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3.3H: Análisis de difracción de rayos X - Biología

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Objetivos de aprendizaje

  • Resumir los métodos utilizados para el análisis de difracción de rayos X y las contribuciones que han hecho a la ciencia.

La difracción de rayos X (XRD) es una herramienta para caracterizar la disposición de los átomos en los cristales y las distancias entre las caras de los cristales. La técnica revela información detallada sobre la composición química, cristalografía y microestructura de todo tipo de materiales naturales y manufacturados, que es clave para comprender las propiedades del material que se estudia.

Dado que muchos materiales pueden formar cristales, como sales, metales, minerales, semiconductores, así como diversas moléculas inorgánicas, orgánicas y biológicas, la cristalografía de rayos X ha sido fundamental en el desarrollo de muchos campos científicos. El método determinó el tamaño de los átomos, las longitudes y tipos de enlaces químicos y las diferencias de escala atómica entre varios materiales, especialmente minerales y aleaciones. El método también reveló la estructura y función de muchas moléculas biológicas, incluidas vitaminas, fármacos, proteínas y ácidos nucleicos como el ADN.

Las muestras se analizan comúnmente en forma de cristal. La difracción de rayos X es causada por la interferencia constructiva de ondas de rayos X que se reflejan en los planos cristalinos internos. Se fija una fina película o capa de polvo en la trayectoria de los rayos X monocromáticos. Un detector mide los rayos X de la muestra en una variedad de ángulos. El polvo se compone de pequeños cristales orientados al azar. En ciertos ángulos del sensor, las poblaciones de cristales tienen el ángulo correcto para que se satisfaga la ecuación de Bragg para uno de los planos de cristal, lo que da como resultado un pico en los rayos X.

El gráfico de salida muestra la intensidad de los rayos X sobre 2 theta, el ángulo del detector. Los datos generados con esta técnica requieren un análisis matemático extenso que ahora se facilita con los algoritmos informáticos disponibles. El análisis consiste en indexar, fusionar y poner en fase variaciones en la densidad de electrones. Comienza con la identificación de moléculas utilizando la base de datos del centro internacional de difracción (ICDD). Esta es una organización dedicada a recopilar, editar, publicar y distribuir datos de difracción de polvo para la identificación de materiales cristalinos. El análisis adicional implica el refinamiento de la estructura y la fase cuantitativa utilizando el sistema de análisis de estructura general (GSAS), que en última instancia conduce a la identificación de la fase amorfa o cristalina de una materia y ayuda a construir su modelo atómico tridimensional.

Puntos clave

  • La difracción de rayos X utiliza haces de rayos X dirigidos a golpear la materia cristalizada y genera un patrón de difracción.
  • Los datos recopilados mediante este método se someten a un proceso analítico sistemático que emplea modelos matemáticos y algoritmos informáticos para obtener el modelo atómico final en 3D de una materia.
  • El análisis de difracción de rayos X identifica la composición y los enlaces químicos entre átomos de muestras cristalinas, líquidas, en polvo o amorfas.

Términos clave

  • Ecuación de Bragg: Proporciona los ángulos para una dispersión coherente e incoherente de una red cristalina.
  • cristalografía: La ciencia experimental de determinar la disposición de átomos en sólidos.

Difracción de rayos X: equipos y métodos | Minerales de arcilla | Tierra

En este artículo discutiremos sobre: ​​- 1. Principio de Difracción de Rayos X 2. Equipo de Difracción de Rayos X 3. Análisis 4. Métodos 5. Ventajas.

Principio de difracción de rayos X:

Cuando un haz de rayos X monocromático con longitud de onda A se proyecta sobre un material cristalino en un ángulo, la difracción se refuerza solo a lo largo de direcciones específicas, como se muestra en la figura 3.19 definida por la ley de Bragg [Ec. (3.1)].

Equipo de difracción de rayos X:

El espectrómetro XRD se muestra en la figura 3.20. Los rayos X generados por el tubo de rayos X golpean el cristal de muestra a través de los colimadores en un ángulo,. Los rayos X difractados en un ángulo 2 son registrados por un detector en términos de número de cuentas por segundo, que es proporcional a la intensidad de los rayos X difractados. Un motor hace girar la muestra para variar el ángulo de incidencia de los rayos X de forma continua, y los recuentos por segundo se registran para todos los ángulos de.

El patrón XRD se traza con el ángulo 2 en el eje xy cuenta por segundo en el eje y. El espaciado interatómico (d) se calcula usando la ley de Bragg & # 8217s [Eq. (3.1)] sustituyendo el ángulo 2 correspondiente a los diferentes picos en el patrón XRD. Entonces obtenemos ...

donde n es el orden de reflexión, d es el espaciado entre planos M1norte1y M2norte2, y es el ángulo de incidencia de los rayos X.

Los valores d así obtenidos son las características de diferentes minerales arcillosos. Cada pico puede dar al menos tres d espaciamientos correspondientes al primer (n = 1), segundo (n = 2) y tercer (n = 3) orden de difracción usando la Ec. (3,1).

Análisis de difracción de rayos X :

A continuación se muestra el procedimiento simple que se utiliza en la difracción de rayos X:

2. Determine los espacios d utilizando la ley de Bragg & # 8217s.

3. Obtenga intensidades integradas.

4. Compare los datos con los estándares conocidos en el archivo JCPDS, que son para orientaciones aleatorias. Hay más de 50000 JCPDS (Comité Conjunto de Estándares de Difracción de Polvo que es reemplazado por el Centro Internacional de Datos de Difracción, ICDF) tarjetas de materiales inorgánicos y las siglas JCPDS que tienen patrones de difracción de 50000 inorgánicos y 25000 orgánicos de un solo componente, fases cristalinas.

5. Se analiza un patrón XRD típico para (a) Posición de pico, (b) Intensidad de pico y (c) Ancho de pico. El ancho del pico es el ancho del pico a la mitad de la intensidad máxima. Las áreas debajo del pico están relacionadas con la cantidad de cada fase presente en la muestra.

Métodos de difracción de rayos X :

A continuación se muestran los diversos métodos que se utilizan según el principio de difracción de rayos X:

La rotación de un cristal perfecto en un haz de rayos X es un método para determinar el espectro de rayos X utilizando la ley de Bragg # 8217. Mediante la rotación de un monocristal con un detector fijo o el uso de un detector sensible a la posición con un cristal fijo, podemos realizar experimentos de espectroscopia de rayos X similares a cómo se puede usar una rejilla de difracción en un espectrómetro IR o UV.

Con un haz incidente policromático, muchos planos cumplirán la condición de Bragg y trazar el patrón 2D en una película fotográfica revelará los planos de una zona.

3. Método de cristal giratorio:

Para un haz monocromático y un monocristal, gire el cristal durante el experimento de difracción para alinear los planos de Bragg.

Haz monocromático, muestra policristalina. Por lo general, se hace con una película plana en disposición de orificios.

5. Método del difractómetro:

Similar al método del polvo, pero utiliza un escáner de pasos y un rayo lineal.

Ventajas de difracción de rayos X:

La difracción de rayos X es un método rápido y no destructivo de identificación de minerales. La preparación de la muestra es sencilla. El cálculo del espaciado d es preciso. El método también se puede aplicar in situ para materiales monocristalinos, policristalinos y amorfos. Los estándares están disponibles para miles de sistemas de materiales.


Instrumentación de difracción de rayos X en polvo (XRD): ¿cómo funciona?

La geometría de un difractómetro de rayos X es tal que la muestra gira en el camino del haz de rayos X colimado en un ángulo & # 952 mientras que el detector de rayos X está montado en un brazo para recolectar los rayos X difractados y gira en un ángulo de 2 & # 952. El instrumento utilizado para mantener el ángulo y rotar la muestra se denomina goniómetro. Para patrones de polvo típicos, los datos se recopilan en 2 y # 952 de

5 & ​​# 176 a 70 & # 176, ángulos preestablecidos en el escaneo de rayos X.


Análisis de difracción de rayos X de celulosa mejorado mediante el modelado de la serie de Fourier

Este artículo aborda dos cuestiones fundamentales en el método de deconvolución de picos del análisis de datos de XRD de celulosa: no existe un modelo estándar para la celulosa amorfa y las funciones de pico comunes como las funciones de Gauss, Lorentz y Voigt no se ajustan bien al perfil amorfo. Primero examina los efectos de la molienda de bolas en tres tipos de celulosa y los resultados muestran que la molienda de bolas transforma todas las muestras en una fase altamente amorfa que exhibe perfiles de difracción de rayos X de polvo (XRD) casi idénticos. Se plantea la hipótesis de que el orden de corto alcance dentro de una unidad de glucosa y entre unidades adyacentes sobrevive al molido de bolas y genera los perfiles XRD amorfos característicos. Esto concuerda bien con las medidas de espaciamiento de I d de celulosa y el análisis XRD de oligosacáridos. El perfil XRD amorfo se modela usando una ecuación en serie de Fourier donde los coeficientes se determinan usando el método de mínimos cuadrados no lineales. A continuación, se propone un nuevo método de deconvolución de picos para analizar los datos de XRD de celulosa con la función del modelo amorfo de Fourier junto con las funciones estándar de Voigt que representan los picos cristalinos. También se ha evaluado el impacto del método de sustracción de fondo. A continuación, se realizó el análisis de varias muestras de celulosa y se comparó con los métodos convencionales de deconvolución de picos con funciones comunes de ajuste de picos y método de sustracción de fondo. Los resultados sugieren que los métodos anteriores de deconvolución de picos sobrestiman la cristalinidad de la celulosa.

Resumen gráfico

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La biología estructural incorpora técnicas y principios de biología molecular, bioquímica y biofísica como un medio para dilucidar la estructura molecular y la dinámica de moléculas biológicamente relevantes. Los avances recientes en la instrumentación han respaldado un nuevo impulso en la biología estructural, ya que ahora se pueden analizar moléculas biológicas complejas con una facilidad y eficiencia sin precedentes. La estructura tridimensional de las proteínas y los complejos proteicos proporcionan una gran comprensión de las leyes de las actividades de la vida y el mecanismo de las enfermedades, lo que permite el diseño racional de nuevos agentes terapéuticos y de diagnóstico. Existen tres técnicas principales de investigación para la biología estructural: difracción de rayos X de cristal único (SC-XRD), resonancia magnética nuclear (RMN) y microscopía crioelectrónica (Cryo-EM). Sin embargo, no existe un método “para todo uso” ya que los tres ofrecen ventajas y limitaciones únicas.

Figura 1. Tres técnicas principales de investigación para la biología estructural. Según las estadísticas de PDB (https://www.rcsb.org/), más de 120.000 estructuras de proteínas resueltas por SC-XRD, representan casi el 90% del total. Y hay alrededor de 12.000 estructuras de proteínas obtenidas por RMN. Aunque el número total de estructuras proteicas resueltas por Cryo-EM no es comparable al de las dos primeras técnicas, el crecimiento explosivo de estructuras de esta técnica es notable en los últimos años.

La cristalografía de rayos X utiliza rayos X para determinar la posición y disposición de los átomos en un cristal. El método más clásico de cristalografía de rayos X es la difracción de rayos X de cristal único, en la que los átomos de cristal hacen que el haz de rayos X incidente produzca haces dispersos. Cuando los rayos dispersos aterrizan en el detector, estos rayos producen un patrón de difracción de puntos. A medida que el cristal gira gradualmente, se puede medir el ángulo y la intensidad de estos haces difractados y luego se genera una imagen tridimensional de la densidad de electrones dentro del cristal. Con base en esta densidad de electrones, se puede determinar la posición promedio de los átomos en el cristal, los enlaces químicos, las barreras de cristal y diversa información. Para un monocristal con suficiente pureza, homogeneidad y regularidad, los datos de difracción de rayos X pueden determinar el ángulo y la longitud de enlace químico promedio dentro de unas pocas décimas de grado y unas pocas milésimas de angstrom, respectivamente.

Figura 2. Los principios físicos y matemáticos de la cristalografía de rayos X para resolver una estructura.

La técnica de difracción de rayos X monocristalino fue propuesta y desarrollada en 1912, y se ha convertido en la herramienta más importante y útil para determinar la estructura de la proteína, ya que la estructura de la proteína de la mioglobina se determinó por primera vez en 1958. Hoy en día, más de 140.000 estructuras de proteínas se han determinado. se han depositado en el banco de datos de proteínas (https://www.rcsb.org/), casi el 90% de las cuales se resuelven mediante la técnica de difracción de rayos X de monocristal, lo que sugiere sus ventajas en el estudio de la estructura de los cristales de macromoléculas biológicas.

El proceso de la técnica de difracción de rayos X monocristalino se puede dividir aproximadamente en cuatro pasos. El primer paso es obtener monocristales de alta calidad de la proteína objetivo, lo que se denomina cristalización de proteínas. Cuando la solución de la proteína solubilizada alcanza la sobresaturación, promueve la agregación y nucleación de proteínas. En última instancia, las moléculas de proteínas individuales se organizan en una serie repetida de células unitarias adoptando una orientación uniforme. Los cristales calificados deben tener un tamaño suficiente (normalmente mayor de 50 μm en todas las dimensiones) y calidad (estructura regular, sin grietas ni gemelos). La obtención de monocristales de alta calidad es el paso límite para resolver una estructura con este método.

Después de obtener un monocristal, se requiere un experimento de difracción. El cristal se inmoviliza en un haz de rayos X intenso, produciendo un patrón de difracción, que se registra como los datos de difracción (ángulo e intensidad de los rayos X difractados). A medida que el cristal gira gradualmente, los reflejos anteriores desaparecen y surgen nuevos reflejos. La intensidad de difracción en cada punto se registra desde cada dirección del cristal.

Posteriormente, los datos de difracción obtenidos del patrón de difracción se combinan con varios métodos de análisis estructural y ajuste de datos para analizar la distribución de densidad de electrones en el espacio tridimensional dentro de la celda unitaria.

En el último paso, basado en el mapa de densidad de electrones, se puede producir y refinar un modelo de disposición atómica en el cristal.

Fig. 3. El proceso de la técnica de difracción de rayos X monocristalino.

Este método puede producir una alta resolución atómica y no está limitado por el peso molecular de la muestra. Es adecuado para proteínas solubles en agua, proteínas de membrana y complejos macromoleculares. Cuando se manipula correctamente, se convierte en una herramienta poderosa para entregar datos estructurales confiables de macromoléculas biológicas y determinar la posición y estructura del centro activo, y ayuda a comprender cómo la proteína reconoce y se une a moléculas de ligando a nivel atómico.

Sin embargo, el método de difracción de rayos X monocristalino también tiene varias desventajas. Primero, la muestra debe ser cristalizable, pero la cristalización de macromoléculas biológicas con gran peso molecular puede ser difícil, particularmente, las proteínas de membrana son más difíciles de cristalizar debido a su gran tamaño y mala solubilización. En segundo lugar, debe obtenerse un monocristal organizado para permitir una difracción adecuada. Finalmente, la estructura tridimensional obtenida de la muestra biológica solo representa una forma estática de la molécula probada (una de las muchas posibilidades), en lugar de una dinámica.

El segundo método es la resonancia magnética nuclear (RMN). Los núcleos son partículas cargadas que giran rápidamente y son similares a los electrones externos. Las proporciones giromagnéticas de diferentes núcleos atómicos son diferentes y, por lo tanto, tienen diferentes frecuencias de resonancia. El movimiento del núcleo no está aislado, interactúa con los átomos circundantes tanto intra como intermolecularmente. Por tanto, a través de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear, se puede obtener información estructural de una determinada molécula. Tomando la proteína como ejemplo, su estructura secundaria, como hélice α, lámina β, giro, circular y rizo, refleja la disposición diferente de los átomos de la cadena principal de las moléculas de proteína en tres dimensiones. El espaciamiento de los núcleos atómicos en diferentes dominios secundarios, la interacción entre los núcleos y las características dinámicas de los segmentos polipeptídicos reflejan directamente la estructura tridimensional de las proteínas. Todas estas características nucleares contribuyen a los comportamientos espectroscópicos de la muestra analizada, proporcionando así señales de RMN características. La interpretación de estas señales por métodos asistidos por computadora conduce al desciframiento de la estructura tridimensional.

Figura 4. Giro nuclear

Desde la primera observación de señales de RMN de estado condensado en 1946, la tecnología de RMN ha experimentado un rápido desarrollo durante más de 70 años, y su aplicación se ha extendido desde el área de la física, como la determinación del momento magnético nuclear, a la química, la medicina, la ciencia de los materiales, ciencias de la vida y muchas otras. Cabe destacar que en la década de 1980, la tecnología de RMN se aplicó en el análisis estructural de proteínas de forma creativa, promoviendo así la aplicación de RMN en el campo biológico. Aunque la cantidad de datos de estructura tridimensional de proteínas obtenidas mediante la tecnología de RMN no es comparable a la de la difracción de rayos X de cristal único, las ventajas únicas de la tecnología de RMN se han notado ampliamente: la RMN es capaz de proporcionar información sobre una base cinética, de manera que el movimiento interno de las proteínas en múltiples escalas de tiempo y su mecanismo de unión a los ligandos se pueda resolver.

Hay cuatro pasos principales en un experimento de RMN: preparación de muestras, adquisición de datos, procesamiento espectral y análisis estructural. El análisis de RMN se realiza en muestras acuosas de proteína con alta pureza, alta estabilidad y alta concentración. Un volumen de muestra que varía de 300 a 600 μL con un rango de concentración de 0,1-3 mM. El uso de isótopos estables 15N, 13C y 2H para el etiquetado de proteínas puede aumentar eficazmente la intensidad y la resolución de la señal. El marcaje selectivo de ciertos aminoácidos o grupos químicos de proteínas puede reducir en gran medida la superposición de señales. Se utilizan experimentos de RMN multidimensionales para adquirir información sobre la proteína. A continuación, se realiza el procesamiento espectral para determinar los átomos de la proteína correspondientes a cada pico espectral en diferentes espectros de RMN. Finalmente, se utiliza una serie de información estructurada espacialmente, como las constantes de acoplamiento NOE y J, para calcular la estructura espacial utilizando métodos de dinámica geométrica o molecular de distancia.

Figura 5. El proceso de la tecnología de resonancia magnética nuclear.

La característica más importante del método de RMN es que la estructura tridimensional de las macromoléculas en el estado natural se puede medir directamente en solución, y la RMN puede proporcionar información única sobre la dinámica y las interacciones intermoleculares. La resolución de la estructura tridimensional macromolecular puede ser tan baja como sub nanométrica.

Sin embargo, el espectro de RMN de biomoléculas con gran peso molecular es muy complicado y difícil de interpretar, lo que limita la aplicación de RMN en el análisis de grandes biomoléculas. Además, esta técnica requiere cantidades relativamente grandes de muestras puras (del orden de varios mg) para lograr un nivel razonable de señal a ruido.

El tercer enfoque es la técnica de microscopía crioelectrónica (Cryo-EM), que incluye tres métodos diferentes: análisis de partículas individuales, tomografía electrónica y cristalografía electrónica. El mecanismo esencial de Cryo-EM es la dispersión de electrones. El principio básico se describe a continuación. Las muestras se preparan mediante crioconservación antes del análisis. Los electrones coherentes se utilizan como fuente de luz para medir la muestra. Una vez que el haz de electrones atraviesa la muestra y la capa de hielo cercana, el sistema de lentes convierte la señal dispersa en una imagen ampliada registrada en el detector. Y el procesamiento de la señal se realiza para obtener la estructura tridimensional de la muestra.

La tecnología de reconstrucción tridimensional de microscopía electrónica se descubrió por primera vez en 1968. La estructura tridimensional de la cola del fago T4 se reconstruyó mediante micrografías electrónicas. Y luego se propusieron el concepto general y los métodos de reconstrucción tridimensional de la microscopía electrónica. Para reducir el daño por radiación, se creó la microscopía electrónica criogénica en 1974. Después de más de 30 años de desarrollo, Cryo-EM se ha convertido en una poderosa herramienta para estudiar la estructura de macromoléculas biológicas. En los últimos años, la tecnología Cryo-EM ha logrado un progreso revolucionario, particularmente en el análisis de partículas individuales. Desde 2013, con los tremendos avances en el detector de electrones y el procesamiento de imágenes, el análisis de partículas individuales Cryo-EM ha progresado tan rápidamente que la resolución de Cryo-EM ahora es comparable a la difracción de rayos X de cristal único. En la actualidad, Cryo-EM se está convirtiendo en una poderosa herramienta para determinar la estructura de alta resolución de macromoléculas biológicas.

Antes de usar el Cryo-EM para observar la muestra, se puede utilizar el EM de tinción negativa para la detección rápida de muestras homogéneas. La técnica de análisis de partículas individuales Cryo-EM comienza con la vitrificación de la muestra. Durante este proceso, la solución de proteína se enfría instantáneamente, de modo que las moléculas de agua no cristalizan, formando un sólido amorfo. A continuación, se analiza la muestra congelada y se recopilan los datos en el sistema. Se puede tomar una serie de imágenes bidimensionales durante este período. A continuación, basándose en una gran cantidad de imágenes bidimensionales adquiridas, se llevan a cabo la alineación y clasificación de partículas. Al final, los datos son procesados ​​por un software de reconstrucción para generar un modelo estructural tridimensional.

Figura 6. El proceso de la técnica de análisis de partículas individuales Cryo-EM

En comparación con la difracción de rayos X de cristal único, el tratamiento de congelación rápida de la muestra mantiene su estado más cercano al nativo. Además, este método requiere solo una pequeña cantidad de muestra (aproximadamente 0,1 mg), se perdona más en la pureza de la muestra y no necesita la proteína para cristalizar.

El principal defecto de esta técnica es que las partículas se detectan en orientaciones desconocidas. Los altos niveles de ruido, debido al uso de dosis limitadas de electrones para minimizar el daño por radiación, especialmente a alta resolución, tienden a complicar la determinación de estas orientaciones, y esto es particularmente una preocupación para partículas más pequeñas. Por lo tanto, la determinación de la estructura de macromoléculas biológicas por Cryo-EM se limitó a grandes complejos o modelos de baja resolución durante los últimos años.

Figura 7. Microscopía crioelectrónica

En resumen, cada tecnología tiene sus propias ventajas en determinadas aplicaciones, de modo que un método puede utilizarse ampliamente en algunos casos, pero raramente en otros. Por lo tanto, comprender la naturaleza del análisis es la clave en la selección del método. La selección inadecuada del método no solo producirá resultados comprometidos, sino que también puede causar retrasos significativos en el proyecto y provocar pérdidas financieras. Para obtener más información, consulte la Tabla 1.


Análisis de cristalización y difracción de rayos X de SpaE, una proteína pilus basal del Lactobacillus rhamnosus GG adaptado al intestino

SpaE es la subunidad basal de pilina predicha en el pilus SpaFED dependiente de sortasa del Lactobacillus rhamnosus GG adaptado al intestino y comensal. Hasta ahora, la caracterización estructural de las pilinas basales de anclaje a la pared celular ha seguido siendo difícil y se ha limitado a unos pocos ejemplos de géneros y especies patógenos. Para obtener una mayor comprensión estructural de los mecanismos moleculares que están involucrados en el anclaje y ensamblaje de pili dependientes de sortasa en bacterias menos dañinas, L. rhamnosus GG SpaE para cristalización se produjo mediante expresión recombinante en Escherichia coli. Aunque varios intentos de cristalizar la proteína SpaE no tuvieron éxito, finalmente se produjeron cristales trigonales que se difractaban a una resolución de 3,1 Å utilizando PEG 3350 como precipitante y altas concentraciones de proteína. Una mayor optimización con una combinación de aditivos condujo a la generación de cristales de SpaE en forma ortorrómbica que difractaban a una resolución más alta de 1,5 Å. Para acelerar la determinación de la estructura por fase SAD, se cultivaron cristales SpaE sustituidos con selenio (ortorrómbicos) y se recogieron datos de difracción de rayos X con una resolución de 1,8 Å.

Palabras clave: Lactobacillus rhamnosus GG SpaE adhesión basal pilina interacción huésped-microbio probióticos pili dependientes de sortasa.

Cifras

Representaciones esquemáticas del gen ...

Representaciones esquemáticas de la organización genética del L. rhamnosus GG spaFED operón ...

Purificación y análisis SDS – PAGE de…

Purificación y análisis SDS-PAGE de SpaE. ( a ) La purificación en dos pasos de ...

El espectro de dicroísmo circular ultravioleta lejano de ...

El espectro de dicroísmo circular de UV lejano de SpaE.

SpaE cristalizado por la difusión de vapor ...

SpaE cristalizado por el método de difusión de vapor. ( a ) Cristales trigonales cultivados en ...

Patrones de difracción de rayos X de SpaE ...

Patrones de difracción de rayos X de cristales SpaE. ( a ) Patrón de difracción recopilado de…


Visión general

Empyrean es la única plataforma que lo hace todo, brindando la mejor calidad de datos en cada tipo de muestra. Cubre el mayor conjunto de aplicaciones de imágenes, dispersión y difracción de rayos X en un solo instrumento. Además, Empyrean no solo cumple con las altas expectativas de los científicos y expertos en XRD en la actualidad, sino que continuará haciéndolo a medida que evolucionen los temas de investigación Empyrean es ideal para fines didácticos, gracias a las grandes puertas que se abren por completo, permitiendo el acceso al sistema a varias personas. pero al mismo tiempo es perfecto para realizar mediciones en entornos exigentes de I + D + i en varias industrias.


Biología estructural usando electrones y rayos X

Biología estructural usando electrones y rayos X analiza los métodos de difracción y basados ​​en imágenes utilizados para la determinación de macromoléculas biológicas complejas. El libro se centra en la teoría de la transformada de Fourier, que es una función matemática que se calcula para transformar señales entre el tiempo y el dominio de la frecuencia. Compuesto por cinco partes, el libro examina el desarrollo de la resonancia magnética nuclear (RMN), que permite el cálculo de las imágenes de una determinada proteína. Las partes 1 a 4 proporcionan la información básica y las aplicaciones de las transformadas de Fourier, así como los diferentes métodos utilizados para el procesamiento de imágenes mediante cristalografía de rayos X y el análisis de micrografías electrónicas. La parte 5 se centra completamente en el aspecto matemático de las transformadas de Fourier. Además, el libro examina análisis estructurales detallados de la simetría de una muestra (es decir, cristales, hélices, virus poliédricos y partículas asimétricas).

Este libro está dirigido al biólogo o bioquímico que esté interesado en diferentes métodos y técnicas para calcular las imágenes de proteínas mediante resonancia magnética nuclear (RMN). También es adecuado para lectores sin experiencia en química física o matemáticas.

Biología estructural usando electrones y rayos X analiza los métodos de difracción y basados ​​en imágenes utilizados para la determinación de macromoléculas biológicas complejas. El libro se centra en la teoría de la transformada de Fourier, que es una función matemática que se calcula para transformar señales entre el tiempo y el dominio de la frecuencia. Compuesto por cinco partes, el libro examina el desarrollo de la resonancia magnética nuclear (RMN), que permite el cálculo de las imágenes de una determinada proteína. Las partes 1 a 4 proporcionan la información básica y las aplicaciones de las transformadas de Fourier, así como los diferentes métodos utilizados para el procesamiento de imágenes mediante cristalografía de rayos X y el análisis de micrografías electrónicas. La parte 5 se centra completamente en el aspecto matemático de las transformadas de Fourier. Además, el libro examina análisis estructurales detallados de la simetría de una muestra (es decir, cristales, hélices, virus poliédricos y partículas asimétricas).

Este libro está dirigido al biólogo o bioquímico que esté interesado en diferentes métodos y técnicas para calcular las imágenes de proteínas mediante resonancia magnética nuclear (RMN). También es adecuado para lectores sin experiencia en química física o matemáticas.


3.3H: Análisis de difracción de rayos X - Biología

Este documento proporciona una introducción a los conceptos básicos de la difracción de rayos X (XRD), dirigido principalmente a científicos e ingenieros que no son expertos en el campo pero que están interesados ​​en utilizar XRD como herramienta. Después de describir lo que se puede aprender de XRD, y cómo se construyen los instrumentos típicos de XRD, profundizamos en la descripción del análisis de datos de detectores de rayos X & quotarea & quot o & quot; bidimensionales & quot.

Los expertos en el campo pueden identificar excepciones a algunas declaraciones que se hacen en este documento, pero se ha hecho un esfuerzo para lograr el equilibrio adecuado entre simplicidad y precisión.

Para una presentación más detallada de los mismos temas, Paul Heiney ha producido una serie de videos tutoriales sobre técnicas de dispersión de rayos X.

La difracción de rayos X (XRD) es una técnica no destructiva para analizar la estructura de materiales, principalmente a nivel atómico o molecular. Funciona mejor para materiales que son cristalinos o parcialmente cristalinos (es decir, que tienen un orden estructural periódico) pero también se usa para estudiar materiales no cristalinos.

XRD se basa en el hecho de que los rayos X son una forma de luz, con longitudes de onda del orden de los nanómetros. Cuando los rayos X se dispersan desde una sustancia con una estructura a esa escala de longitud, pueden producirse interferencias, lo que da como resultado un patrón de intensidades más altas y más bajas. Esto es cualitativamente similar a los patrones de colores producidos por las pompas de jabón, en las que se ven diferentes colores en diferentes direcciones.

La XRD es bastante diferente de la radiografía de rayos X o la tomografía. La tomografía se basa en el hecho de que los rayos X son absorbidos con más fuerza por algunos materiales que por otros; por ejemplo, los huesos o los tumores absorben más que el músculo o la grasa. Por lo tanto, la imagen transmitida proporciona una imagen directa de la estructura dentro del cuerpo u objeto (generalmente una escala de longitud de un milímetro o más), lo que la convierte en una herramienta invaluable para los médicos. (La tomografía de rayos X también se usa ampliamente en otros campos, como la ciencia de los materiales y la metalurgia). Por el contrario, la XRD produce un patrón de difracción, que no se parece superficialmente a la estructura subyacente, y proporciona información sobre la estructura interna en escalas de longitud de 0,1 a 100 nm.

En su forma más simplificada, a continuación se muestra una medición genérica de dispersión de rayos X.
Un haz de rayos X se dirige hacia una muestra y la intensidad de dispersión se mide en función de la dirección de salida. Por convención, el ángulo entre las direcciones del haz entrante y saliente se llama 2 & theta. Para la muestra más simple posible, que consta de hojas de carga separadas por una distancia D, se observa interferencia constructiva (mayor intensidad dispersa) cuando Ley de Bragg Está satisfecho: norte & lambda = 2 D pecado y theta aquí norte es un número entero (1, 2, 3,.), & lambda es la longitud de onda del haz de rayos X, y & theta es la mitad del ángulo de dispersión 2 & theta que se muestra arriba.

Los materiales reales son más complicados, por supuesto, pero el resultado general sostiene que existe una relación entre las distancias entre partículas dentro de la muestra y los ángulos en los que la intensidad de dispersión es la más alta, con distancias más grandes. D correspondiente a menor ángulos de dispersión 2 y theta.

Las mediciones de monocristales generalmente brindan más información que otras técnicas de XRD, pero también son las más difíciles. El cultivo de monocristales de alta calidad es, en el mejor de los casos, difícil y, a menudo, imposible, y se deben realizar muchas mediciones en diferentes orientaciones de la muestra para obtener la información necesaria para una determinación cristalográfica completa.

A la derecha se muestra un patrón de difracción de polvo de behenato de plata (un cristal orgánico en capas). con una gráfica de línea correspondiente.

  1. Como alternativa a la difracción monocristalina. It is much easier to produce a powder sample than a single crystal. Although valuable information is lost during the "powder averaging" process that turns sharp spots into rings, crystal structures can still be solved with this technique as long as they are relatively small and there is not excessive overlap between the peaks. The method of Rietveld refinement is often used to determine the crystal structure that is most likely to have given rise to the observed pattern. As with single crystal diffraction, the shapes and widths of individual peaks can sometimes be analyzed to determine details of crystallite sizes, as well as microscopic strains and defects.
  2. For phase identification, most often used in mineralogy. Often a mineral or clay sample will consist of a mixture of different crystal phases. The "fingerprint" of a powder diffraction pattern can then be compared to a data base of known patterns to determine which phase or phases are present.

A famous example of this technique was the 1953 determination of the structure of DNA. In that case, growing true single crystals proved to be challenging (and analyzing the data from single crystals was also an unsolved problem at the time), but the additional orientation of the diffraction pattern due to the fiber geometry was enough to deduce the helical form of the DNA molecule.

Fiber diffraction is often used when studying long-chain molecules such as DNA, or columnar structures such as discotic liquid crystals.

In a typical GID measurement, &alphaI is held fixed and the intensity is measured as a function of 2&theta. The resultant intensity profile can be analyzed to establish the two-dimensional crystal structure within the plane of the film.

Historically, this technique was primarily used to study relatively large "objects" dispersed in a medium, such proteins dissolved in an aqueous medium, colloidal particles, micelles, or voids in porous media.

  • Production of X-rays : There are a variety of methods for producing a beam of x-rays.
    • X-ray Tube. This is the simplest and oldest approach, and is still occasionally used. A beam of electrons strikes a metallic target and X-rays are emitted. The intensity of the X-ray beam is limited by the heat released into the target by the electron beam.
    • Rotating anode X-ray Generator. This variant of the traditional X-ray tube, which became widely available in the 1970's, addresses the heat loading problem by replacing the fixed target with a rotating cylinder, water-cooled on the inside. Considerably more X-ray intensity is thereby made possible, but there are both literal and figurative costs: the engineering requirements are considerably more stringent, and rotating-anode generators are subject to breakdowns and require frequent maintenance.
    • Microfocus Tube. The most recent solution to the heat loading problem takes a different tack: the electron beam is focused down to a tiny spot (typically 50 &mum or less in diameter), so that the total heat load on the anode is quite small. Microsource tubes started to become available around 2000, and are gradually replacing rotating anode generators.
    • Synchrotron. A synchrotron X-ray source uses a totally different mechanism from the tube sources described above: the radiation emitted from a relativistic beam of electrons (or positrons) accelerated by a magnetic field. The resulting beam is generally many orders of magnitude more intense than that produced by the tabletop sources described above. However, such a beam can be produced only at a large centralized facility, obliging most users to travel substantial distances and plan their usage well in advance. For this reason, tube/rotating anode/microfocus sources, which can be operated at the user's home institution, are best suited for relatively routine measurements, while synchrotron sources are required for experiments requiring extremely high intensity or other specialized conditions. Major synchrotron sources include the Advanced Photon Source and the National Synchrotron Light Source in the US, the European Synchrotron Radiation Facility in France, the Diamond Light Source in Britain, and the Photon Factory in Japan, among others.
    • Slits or pinholes. These form a part of almost every instrument, and act by geometrically restricting the beam. To be effective, they must be constructed from a heavy element such as tungsten. Care must be taken to minimize diffuse ("parasitic") scattering from the edges of the slits which can contribute to the background signal.
    • Crystal monochromator. The most common method for producing a "monochromatic" beam (containing only a narrow spread of wavelengths &lambda) is to insert a high quality single crystal of a material such as silicon or germanium into the beam and separate out only those components of the beam that satisfy Bragg's Law. Conversely, for a beam that is already largely monochromatic, this Bragg reflection from a crystal can be used as a means of collimation. The degree of collimation and spectral selection depend on the perfection of the crystal and also the characteristics of the incoming beam.
    • X-ray Mirror. X-ray mirrors rely on the same effect referred to in our discussion of X-ray reflectivity, namely that a beam which strikes a flat surface at a very low angle can be strongly reflected. X-ray mirrors are typically made of a metal such as gold and are gently curved so as to produce a beam that is focused along a vertical and/or horizontal axis. They also affect the spectral characteristics since shorter wavelengths are reflected much less effectively than long wavelengths.
    • Multilayer Optics. This approach, which is incorporated in many units currently on the market (especially those optimized for small-angle scattering) combines the benefits of a crystal monochromator and an X-ray mirror. A multilayer coating on a curved substrate results in a monochromatic, collimated beam, most often either parallel or slightly convergent focus. The optical unit must be closely coupled with the source, but when done properly this can result in a beam that is simultaneously more intense and better collimated than achievable with previous technologies.
    • Película: For most of the 20th century photographic plates or films, generally coupled with some kind of X-ray fluorescent screen, were the dominant method for measuring diffraction patterns. A collimated beam struck the sample, and then the plate was placed behind the sample. This method was easy to deploy, but it was difficult to convert the images to quantitative plots. Photographic plates are still often used in medical X-ray radiography.
    • Scintillation Detector. Starting around the 1970's, film was largely replaced by solid state detectors, especially scintillation detectors that produced an electronic readout of the scattered intensity that could be directly read by a computer. Because scintillation detectors generally measure the scattered intensity at only one angle at a time, some type of collimation is necessary between the sample and the detector, often similar to that found between the source and the detector. Systems employing "point detector" are thus intrinsically somewhat slow, because only one angle is measured at a time, but are usually an improvement over photographic film due to their high sensitivity and easy readout in digital form.
    • 2D Detector. Two-dimensional, or "area" detectors came into increasing use around 1990. A number of different technologies are available, but all of them function essentially as "electronic film": like photographic film, they record the intensity across an entire surface, but the resultant image is directly transmitted to the data-taking computer as an array of intensities. In most cases, the intensity report for each pixel is an integer quantity, and is equal or at least proportional to the number of X-ray photons that struck that pixel in a certain amount of time.
      Area detectors combine many of the advantages of scintillation detectors and film. They are highly sensitive, and can be read out rapidly, but measure the diffraction at many angles simultaneously. The volume of data produced is thus greatly increased a single data frame from an area detector generally occupies at least 1Mb of disk space, and often 10 Mb or more.

    The first step in a diffraction experiment using an area detector is to position the sample in the X-ray beam such that diffracted rays strike the detector and then to expose the sample for a fixed amount of time. The resulting area of intensities (usually photon counts) for each pixel on the detector is then read by the computer, and displayed as a false-color image.

    For quantitative analysis, the (x,y) pixel coordinates must be converted to more useful units. The sketch to the right shows a common way of labeling the angles. A portion of the incident beam generally passes through the sample undeflected--this is called the "primary beam". It is usually necessary to have some kind of beamstop to block this beam from directly striking the detector, but the position where it haría hit is well defined. Then, relative to the beam center position, other diffracted rays will be deflected by a scattering angle 2&theta at an azimuthal angle &chi as shown to the right.

    Instead of the scattering angle 2&theta, the amount by which the scattered beam has been deflected is often described by the momentum transfer Q:
    Q = (4 &pi / &lambda ) sin &theta

    • Single Crystal: For single crystal measurements, the pattern on the detector will consist of a large number of sharp spots. The analysis software must determine the position (2&theta, &chi) of each spot and the total (integrated) intensity within that spot. This measurement is then repeated for many different sample orientations. Detailed analysis (beyond the scope of this article) can then invert this information to determine the atomic positions within the sample.
    • Powder diffraction For powder diffraction the pattern on the detector will consist of a set of concentric sharp rings. In this case the intensity is independent of &chi. For further analysis, the 2D image is reduced to an x-y plot consisting of the intensity per pixel as a function of 2&theta, or Q averaged over all values of &chi. Producing a plot of this sort (with the option for export to other applications) is one of the central capabilities of Datasqueeze. The next task is to produce a list of scattering angles and intensities for each peak (overlapping peaks can be a problem). A commonly used approach is to perform a least-squares fit to the pattern, modeling each peak as a Gaussian or similar function together with a smooth background.
    • Solution SAXS For small angle scattering from particles embedded in a liquid or solid matrix, the scattered intensity is again independent of &chi, and again the 2D image is reduced to an x-y plot consisting of the intensity per pixel as a function of 2&theta, or Q averaged over all values of &chi. In this case a smooth pattern without sharp peaks is generally observed, but least-squares fits can be used to compare the observed pattern to the functional forms predicted for the size and shape of the individual particles. For example, the intensity predicted for scattering from uniform solid spheres of radius R is the square of the "Rayleigh Function":
      I = (const) | P(Q) | 2
      P(Q) = ( sin ( q R) - Q R cos(Q R) ) / (Q R ) 3
      Datasqueeze incorporates a wide selection of functions used for fitting SAXS data.

    The image to the top right shows the typical geometry for an area detector-based apparatus. We need to accurately map the (x,y) coordinates of a detector pixel to (2&theta,&chi).

    The first parameter that must be established is the exact position on the detector where the primary beam hits (or, would hit if it were not blocked by the beamstop). You might think that visual examination of that region of the measured image would be good enough--for example, one could choose a pixel in the middle of the shadow provided by the beamstop. However, it turns out that this is not good enough for accurate measurements one needs to know the beam center position to within a fraction of one pixel size.

    To interpret a radial distance from the beam center to a particular pixel, we also need a scale factor: the relationship between the width of one pixel and the scattering angle 2&theta. We can get a good approximate idea of this factor if we know the distance between the sample and the detector and the dimensions of each pixel (or, equivalently, the sample:detector position and the dimensions of the entire detector).

    Another issue to consider is the issue that the detector face may not be exactly perpendicular to the primary beam, but be rotated away by some small angle &beta as shown on the figure to the top right. This will have the effect of converting circular Bragg rings into ellipses on the detector.

    One of the best solutions to the accurate determination of these parameters, which is employed by the Datasqueeze calibration wizard, is to use the Bragg rings of a known calibration standard. By using the fact that these rings debe be centered on the primary beam position, debe be circular, and debe appear at known values of 2&theta, it is possible to establish all of the calibration parameters to high accuracy.


    Hendrickson

    Our laboratory studies macromolecular structure with an aim toward in-depth understanding of biological activity. Diffraction analysis is our primary research tool, but we also employ theory and other physical and biochemical methods of analysis. The program emphasizes three broad themes: structural biology of specific systems, methodology development, and biophysical principles of conformation, dynamics and assembly.

    Most of the macromolecules that we have under study relate to one or more of a few main biological subjects: cell surface interactions and signal transduction, immune response interactions, cellular responses to stress, genetic replication and transcription, carbohydrate recognition, and oxygen transport. Others have been chosen as subject for methodology development or for the analysis of general structural principles. Specific crystalline molecules that we are presently studying include the CD4 T-cell co-receptors, T-cell receptors, MHC molecules, superantigens, stem cell factor, fibroblast growth factor, insulin receptor, lymphocyte kinase, HIV envelope glycoprotein, FHIT, myelin Po, N- cadherin, ribonuclease H, carbamyl phosphate synthetase, UmuD, DnaK, streptavidin, and hemocyanin.

    The emphasis in methodology development is on crystallographic phase determination, structure refinement, computational methods, and synchrotron radiation research. Our research in phase determination centers on anomalous scattering -- particularly, on methods for exploiting multiwavelength measurements of anomalous diffraction. Our effort to enhance procedures for stereochemically restrained refinement focuses on an improved treatment of the dynamic characteristics of molecules. A Crystallographic Workbench is being developed for integrated computing. And, with Howard Hughes support, we are developing synchrotron beamlines for macromolecular diffraction studies.

    Throughout our work we seek to gain insight into general principles as well as an understanding of specific processes. This is facilitated by methods that allow us to gain structural information in the greatest possible detail and accuracy. General properties that we are addressing include protein dynamics, conformational heterogeneity, metal binding in proteins, determinants of binding strength and specificity, assembly of protein interfaces, molecular symmetry, and bound water structure.