transfectar su sistema de elección.

Eficacia, también en este caso depende de las células con las que esté trabajando. La electroporación alcanza 10 ^ 9/10 ^ 10 hormigas transformadas por microgramo de ADN en el caso de E. coli y esta es la mejor eficiencia que puede obtener hoy en día. Todas las demás células se transfectarán con menor eficiencia, ¿cuánto menor? ¡Depende de las células!

Facilidad de uso. Ambos son muy fáciles de usar, es cuestión de presionar un botón. Para la electroporación es necesario preparar células electrocompetentes, pero el procedimiento es muy sencillo. Para las pistolas de genes, es necesario recubrir las cuentas con ADN, también es muy fácil.

Mantenimiento. El electroporador no necesita ningún mantenimiento en absoluto, mientras que la pistola puede necesitar algún cuidado a largo plazo, ya que tiene bombas y cámaras presurizadas, estas cosas generalmente necesitan algo de atención, pero nada especial.

Algunas referencias:

bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_9541.pdf

bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006174B.pdf

bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006217A.pdf


Precio

Mirando a través de Google Shopping y visitando algunos sitios web, parece que la electroporación cuesta entre 3000 y 8000 dólares dependiendo de las características que desee. Por otro lado, las pistolas genéticas son mucho más caras. La pistola genética más común, el modelo Helios de Bio-Rad, cuesta alrededor de $ 17000, incluidas todas las piezas necesarias. Como puede ver, una pistola genética puede ser más cara.

Además, la pistola genética necesita balas, que son microperlas (o microportadores, como las llama Bio-Rad), y cuestan alrededor de 600 dólares. Las cubetas de electroporación cuestan $ 90 cada una. Sin embargo, se pueden limpiar y reutilizar.

Organismo objetivo

Según Wikipedia, las pistolas genéticas se utilizan principalmente para transformar tejidos vegetales, pero también se utilizan para tejidos animales. Según Bio-Rad, es bueno principalmente para sistemas vegetales y animales, pero puede usarse para algas, bacterias y más.

La electroporación parece usarse más para las bacterias. También lo han usado para levadura. También se ha utilizado para tejidos animales, pero no es el organismo objetivo más adecuado. Parece mejor para los sistemas in vitro, ya que la mayoría de los sistemas de electroporación necesitan que los tejidos o las células se transfecten en una cubeta.

Eficacia

En el caso de las pistolas genéticas, la eficiencia depende del entorno y del tipo de células que se utilicen. La eficacia de la transfección varía para varios tipos de células. No puedo encontrar muchas estimaciones de la eficiencia de las pistolas genéticas. Pero algunos de ellos son el 10-20% del ADN. Se acuerda que la electroporación tiene una eficiencia muy alta. Según Wikipedia:

La preparación normal de células competentes puede producir una eficiencia de transformación que varía de 106 a 108 ufc / μg de ADN. Sin embargo, existen protocolos para el método químico para hacer células supercompetentes que pueden producir una eficiencia de transformación de más de 1 x 109. [6] El método de electroporación en general tiene una mejor eficiencia de transformación que los métodos químicos con más de 1 x 1010 ufc / μg de ADN posible, y permite transformar plásmidos grandes de 200 kb de tamaño.

Facilidad de uso

Ambos son muy fáciles de usar. Solo requieren presionar unos pocos botones. Sin embargo, si desea saber cómo usarlo, debe leer los manuales y protocolos. El manual del sistema de pistola genética Helios está disponible aquí. El sistema de electroporación MicroPulser también de Bio-Radd tiene el manual aquí.

Mantenimiento

El mantenimiento de una pistola genética es bastante simple. Por ejemplo, la pistola genética de mano de Bio-Rad tiene un mantenimiento simple (desde aquí):

El cañón modificado mejorado requiere poco mantenimiento. Se puede limpiar fácilmente con etanol al 70%. La punta del cañón contiene una malla circular de nailon, que debe reemplazarse con regularidad para mantener un rendimiento óptimo. Para cambiar la malla, simplemente desenrosque la punta, retire la malla gastada e inserte una nueva sobre la junta tórica. Una vez que la punta se vuelve a atornillar en su lugar, la pistola genética manual está operativa.

La electroporación tampoco necesita casi ningún mantenimiento.


Vectores virales, células diseñadas y la revolución CRISPR

Durante las últimas décadas, la capacidad de editar células humanas ha revolucionado la biología y la medicina modernas. Con los avances en las metodologías de edición del genoma, la administración de genes y las terapias basadas en células dirigidas al tratamiento de enfermedades genéticas se han convertido en una realidad que se volverá cada vez más esencial en la práctica clínica. La modificación de mutaciones específicas en células eucariotas utilizando sistemas CRISPR-Cas derivados de sistemas inmunes procariotas ha permitido la precisión en la corrección de diversas mutaciones de enfermedades. Además, la entrega de cargas útiles genéticas mediante el empleo del tropismo viral se ha convertido en un mecanismo crucial y eficaz para la entrega de genes y sistemas de edición de genes en las células. Por último, las células modificadas ex vivo tienen un enorme potencial y han demostrado ser eficaces para estudiar y tratar una gran variedad de enfermedades. Este capítulo busca resaltar y revisar el progreso importante en el ámbito de la edición de células humanas usando sistemas CRISPR-Cas, el uso de virus como vectores para terapia génica y la aplicación de células diseñadas para estudiar y tratar enfermedades.

Palabras clave: CRISPR / Cas Terapia génica Cirugía del genoma Oftalmología.


¿Qué es la transfección?

La transfección es un método de transferencia de genes en el que el material genético se introduce deliberadamente en otra célula mediante métodos químicos, no químicos o basados ​​en partículas. El mecanismo de transfección implica la creación de poros en la membrana celular, lo que permite que el ADN extraño pase a la célula huésped. Los tipos de vectores utilizados en la transfección son plásmidos, cósmidos, BAC, YAC o HAC. Según el mecanismo de creación de poros, se pueden identificar diferentes tipos de métodos de transfección. Los tres tipos de transfección son la transfección mediada por productos químicos, la transfección no mediada por productos químicos y la transfección basada en partículas. La transfección no química a través de BAC se muestra en Figura 1.

Figura 1: Electroporación

Transfección mediada por sustancias químicas utiliza fosfato de calcio, polímeros catiónicos o liposomas. los transfección no química utiliza electroporación, impalefección, sonoporación, transfección óptica o administración hidrodinámica. los transfección basada en partículas utiliza la técnica de la pistola de genes en la que el ADN extraño se transfiere con el uso de una nanopartícula. La magnetofección y la nucleofección son los otros dos métodos de transfección basada en partículas. En la magnetofección, las partículas que transportan ADN extraño se concentran en la célula huésped con la ayuda de un campo magnético. En la nucleofección, se usa un choque térmico para transferir ADN extraño a la célula huésped.


Progreso

La transferencia de genes basada en plásmidos tiene ventajas en comparación con el uso de vectores virales

Se han desarrollado vectores virales recombinantes como métodos altamente eficaces para la administración de genes a una variedad de tejidos. La eficacia de estos vectores se debe a la presencia de proteínas virales que interactúan con los receptores de la superficie celular. Desafortunadamente, estas proteínas virales evocan respuestas inmunes específicas que pueden limitar la capacidad de volver a administrar el vector. Esto puede ser un problema particular en la traducción de estudios preclínicos a tratamientos humanos, ya que una proporción significativa de la población puede haber encontrado previamente el virus y por tanto tener anticuerpos neutralizantes.

Por el contrario, los vectores plasmídicos están compuestos completamente por círculos cerrados covalentemente de ADN de doble hebra sin proteínas asociadas. Sin embargo, la administración de genes con vectores plasmídicos es muy ineficaz a menos que el ADN esté asociado con otras moléculas y / o se aplique energía física para ayudar a la entrada celular. El uso de liposomas y complejos dendrímeros ha mejorado la entrega de genes a algunos tejidos. en vivo, pero la mejora más importante ha sido el uso de sistemas de entrega física que permiten la entrega de genes basados ​​en plásmidos para alcanzar eficiencias cercanas a las logradas con los vectores virales.

El ADN plasmídico, aunque en sí mismo es una molécula compleja, es sustancialmente más fácil de producir en masa y controlar la calidad que los vectores virales. Estos problemas, junto con la baja inmunogenicidad y la falta de integración observada con el ADN plasmídico, lo convierten en un reactivo muy atractivo para la terapia génica humana, siempre que se pueda lograr una administración de alta eficiencia. Los ensayos clínicos realizados hasta la fecha con ADN plasmídico desnudo no han informado efectos nocivos. 1, 2

Los métodos físicos demostrados para mejorar la transfección de plásmidos en vivo se revisan a continuación. Todos los métodos mejoran la transferencia de genes acercando el ADN plasmídico a la membrana celular y / o provocan una microinterrupción temporal de la membrana celular, aumentando así el paso del plásmido al interior de la célula.

La aplicación de un campo eléctrico mejora drásticamente la transferencia de genes de plásmidos en vivo

El cambio más sustancial en la eficiencia de la transferencia de genes basada en plásmidos se ha observado cuando la administración del plásmido es seguida por la aplicación de una serie de pulsos eléctricos como una forma de en vivo electroporación (también denominada electropermeabilización o electrotransferencia). Esta tecnología se basa en los estudios anteriores de in vitro electroporación y en vivo entrega de macromoléculas a tumores locales. Esta última metodología se ha llevado con éxito a ensayos clínicos con el fármaco citotóxico bleomicina. 3

En vivo La electroporación de ADN plasmídico se utilizó por primera vez para la piel y el hígado, pero el músculo esquelético ha atraído recientemente mucha atención, ya que la expresión del plásmido episomal puede durar mucho tiempo en este tejido. De hecho, se ha estudiado una amplia gama de tejidos que incluyen piel, riñón, pulmón, hígado, músculo esquelético y cardíaco, articulaciones, médula espinal, cerebro, retina, córnea y vasculatura. 4, 5, 6, 7 En la mayoría de los estudios, la electroporación aumentó la expresión génica de 100 a 1000 veces en comparación con la inyección de ADN plasmídico desnudo. No se sabe con certeza el mecanismo exacto por el cual se mejora la entrega de plásmido a las células, aunque está claro que las membranas se vuelven efectivamente permeables una vez que se alcanza un voltaje crítico (del orden de 200 V / cm en vivo). Se cree que esto ocurre por la formación de poros hidrófilos y el movimiento subsiguiente del plásmido a través de estos poros como efecto electroforético local. Un artículo reciente ha desafiado esta opinión generalizada. Golzio et al 8 utilizaron plásmido marcado con fluorescencia para visualizar la interacción con células individuales in vitro. En su sistema, se observó que el plásmido se acumulaba en la membrana celular mediante un efecto electroforético, pero no se movía inmediatamente hacia el citosol. El movimiento hacia el citoplasma fue relativamente lento y continuó después de que finalizó la aplicación del campo eléctrico. Esto es consistente con el mecanismo de captación activa de ADN propuesto por Budker. et al, 9 pero puede representar una nueva interacción física con la membrana celular ya que, con el tiempo, el plásmido que aún no había entrado en el citoplasma se volvió inaccesible para un tinte de ADN. Sin embargo, esta acumulación de plásmidos aún no se ha observado. en vivo y la compleja organización de tejidos como el músculo puede modificar significativamente este proceso. Muy recientemente, Bureau et al 10 informaron de la existencia de un conjunto de plásmidos que parece escapar a la atención de las nucleasas extracelulares y puede ser electrotransferido con éxito hasta 4 h después de la inyección del ADN.

La elección del diseño de electrodos es actualmente muy variable y existe una clara necesidad de buenos estudios comparativos. Zhang et al 11 examinaron la electroporación de la piel usando un electrodo de calibre y lo compararon con un electrodo de meandro (el último es una serie de electrodos entrelazados positivos y negativos Figura 1a). Ambos fueron igualmente efectivos, pero el electrodo de meandro parece ser un diseño más amigable para el paciente, ya que evita la necesidad de pellizcar la piel entre las pinzas. Para otros tejidos, como el hígado y el músculo, se puede elegir entre electrodos de placa y de aguja (Figura 1b yc). En general, los electrodos de placa parecen proporcionar un campo eléctrico más uniforme y se usan más comúnmente para estudios en animales pequeños, pero pueden no ser adecuados para la electrotransferencia en animales grandes debido a los grandes campos eléctricos que deberían aplicarse a tejidos más grandes. El patrón de pulsos eléctricos también varía considerablemente entre los estudios que van desde pulsos de voltaje moderado (por ejemplo, 200 V / cm) de decenas de milisegundos hasta pulsos de microsegundos de alto voltaje. Aún no está claro cuál es el patrón óptimo, pero Bureau et al 12 mostraron que sus mejores resultados en el músculo esquelético se obtuvieron cuando un solo pulso de alto voltaje fue seguido por una serie de pulsos de bajo voltaje. Propusieron que el pulso inicial efectuaba una electroporación de la membrana y que los pulsos posteriores electroforesizaban el ADN en la fibra muscular. Actualmente, la mayoría de los artículos parecen utilizar un patrón con un promedio de 6 a 10 pulsos de 20 a 40 ms a 1 Hz con una intensidad de campo del orden de 200 V / cm.

Electrodos de meandro (a), calibre (b) y aguja (c) utilizados para en vivo electrotransferencia. En el caso del electrodo de meandro, se genera un campo eléctrico entre cada electrodo positivo y negativo con parte del campo entrando en el tejido. Este diseño de electrodo es el menos invasivo de los tres. Con los electrodos de calibre, se genera un campo eléctrico casi uniforme entre las placas de electrodos. Con los electrodos de aguja, se genera un campo entre las agujas. En algunos casos, se han utilizado múltiples electrodos de aguja.

Una de las limitaciones de la electrotransferencia es que puede haber un daño sustancial asociado con el procedimiento y que esto puede limitar la eficiencia de la transfección. 13 Un artículo reciente de Durieux et al 14 demuestra de manera convincente que el daño muscular está estrechamente asociado con la presencia del ADN plasmídico durante la electrotransferencia y empeora cuando se expresa el gen indicador LacZ. La modificación de la magnitud y duración de los pulsos eléctricos puede mejorar, pero no prevenir por completo, todo el daño asociado al plásmido después del tratamiento del músculo esquelético.

Decano et al 15 han proporcionado recientemente una demostración dramática del potencial de en vivo electroporación para el pulmón. Aplicaron electrodos de calibre a ambos lados del tórax de los ratones después de la instilación intratraqueal de una solución de ADN plasmídico. Mostraron una expresión sustancial del gen informador a corto plazo en el pulmón después de este procedimiento con una baja mortalidad en los animales tratados. La expresión génica se observó predominantemente en los alvéolos periféricos y tanto en el epitelio como en las células más profundas. El análisis histológico de los pulmones 24 h después del tratamiento no reveló signos evidentes de daño. Por tanto, la electroporación parece ser un procedimiento relativamente seguro en los pulmones. La aplicación en humanos podría ser posible usando electrodos dirigidos por broncoscopio, pero solo daría como resultado el tratamiento de áreas locales del pulmón.

Otros objetivos desarrollados recientemente para la electroporación incluyen las articulaciones 16, la médula espinal 17 y la retina. 18 Por lo tanto, Matsuda y Cepko 19 han informado que se pueden lograr eficiencias de transferencia de genes muy altas en las células de la retina, en particular los fotorreceptores, con la electroporación en ratas y ratones recién nacidos. Hemos demostrado que la electroporación también se puede utilizar para administrar oligonucleótidos al músculo, específicamente para la omisión de exones mediada por antisentido en el músculo esquelético distrófico. 20

La electroporación ha sido ampliamente probada para la transferencia de genes a tumores. Incluso la transferencia del vector plasmídico vacío es suficiente para provocar una regresión tumoral significativa en algunos modelos. Se ha demostrado que la electroporación de plásmidos que contienen interleucina 12 (IL-12) e interleucina 18 (IL-18) produce un efecto sinérgico en la inhibición del crecimiento tumoral, tanto para el tumor tratado como para el tumor contralateral no tratado. 22 En otro estudio, la electrotransferencia de una combinación de bleomicina y un plásmido que codifica IL-12 no solo produjo una remisión completa en una proporción de ratones portadores de un melanoma subcutáneo, sino que también proporcionó un efecto protector significativo contra las metástasis establecidas. 23 Dado el éxito de la electrotransferencia de bleomicina en muchos ensayos clínicos, 3 la combinación con la transferencia de genes parece ofrecer un mayor potencial en la administración de un tratamiento clínicamente eficaz.

Liu y Huang 24 han utilizado una combinación de administración vascular con electroporación para el hígado. La administración intravenosa de plásmido a través de la vena de la cola en el ratón aumentó la expresión génica en el hígado después de la electroporación en comparación con la inyección directa en el hígado antes de la electroporación. La expresión se mejoró aún más bloqueando temporalmente el flujo sanguíneo a través de la vena cava o la vena porta y la vena hepática. Queda por ver si este enfoque combinado funcionará en otros tejidos.

La electrotransferencia también se puede utilizar para la vacunación genética, y varios laboratorios han demostrado mejoras sustanciales en las respuestas a una variedad de antígenos. 25, 26, 27 Tjelle et al 28 han propuesto que la electrotransferencia de ADN plasmídico que codifica inmunoglobulinas podría ser una alternativa a la administración de anticuerpos monoclonales en el tratamiento de una variedad de afecciones y han demostrado una expresión prolongada tanto en ratones como en ovejas.

Un interesante desarrollo de en vivo La electroporación con fines de investigación ha sido la aplicación de esta tecnología al desarrollo del sistema nervioso central (SNC) de embriones de roedores. 29, 30, 31 Usando electrodos muy finos, es posible administrar plásmidos a regiones definidas del cerebro en desarrollo para rastrear la migración celular y modificar los patrones de desarrollo. Recientemente, Wei et al 32 han extendido esta tecnología a roedores adultos, demostrando que es posible expresar de forma selectiva construcciones basadas en plásmidos en regiones específicas del SNC adulto.

Por último, no se ha informado previamente de la integración del ADN plasmídico después de la inyección intramuscular directa a pesar de una serie de estudios cuidadosos de varios laboratorios. Por el contrario, Wang et al 33 han informado recientemente que la integración del ADN plasmídico se puede detectar después de la electroporación del músculo esquelético en vivo. Sin embargo, este es todavía un evento muy raro, por debajo del nivel de mutación genómica de fondo, por lo que es poco probable que represente un riesgo de seguridad significativo con respecto a la aplicación clínica.

La administración vascular presurizada mejora la transfección de plásmidos en vivo con una distribución más extendida que la inyección local

Como el ADN plasmídico no contiene proteínas para la unión a los receptores celulares, el plásmido desnudo no tiene un direccionamiento específico a diferentes tipos de células y, por lo tanto, es esencial que el ADN se coloque en estrecho contacto con el tipo celular deseado. El uso de presión para lograr este contacto cercano también ha aumentado dramáticamente la eficiencia del parto, en particular al hígado y al músculo esquelético.

El uso de inyecciones de volumen extremadamente alto (equivalente al volumen total de sangre) administradas rápidamente a través de la vena de la cola del ratón conduce a una transfección altamente eficiente de hepatocitos en la mayor parte del hígado. Una serie de artículos muy recientes ha intentado explicar la base física de este fenómeno. Zhang et al 34 han demostrado que la administración de genes hidrodinámicos conduce a una disminución transitoria de la función cardíaca y un rápido aumento de la presión venosa que conduce al agrandamiento de las fenestras en los sinusoides hepáticos. Esto, a su vez, permite que la presión hidrostática actúe sobre las membranas de las células de los hepatocitos provocando poros o defectos transitorios, un proceso que denominan hidroporación. Otros grupos 35, 36, 37 han demostrado que la dinámica del proceso de transfección respalda este concepto de hiperpermeabilidad transitoria de la membrana celular de los hepatocitos y no respalda el mecanismo de captación activa propuesto por Budker. et al. 9 El uso de esta técnica hidrodinámica en el ratón ha permitido comparar el efecto de diferentes secuencias de vectores, 38 la prueba de construcciones de expresión óptimas 39 y la entrega eficiente de ARNip al hígado. 40, 41 Se ha aplicado la misma técnica a las ratas. 42 Sin embargo, este enfoque, si bien es útil para estudios en roedores, no es directamente aplicable a los seres humanos. Eastman et al 43 examinaron el suministro hidrodinámico local en lóbulos específicos del hígado de conejo utilizando catéteres de balón. Demostraron que el parto local mediado por presión se puede lograr de manera segura con este enfoque sin la necesidad de cirugía para exponer el hígado. Al igual que con las inyecciones en la vena de la cola, solo hubo elevaciones transitorias en las enzimas específicas del hígado liberadas en la sangre. La administración de plásmidos mediada por presión también se ha utilizado para otros tejidos, como el riñón. 44 La importancia de la presión hidrostática local ha sido demostrada por el trabajo de Liu et al, 45 quienes informan que el masaje mecánico del hígado aumenta la transferencia de genes después de la administración intravenosa de ADN plasmídico.

Huang et al 46 también han administrado con éxito plásmido al diafragma mediante el acceso venoso con oclusión temporal de la vena cava craneal. Para el suministro a la musculatura de las extremidades, el suministro de plásmido mediado por presión se realiza generalmente a través del sistema arterial. Este enfoque se ha utilizado para la administración de plásmido a múltiples músculos en las extremidades temporalmente aisladas de primates, 47 y la perfusión de extremidades aisladas es una técnica establecida en la práctica clínica para el tratamiento de tumores. 48 La captación y expresión del plásmido fue más eficaz que la inyección intramuscular directa y se detectó en todos los músculos de la extremidad perfundida. No ha habido publicaciones posteriores que utilicen esta metodología de administración de genes, aunque en la revisión de Herweijer y Wolff se informaron estudios no publicados. 49 Hemos observado la expresión de minidistrofina humana (usando un anticuerpo específico de especie) en hasta el 30% de las fibras musculares en los músculos de las extremidades de ratas después de un parto arterial mediado por presión (Fletcher, Wells y Wells, resultados no publicados). La misma técnica se utiliza actualmente para administrar distrofina al músculo distrófico de las piernas del modelo canino de distrofia muscular ligada al cromosoma X. 50 Un artículo muy reciente del grupo 51 de Huang ha demostrado que puede no ser necesario utilizar la ruta arterial para administrar el plásmido al músculo esquelético. Demostraron una administración de una eficacia notablemente alta de un plásmido de distrofina al músculo distrófico del ratón por las rutas arterial y venosa, siempre que hubiera una oclusión temporal del suministro de sangre que aumentara la presión dentro del lecho vascular del músculo.

El ultrasonido clínicamente aplicable puede mejorar la entrega de genes basados ​​en plásmidos en vivo

En vivo La administración mediada por electroporación y presión, aunque muy eficaz, son técnicas bastante invasivas. En consecuencia, se han examinado otros métodos para determinar su capacidad para proporcionar fuerza motriz en el suministro de ADN plasmídico. El ultrasonido tiene un uso clínico general tanto con fines terapéuticos como de diagnóstico. La ecografía de bajo nivel se utiliza para la obtención de imágenes de diagnóstico, las ondas de choque ultrasónicas se utilizan en el tratamiento de cálculos renales (litotriptor) y la ecografía focalizada de alta intensidad (HIFU) se utiliza para la destrucción térmica de los tumores. Varios grupos han demostrado la utilidad de estas diversas modalidades de ultrasonido para mejorar el suministro de ADN plasmídico. Por ejemplo, Taniyama et al han utilizado ultrasonido de dosis baja (1 min a 1 MHz, 2,5 W / cm 2) para mejorar la entrega de genes en el músculo esquelético 52 y la arteria carótida. 53 Asimismo, otros grupos han utilizado un enfoque similar para la transferencia de genes al músculo esquelético 54, 55, 56 y al corazón. 57, 58 En contraste, Huber et al 59 utilizaron HIFU (1 min a 0,85 MHz, 155 W sobre un ancho de 2 mm) para realizar la transferencia de genes a la arteria carótida con el argumento de que esta modalidad permite la localización específica de la transferencia de genes mejorada. Demostraron un aumento de ocho veces en la expresión del gen informador total con HIFU solo y un aumento de 17,5 veces cuando se utilizaron burbujas de contraste de ultrasonido. Sin embargo, el aumento informado en la transfección con HIFU mejorado con contraste no es significativamente diferente de los aumentos de veces que se muestran en muchos de los estudios de ultrasonido con suministro de energía más baja. Se han utilizado ondas de choque HIFU y litotriptor para extirpar tumores y realizar la transferencia génica a la masa residual de forma simultánea, pero la expresión génica fue muy variable, posiblemente debido a grados variables de ablación tumoral. 60

La aplicación de ultrasonido da como resultado una cavitación acústica que puede alterar los tejidos y producir una permeabilización transitoria de la membrana, mejorando así la entrega de plásmido al citoplasma. Los agentes de nucleación, como los agentes de contraste de ultrasonidos, pueden mejorar la cavitación, y varios estudios han examinado una variedad de dichos agentes de contraste, concluyendo que las microburbujas de gas octa-fluoropropano recubiertas de albúmina (Optison) son preferibles a varios otros agentes comúnmente disponibles. 61, 62 Taniyama et al 52 han mostrado micrografías electrónicas de células tratadas con Optison y ultrasonido en cultivo que sugieren que los poros transitorios en la membrana celular se abren de hecho inmediatamente después del tratamiento. Incluso con el uso de reactivos de contraste de ultrasonido, la mayoría de los estudios solo muestran un aumento promedio de 10 a 15 veces en la expresión del gen indicador, que es considerablemente inferior a lo que se puede lograr con la electroporación.

Yamashita describió una combinación de electroporación y ultrasonido (electro-sonoporación). et al. 63 En su estudio, la electro-sonoporación fue superior a la electroporación o al ultrasonido solo. Sin embargo, es difícil comparar este estudio con otros en el campo debido a detalles metodológicos insuficientes para el componente de electroporación.

También se pueden utilizar otros métodos físicos como láser, campos magnéticos y suministro balístico para aumentar en vivo transferencia de genes, pero generalmente son menos efectivos

El láser enfocado proporciona una fuente de energía alternativa, y el potencial de esta técnica se demostró en un artículo reciente de Zeira. et al. 64 Los autores informaron que la entrega de genes en el músculo podría mejorarse mediante la aplicación de un láser infrarrojo de femtosegundos (5 sa 30 mW) y lo compararon con en vivo electroporación de la misma cantidad de ADN en el mismo músculo (pulsos de 16 × 20 ms a 200 V / cm). Los autores concluyeron que hubo una eficiencia similar en la administración de genes y que esto se acompañó de un daño sustancialmente menor cuando se utilizó la transducción de genes con rayo láser (LBGT). El mecanismo por el cual la transferencia génica potenciada por láser no estaba claro, pero probablemente implicaba una alteración local de la membrana de las células musculares. De este trabajo surgen dos cuestiones. La comparación con la electroporación no fue inesperada ya que varios otros grupos, incluyéndonos a nosotros, han demostrado que múltiples pulsos a 200 V / cm causan daño muscular sustancial y que las modificaciones al protocolo pueden reducir este daño. 13, 65 En segundo lugar, el láser se enfocó a 2 mm por debajo de la piel, mientras que se requeriría un enfoque sustancialmente más profundo para la administración percutánea al músculo esquelético humano. Queda por ver si LBGT se puede ampliar significativamente en estudios de músculos más grandes u otros tejidos.

También se pueden usar campos magnéticos fuertes para proporcionar una fuente de energía que ayude a la transferencia de genes cuando el ADN plasmídico se acopla a nanopartículas paramagnéticas. Se ha informado que la aplicación de campos magnéticos después de la inyección local de nanopartículas asociadas a plásmidos (magnetofección) mejora en vivo transferencia de genes al tracto gastrointestinal y la vasculatura del oído. 66 La transferencia genética mejorada asociada con la magnetofección no parece ser tan sustancial como la observada con la administración hidrodinámica o la electroporación, aunque aún no se han hecho comparaciones directas.

El bombardeo de tejidos por micropartículas recubiertas de plásmido ha recibido previamente una atención considerable para la transferencia de genes en animales después de haber sido desarrollado originalmente para la entrega de genes a plantas. La aplicación de la tecnología de pistola genética en animales se ha limitado a tejidos superficiales como la piel. En trabajos recientes se ha seguido utilizando este enfoque para aplicaciones como la terapia génica del dolor de vejiga mediante la transferencia del gen de pro-opiomelanocortina en un modelo de rata, 67 la transferencia de IL-10, IL-12 y B7.1 a tumores murinos, 68 transferencia de genes al corazón, 69 transferencia de genes a embriones de ratón 70 y tratamiento a través de la piel de un modelo de ratón de deficiencia de maltasa ácida lisosomal (GAA, también conocida como enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II). 71 Más significativamente, Dileo et al 72 han informado recientemente de un nuevo diseño de pistola de genes que libera micropartículas a una presión más alta, accediendo así a tejidos subcutáneos, como músculos o tumores, y consecuentemente logrando una expresión génica a más largo plazo.

La administración de genes balísticos se ha utilizado más ampliamente para la administración de vacunas de ADN a la piel. Se ha informado que este enfoque es superior a otros métodos de suministro de plásmidos a la piel 73, 74 pero tiende a generar una respuesta inmune Th2 (humoral) en lugar de Th1 (citotóxica) que comúnmente sigue a la administración intramuscular. 75, 76 Esta diferencia en la naturaleza de la respuesta inmune puede modificarse mediante diferentes estrategias de refuerzo después de la vacunación de cebado inicial mediante la administración de ADN plasmídico mediante pistola de genes. 77


Resultados

Transfección por reactivos

Para determinar el reactivo de transfección preferido para cada tipo de célula, consideramos comparativamente lo siguiente: la cantidad de CAT producida, la relación entre CAT / proteína total y la supervivencia celular. Al considerar los resultados obtenidos en los cuatro tipos de células utilizados, los resultados muestran que los tres reactivos de mejor rendimiento fueron FuGENE 6, Lipofectamine PLUS y GenePORTER (Tabla 1 y Figura 1). Como se presenta en la Tabla 1, los valores muestran un rango en los cuatro tipos de celda utilizados. Los resultados individuales se informan en el texto a continuación y en la Figura 1, donde se muestran los resultados encontrados usando la concentración óptima de plásmido para cada reactivo.

La Figura (a) muestra la cantidad de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) producida en cada una de las líneas celulares, cuando se usaron los diferentes reactivos de transfección, en la cantidad óptima de plásmido. La figura (b) muestra el% de supervivencia correspondiente cuando se usaron cada uno de estos reactivos y cantidades de plásmido. Nota: Los resultados se muestran como una media +/- DE de dos experimentos individuales (realizados por duplicado).

En CoASMC, el uso de FuGENE 6 logró los mejores resultados. Produjo casi el doble de CAT por ml de medio que las células transfectadas con el segundo reactivo de mejor rendimiento, Lipofectamine PLUS (Figura 1). Cuando se utilizaron 1 μg y 2 μg de plásmido, se obtuvieron proporciones de 3-5 y la tasa de supervivencia celular estuvo entre 69 y 74%, respectivamente (Figura 1). In AoSMC, Lipofectamine PLUS gave the best results. It produced more CAT per ml media than cells transfected with the next best performing reagent, FuGENE 6 (Figure 1). When 0.8 μg and 1.6 μg plasmid was used, ratios of 10–18 were obtained and the cell survival rate was between 53 and 58%, respectively (Figure 1).

In CoAEC, best transfection efficiency was achieved by FuGENE 6 : it produced more than double the amount of CAT per ml than cells transfected using the other reagents (Figure 1). When 1 μg and 2 μg of plasmid were used, ratios of 8–11 were obtained and the cell survival rate was between 64 and 73%, respectively (Figure 1).

FuGENE 6 gave the best results in AoEC, as well : it produced more CAT per ml media than cells transfected with the second best liposome, Lipofectamine PLUS (Figure 1). When 1 μg and 2 μg of plasmid was used, ratios of 7–16 were obtained and the cell survival rate was between 79 and 88%, respectively (Figure 1).

Transfection by electroporation

Electroporator

To optimize the electroporation procedure, a range of voltage, capacitance and resistance settings were used. For SMC the initial resistance and capacitance settings were 725Ω and 125 μF and for EC they were 950Ω and 25 μF. The voltage settings tested varied from 400 – 500 V. The optimal voltage in all four cell types was 450 V, illustrated by AoSMC (Figure 2).

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when voltage settings were varied using the ECM 630 electroporator. Capacitance and Resistance were held constant at 125 μF and 725Ω respectively. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding settings. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

After the voltage settings had been established the optimal resistance and capacitance were found. For CoA and Ao SMC the best resistance setting was found to be in the area 725–900Ω (Figure 3), but best capacitance varied between the two cell types. In CoASMC, the best capacitance setting was 75 μF (Ratio 2.5 and 70% survival). In some experiments, we achieved a ratio of up to 6 when 125 μF was used, but survival dropped to around 30%. Nevertheless, we choose 75 μF as the best setting because it resulted in higher cell survival. In AoSMC the best results were obtained when 125 μF were used (Ratio of 0.92 and a survival of 30%) (Figure 4). The higher the capacitance settings was, the lower become the cell survival (Figure 4b).

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when resistance settings were varied using the ECM 630 electroporator. Voltage and capacitance were held constant at 450 V and 125 μF respectively. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding settings. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when different capacitance settings were used on the ECM 630 electroporator (BTX, San Diego, USA). Voltage and resistance were held constant at 450 V and 800Ω, respectively. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding settings. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

Both CoA and Ao EC reacted similarly to the different settings. Resistance was tested between 850–1050Ω and at 900Ω a ratio of 25 was obtained (55% survival). We tested capacitance varying from 25 – 75 μF. When 50 μF was used, we obtained a ratio of 40 and a survival of 38%. However, 25 μF was the best setting since it resulted in better cell survival (61%) (results not shown).

Nucleofector

Optimized nucleofector protocols were available for AoSMC and CoAEC. These methods were tested and the results were compared with the electroporation results. For AoSMC we tested two cell suspensions, 5 × 10 5 and 1 × 10 6 cells per reaction. Both the ratio and the survival increased by increasing the number of cells used (Figure 5a). At the highest plasmid dose, the cell survival was 80% (Figure 5b).

Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in AoSMC when different amounts of CAT plasmid were transfected into different cell numbers using the Nucleofector instrument, program U-25. Figure (b) shows the % survival obtained at the corresponding plasmid amounts. Results represent mean of duplicates +/- SD.

In CoAEC, we observed a dose-response for the CAT/protein ratio when 1–10 μg plasmid was used (Figure 6a), and at the highest plasmid dose of 10 μg, 30–46 % cell survival was achieved (Figure 6b).

(a) and (b): Figure (a) shows the transfection efficiency obtained in CoAEC when different amounts of CAT plasmid were transfected, using the Nucleofector instrument (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany), program S-05. Figure (b) shows the % survival at the corresponding plasmid amounts. Results represent mean of triplicates +/- SD of a typical experiment.

Transfection by PCI

The initial experiments with PCI were aimed to find the light dose at which we obtained at least 50 % survival. For AoSMC this was observed to be 100 sec. In further experiments light doses varying from 25 to 100 seconds were used. A low transfection effect, ratio of 0.3, was achieved when the cells were exposed to light before the transfection of 5 μg plasmid (Table 2).

The light dose that gave 50% survival in CoAEC was between 40 and 50 seconds, and for AoEC it was 32 seconds. The best transfection effect obtained had a ratio of 4.7 and 55% survival, when the cells were given 5 μg plasmid before exposure to light for 25 seconds (Table 2). None effect was seen when the cells were exposed to light after addition of plasmid.


Electroporation is based on a simple process. Host cells and selected molecules are suspended in a conductive solution, and an electrical circuit is closed around the mixture. An electrical pulse at an optimized voltage and only lasting a few microseconds to a millisecond is discharged through the cell suspension. This disturbs the phospholipid bilayer of the membrane and results in the formation of temporary pores. The electric potential across the cell membrane simultaneously rises to allow charged molecules like DNA to be driven across the membrane through the pores in a manner similar to electrophoresis (Shigekawa and Dower, 1988).

The main advantage of electroporation is its applicability for transient and stable transfection of all cell types. Furthermore, because electroporation is easy and rapid, it is able to transfect a large number of cells in a short time once optimum electroporation conditions are determined. The major drawback of electroporation is substantial cell death caused by high voltage pulses and only partially successful membrane repair, requiring the use of greater quantities of cells compared to chemical transfection methods. While more modern instrumentation, such our Invitrogen™ Neon™ Transfection System, overcome high cell mortality by distributing the electrical pulse equally among the cells and maintaining a stable pH throughout the electroporation chamber, optimization of pulse and field strength parameters is still required to balance the electroporation efficiency and cell viability.


Electroporation and Nucleofector TM Technology

The ability to introduce DNA, RNA or proteins into cells to alter their genotype or phenotype (a process called transfection) is crucial in a variety of life science applications. Various types of transfection methods exist and choosing which approach to use often depends on its suitability to the application in question. Electroporation is a physical transfection method that permeabilizes the cell membrane by applying an electrical pulse and moves molecules via the electrical field into the cell. It is a powerful tool for transfecting large DNA fragments and achieving good transfection efficiencies in cell lines. However, due to high toxicity traditional electroporation has been less successful for efficiently transfecting more biologically relevant primary cells and stem cells, which has limited its application.

Our solution is an improved electroporation technology, the Nucleofector TM Technology, originally introduced into the market by legacy Amaxa in 2001. It enables highly efficient, transfection of primary cells, stem cells, neurons, and cell lines that have traditionally been difficult to transfect via electroporation and other non-viral transfection methods. In recent years, this has opened novel opportunities for disease research and therapeutic development, including the advancement of gene therapies, immunotherapies, and stem cell generation.

In the following sections, we provide an overview of Nucleofector TM Technology, and explore what benefits it can bring to your research over traditional electroporation methods. We also summarize the transfection capabilities and flexible scaling offered by our various Nucleofector TM Platforms, to help you choose which one is best suited to your specific application. This can ensure you obtain the very highest levels of transfection efficiency and quality for your research.


Afiliaciones

Rutgers, The State University of New Jersey, Department of Biomedical Engineering, Piscataway, 08854, United States

Joseph J. Sherba, Stephen Hogquist, David I. Shreiber & Jeffrey D. Zahn

Rutgers, The State University of New Jersey, Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Piscataway, 08854, United States

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Contribuciones

J.J.S., H.L., J.W.S., D.I.S. and J.D.Z. conceived the study. J.J.S. and S.H. conducted the experiments. All authors analyzed the results. All authors reviewed the manuscript.

Autor correspondiente


Fondo

Electroporation is a physical method that can be used for gene delivery characterized by application of brief electric pulses to permeabilize the cell membrane, and thereby facilitating the uptake of negatively charged DNA [1, 2]. The application of a potential difference across a membrane is an effective strategy to form transient pores [3]. In principle, cell membranes act as electrical capacitors and the application of a high-voltage electric field results in a temporary depolarization of a cell membrane and the formation of pores, which allows the entrance of macromolecules. The application of electric pulses is not only used for cell permeabilization in vitro for delivery of micro-and macromolecules, but is also used in vivo for permeabilization of tissues during certain specific treatments against cancers via electrochemotherapy (ECT) where electric pulses are applied to enable entry of non-permeant cytotoxic molecules [4]. The conventional electroporation is done in cuvette-style parallel plate setups, where the cell suspension and molecules to-be-delivered are mixed together in the electroporation buffer between two plate electrodes connected to a generator of high electric voltage, and is called bulk electroporation [3]. Electroporation is viewed as a promising method for intracellular delivery of a wide variety of cargos and being relatively efficient as compared to other methods [3, 5]. Fibroblasts are the most preferred somatic cells in gene transfection studies, since they can be derived either from fetal or adult tissue samples [6]. Many authors previously reported the use of electroporation in bovine fibroblasts and in fibroblastoid cells of other mammals as an efficient method of DNA transfection [7]. Though primary fibroblasts are commonly used cells in many studies, they are considered as difficult to transfect cells [8]. Till date, few data are available describing the optimization of electroporation conditions for bovine fetal fibroblasts (BFFs). Cattle is an economically important livestock [9], and increasingly used as a model species for research in artificial reproduction [10, 11]. The establishment of somatic cell nuclear transfer (SCNT) [12] allowed the generation of transgenic and knock-out cattle via the use of genetically modified fibroblast donor cells [13, 14]. The recently developed designer nuclease (ZNF, TALEN and Crispr/Cas9) were also employed to edit endogenous genes or knock-in genes-of-interest into bovine primary cells, which are subsequently used in animal cloning via SCNT [15,16,17,18,19]. These examples highlight the importance of efficient transfection methods for bovine primary cells.

In principal, two distinct wave forms of a pulse can be generated in a bulk electroporation setting, exponential decay and square wave [20]. Whereas both wave forms were used for electroporation, the latter was proven to be optimal [20] for mammalian cells. Square-wave electroporators represent the most widely used systems, they allow to control both voltage and pulse duration, and can produce rapidly repeating pulses. Several factors play a critical role in optimal transfection during electroporation. These include pulse amplitude, number, duration, interval between multiple pulses, and cuvette type [21, 22]. The most important factor that determines ionic strength on the cells and thereby the viability of cells post electroporation is the electroporation buffer. It is recommended to maintain hypo-osmolar conditions during electroporation since it enables easier and controlled electroporation [23]. However, some sources recommend iso-osmolar conditions to promote efficient DNA uptake and cell viability [18].

Whereas the gene delivery is the primary aim and protein expression being the ultimate aim of the transfection, viability is critical in terms of maintaining critical seeding density post electroporation. Though there are recent advances in electroporation technique, like micro- and nano-electroporation, such novel strategies have not yet been demonstrated to supersede the basic cuvette-style electroporation [3]. Hence, in spite of being a well-established technique, there is still a great potential to enhance the square wave electroporation outcome. Also, the rational cell type-dependent approach of electroporation, paves the way for getting additional insights into physical prerequisites for optimum transfection and better electroporation outcomes [24]. Hence, we hypothesized that such improved transfection performances can be obtained with selective interventions at critical steps in the process like choice of electroporation buffer, altering pulse parameters, and type of the cuvettes. The hypothesis was drawn by considering the already established concept of Maxwell-Wagner polarization, a key parameter for electroporation, which is an induced transmembrane voltage generated by an external electric field due to the variations in electrical properties of cell membrane, cytoplasm, and external medium [25]. Here, the transient expression was assessed, but a high initial transfer is of course a prerequisite for a stable long-term transformation.


Electroporation vs gene guns - Biology

Efficient DNA-mediated transformation of Tetrahymena cells has been accomplished by three methods: microinjection [1], electrotransformation [2] and biolistic bombardment [3]. Both the germline nucleus (micronucleus) or the somatic nucleus (macronucleus) can be transformed. (Click here for a description of the two types of nuclei.) Fig. 1 below shows the optimum life cycle stages for various types of transformation. By the appropriate choice of vectors and conditions, the incoming plasmid can be autonomously replicated in the MAC for many fissions, or the plasmid DNA can be inserted at the appropriate chromosome location by exact insert-mediated homologous recombination. The latter phenomenon allows gene replacements and knockouts, either in the MAC [ref.4 Fig. 2 below] or the MIC (ref.5 Fig. 3 below). Replacements and knockout strains are extremely valuable experimental tools, including the testing the indispensability of cloned genes and isolation of mutants after random mutagenesis of cloned genes. (Click here for a general Introduction to Tetrahymena Genetics.)

Referencias

1. Tondravi,MM Yao,M-C (1986): Transformation of Tetrahymena thermophila by microinjection of ribosomal RNA genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4369-4373.

2. Gaertig,J Gorovsky,MA (1992): Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila by electroporation of conjugants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9196-9200.

3. Cassidy-Hanley,D Bowen,J Lee,JH Cole,E VerPlank,LA Gaertig,J Gorovsky,MA Bruns,PJ (1997): Germline and somatic transformation of mating Tetrahymena thermophila by particle bombardment. Genetics 146, 135-147.

4. Gaertig,J Thatcher,TH Gu,L Gorovsky,MA (1994): Electroporation-mediated replacement of a positively and negatively selectable beta-tubulin gene in Tetrahymena thermophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 4549-4553.

5. Hai,B Gorovsky,MA (1997): Germ-line knockout heterokaryons of an essential alpha-tubulin gene enable high-frequency gene replacement and a test of gene transfer from somatic to germ-line nuclei in Tetrahymena thermophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 1310-1315.

Fig. 1. Stages of the Tetrahymena life cycle used for various methods of DNA-mediated transformation.

Hours indicate time after mixing of starved cells to initiate conjugation. BGg, germline transformation with the biolistic gun BGc, conjugant transformation of macronuclei with the biolistic gun CET, conjugant electrotransformation of developing macronuclei BGv, vegetative macronuclei transformation with the biolistic gun INJc, microinjection of developing macronuclei INJv, microinjection of vegetative macronuclei.

Fig. 2. Gene replacement by phenotypic assortment in transformed macronuclei.

Selection for complete gene replacement by phenotypic assortment enables the distinction between essential and non-essential genes. The initial transformant contains one transformed gene which has been disrupted with an expression cassette containing a drug-selectable marker. Its clonal progeny are serially transferred to higher drug concentrations thus killing cells with fewer copies of the selectable markers. For a non-essential gene (top diagram), complete replacement is possible. For an essential gene (bottom diagram), only incompletely assorted cells whose macronuclear copies of the gene have been partially replaced can be obtained. All arrows indicate multiple generations.

Fig. 3. Gene replacement in the germline knockout heterokaryons.

Creation and testing of knockout heterokaryons homozygous for disrupted ATU (alpha tubulin) genes in the micronucleus (deltaATU) and containing only wild type ATU genes in the macronucleus [4]. Chx is a dominant gene conferring resistance to cycloheximide (cy-r) while the wild type Chx+ is sensitive (cy-s). Mpr is a dominant gene conferring resistance to 6-methylpurine (mp-r) to which the wild type Mpr+ gene is sensitive (mp-s). Roman numerals indicate mating types mating types not determined are indicated by ?. Crosses (a), (b) and (d) are normal crosses, while cross (c) is a genomic exclusion cross (see Fig. 4 below for explanation of genomic exclusion). Note that in cross (d) only a mutant deltaATU/deltaATU Round I product of cross (c) is shown. An approximately equal number of non-mutant ATU/ATU Round I cells are obtained that do not yield any pm-r progeny. The genotype of the Mpr locus in Round I exconjugants was not determined. Values obtained for test crosses (b) and (d) are from a single subline.

Fig. 4. Genomic Exclusion

* ("star") strains, have defective micronuclei they can form conjugal pairs, but cannot donate genetic material [Allen,SL (1967) Genetics 55, 797-822]. When mated to a "star" strain, a normal strain ("left" conjugant, round 1) donates a gametic nucleus, but receives nothing in return. The single haploid nucleus in each conjugant then diploidizes and most cells separate without forming a new macronucleus. These cells retain their old (macronuclear) phenotype and are mature (can be immediately re-mated) but can have new micronuclear genotypes, depending on the genetic make-up of the normal parent and which meiotic product was (randomly) selected to form gametic nuclei. This process, referred to as Round 1 of genomic exclusion, greatly facilitates complementation testing and mutant rescue by cytoplasmic exchange during conjugation. Round 1 genomic exclusion or phenotypic assortment of heterozygotes each allow production of heterokaryons, cells with different macro- and micronuclear genotypes. Heterokaryons homozygous or heterozygous for a drug resistance gene in the transcriptionally inert micronucleus but having only drug-sensitive alleles in the macronucleus are drug sensitive. When these cells conjugated, the drug sensitive macronucleus is discarded and the drug resistance allele is expressed in the new macronucleus, allowing simple drug selection for successful mating. Round 1 genomic exclusion also allows creation of strains homozygous for deleterious or even lethal genes in their micronuclei and wild type genes in their macronuclei.


Ver el vídeo: Electroporation and microinjection method 12 biotechnology (Febrero 2023).