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¿Por qué se usa un gen para una proteína fluorescente en lugar de uno para una enzima que produce una molécula fluorescente?

¿Por qué se usa un gen para una proteína fluorescente en lugar de uno para una enzima que produce una molécula fluorescente?


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La proteína verde fluorescente (GFP) es una pequeña proteína que emite fluorescencia verde brillante en luz azul. Primero se aisló de las medusas.

El gen que codifica la GFP se puede expresar en bacterias, por lo que a menudo se usa como marcador para mostrar la captación exitosa de un gen por la bacteria.

Cuál es el ventaja de usar el gen de GFP para producir fluorescencia fácilmente detectable, en lugar de usar un gen para una enzima que produce una sustancia fluorescente?

PD. La pregunta original que recibí fue explicar sobre el desventaja, que es que GFP puede no tener una fluorescencia muy brillante y, por lo tanto, puede ser difícil de detectar.

Gracias por tu ayuda.


GFP tiene muchas ventajas:

  • La detección de la fluorescencia funciona directamente y no necesita un paso de lisis o la absorción de un reactivo.
  • La fluorescencia se puede detectar directamente usando un microscopio de fluorescencia o confokal con las células. Esto se puede hacer mientras se cultivan en placas (funciona para bacterias y cultivos de células eucariotas).
  • Puede clasificar las células etiquetadas con un citómetro de flujo.
  • Es posible el marcado directo de proteínas y su posterior localización en la célula.
  • La GFP es bastante estable en las células y no es tóxica.

No conozco genes que codifiquen proteínas, más específicamente enzimas, que catalizarán la producción de un compuesto fluorescente a partir de intermedios presentes en la célula promedio. Es de suponer que uno necesitaría un camino completo.

Entonces sospecho que la pregunta nunca ha surgido realmente.


IIRC, pseudomonas fluorescens produce una molécula de andamio de carbono alrededor de los iones de hierro que produce una pequeña molécula fluorescente. Pero eso probablemente requeriría la expresión de múltiples enzimas.


Fundamentos científicos de la biotecnología

Abstracto

La microscopía de fluorescencia en sus diversas formas se ha convertido en la metodología dominante en la obtención de imágenes biológicas. Este dominio se debe, en gran parte, a su sensibilidad a una sola molécula y su exquisita selectividad mediante el uso de marcadores químicos, de anticuerpos o genéticos dirigidos a moléculas de interés. Los límites de resolución limitada por difracción de 200 nm axialmente y 500 nm lateralmente se establecieron en la década de 1870 para microscopía óptica, y se mantuvieron firmemente hasta hace poco. Durante la última década, han surgido una variedad de métodos que tienen el potencial de superar los límites de difracción de resolución en al menos un orden de magnitud en el ámbito de las dimensiones moleculares, incluso en los exámenes de estructuras de células vivas. Este artículo examina cuatro de estas estrategias en el campo en rápida evolución de la microscopía de superresolución: microscopía óptica de barrido de campo cercano, microscopía de reducción de emisión estimulada, microscopía de iluminación estructurada de superresolución y microscopía de localización por fotoactivación y su microscopía de reconstrucción óptica estocástica relativa.


Unidad 5 Preguntas: Genética, ADN y otras pelusas Vista previa de tarjetas didácticas

Las células contienen genes supresores, que codifican proteínas que controlan la división y el crecimiento celular. Describa qué se entiende por mutación y explique cómo una mutación en genes supresores puede conducir al desarrollo de un tumor maligno. (6)

Mutación del gen supresor: hasta 4 puntos 1. La mutación es un cambio en el ADN / cadena con sentido 2. Secuencia de bases alterada / p. Ej. 3. El gen supresor produce instrucciones incorrectas / tiene un código diferente 4. (Por lo tanto) secuencia de aminoácidos diferente 5. Estructura de proteína diferente / proteína no funcional Tumor maligno - hasta 2 puntos 6. División celular por mitosis 7. Crecimiento anormal de células tumorales / continuo / incontrolado / rápido 8. Las células tumorales se diseminan / invaden otros tejidos / forman tumores secundarios / metástasis 9. A través de la sangre / sistema linfático

Explicar por qué una mutación que implica la eliminación de una base puede tener un efecto mayor que una que implica la sustitución de una base por otra.

La deleción causa cambio de marco / altera la secuencia de bases (desde el punto de mutación) cambia muchos aminoácidos / secuencia de aminoácidos (desde este punto) la sustitución altera un codón / triplete un aminoácido alterado / código degenerado / mismo aminoácido codificado para

Un gen se obtiene a partir de ARNm (mediante transcriptasa inversa), en lugar de ADN. Sugiera por qué.

Idea de que el ARNm está presente en grandes cantidades en la célula que produce la proteína / ARNm ha sido editado / no contiene intrones / códigos de ARNm para una sola proteína Dificultad para encontrar un gen entre todos los genes del núcleo / grandes cantidades de ARNm que codifica la insulina estar presente en las células productoras de insulina / idea de que el ARNm será 'editado'

contiene genes / nucleótidos / secciones de ADN / ADN artificial de dos especies / 2 tipos de organismos

Describa una forma en la que la estructura del ADN de un gen puede cambiar como resultado de una mutación.

Adición / deleción / sustitución de un nucleótido / base Sustituciones: sentido erróneo (el codón cambió para codificar el nuevo aminoácido), sin sentido (el codón cambió a un codón de terminación), silencioso (cambio en la 3a base de un codón y todavía resultados en el mismo aminoácido debido a un código genético degenerado) Adición / eliminación: se produce un cambio de marco, altera la secuencia de bases desde el punto de mutación y puede cambiar muchos aminoácidos

La longitud (corta) de ADN monocatenario (rechaza la referencia al ARN) con secuencia de base específica / secuencia de base complementaria indica dónde comienza la replicación / detiene el hibridación

Explique cómo el uso de una sonda genética podría permitir detectar la presencia de un alelo mutante del gen de la fibrosis quística.

La sonda se adherirá (al alelo mutante) se adhiere a una hebra de ADN como resultado de la radioactividad de emparejamiento de bases complementarias detectada en la película / rayos X / por autorradiografía (si el alelo mutante está presente)

Para marcar el comienzo y / o el final de la parte de ADN necesaria / para la unión de enzimas o nucleótidos / iniciador / mantiene las hebras separadas Se une a / complementaria al comienzo del gen / final del fragmento Replicación de la secuencia de bases a partir de aquí

Fragmento de ADN monocatenario Complementario a / se une a una secuencia de bases / gen conocidos

Describir cómo la estructura del ADN le permite realizar su función.

El esqueleto de azúcar y fosfato da fuerza El enrollamiento proporciona una forma compacta La secuencia de bases permite almacenar la información La molécula larga / el enrollamiento almacena una gran cantidad de información El emparejamiento de bases complementarias permite que la información se replique / transcriba La doble hélice protege los enlaces de hidrógeno débiles / la doble hélice hace que la molécula sea estable Muchos Los enlaces de hidrógeno juntos dan estabilidad a la molécula Evita que el código se corrompa El enlace de hidrógeno permite que las cadenas se dividan para la replicación / transcripción O la molécula se abre fácilmente para la replicación / transcripción.

Describe la estructura molecular del ADN y explica cómo se replica una secuencia de ADN. (9)

composición de un nucleótido, 4 bases denominadas "esqueleto" de azúcar-fosfato dos (polinucleótidos) hebras ejemplo de emparejamiento de bases específico, p. ej. A – T / C – G enlace de hidrógeno "desenrollado" / "descomprimido" replicación semiconservadora ADN polimerasa Se forman nuevas hebras complementarias / molécula de ADN idéntica producida ADN insertado en plásmidos que se auto-replican

1) ARNt En forma de trébol Longitud estándar Tiene un sitio de unión de aminoácidos anticodón El ARNt tiene enlaces H entre pares de bases complementarias Número limitado de tipos (64) 2) ARNm Lineal Longitud variable (depende de la longitud del gen) Muchos tipos diferentes (depende de la gen) Sin enlace H Sin pares de bases

Explicar la importancia de los genes marcadores.

Permite que las bacterias transformadas se separen de las no transformadas Más detalles, p. Ej. las bacterias transformadas sobreviven cuando el antibiótico se aplica al medio

Explique cómo la exposición a un agente mutágeno puede resultar en la producción de una enzima inactiva por parte de una célula.

Cambio en la secuencia de nucleótidos / bases / adición / deleción / sustitución cambio de orden de aminoácidos / proteína diferente / estructura terciaria diferente enzima inactiva si se cambia la forma del sitio activo / no se forma el complejo enzima-sustrato

Una mutación genética puede no provocar ningún cambio en la estructura de la proteína codificada. Explicar por qué.

Código degenerado / descripción clara (nuevo triplete) códigos para el mismo aminoácido

Explicar cómo se fabrican los plásmidos modificados mediante ingeniería genética y cómo el uso de marcadores permite detectar las bacterias que contienen estos plásmidos.

aislar el gen / ADN deseado de otro organismo / ARNm de la célula / organismo usando endonucleasa de restricción / enzima de restricción / transcriptasa inversa para conseguir que el ADN produzca extremos pegajosos usar ligasa para unir el gen deseado al plásmido también incluir gen marcador ejemplo de marcador p. ej. resistencia a los antibióticos agregar plásmido a las bacterias para que crezcan (colonias) (réplica) placa en el medio donde se expresa el gen marcador bacterias / colonias no muertas tienen gen de resistencia a antibióticos y (probablemente) el gen deseado bacterias / colonias que expresan el gen marcador tienen el gen deseado así como

Explica cómo funciona la electroforesis.

Separa fragmentos de ADN de diferentes tamaños. Las muestras de ADN se colocan en pocillos cortados en un gel de aragosa, se cubren con una solución iónica tamponada. Se pasa corriente a través del gel y el ADN con carga negativa se mueve hacia el electrodo positivo. Los fragmentos de ADN se difunden a través de los poros del gel y las piezas más grandes se enfrentan a una mayor resistencia al movimiento que las piezas más pequeñas, por lo que viajarán una distancia más corta.

¿Qué son las enzimas de restricción?

Estas son enzimas que cortan el ADN en sitios específicos, secuencias de reconocimiento (secuencias palindrómicas) GAATTC, CTTAAG Algunas enzimas de restricción cortan directamente a través de ambas cadenas, formando extremos romos. La mayoría de las enzimas hacen un corte escalonado en las dos hebras, formando extremos pegajosos. Los productos se denominan fragmentos de restricción.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se puede utilizar para producir grandes cantidades de ADN. Describe cómo se realiza la PCR. (6)

1. ADN calentado de 90 a 95 ° C 2. Las hebras se separan 3. Enfriado / a una temperatura por debajo de 70 ° C 4. Los cebadores se unen 5. Los nucleótidos se unen 6. Por emparejamiento de bases complementarias 7. Temperatura 70 - 75 ° C 8. ADN polimerasa une nucleótidos juntos 9. Ciclo repetido

• Los medicamentos y los fármacos se pueden producir de forma segura en grandes cantidades a partir de microbios en lugar de a partir de animales sacrificados. Estos medicamentos benefician a los seres humanos y también pueden evitar el sufrimiento de los animales. • La productividad agrícola se puede mejorar utilizando menos pesticidas o fertilizantes, lo que ayuda al medio ambiente. Los cultivos transgénicos pueden crecer en suelos previamente inadecuados o en climas previamente inadecuados. • Los cultivos transgénicos pueden mejorar la nutrición y la salud de millones de personas al mejorar la calidad nutricional de sus cultivos básicos.

A veces se producen errores durante la copia de una secuencia de bases. Explique por qué algunos errores tienen consecuencias menos graves que otros.

los cambios en la secuencia de bases no afectarán necesariamente a los aminoácidos codificados para / la mayoría de los aminoácidos tienen más de un código estos códigos difieren solo en la tercera base, por lo que es probable que los cambios en la tercera base no provoquen cambios en la secuencia de aminoácidos / cambios en la proteína la primera / segunda base da como resultado un aminoácido incorrecto en la secuencia / formación de la proteína incorrecta / ejemplo de mutación que causa este tipo de cambio cambio en el aminoácido presente puede no tener efecto sobre el funcionamiento de la proteína / algunos aminoácidos más importantes en la estructura terciaria que otros

La sección de ADN se desenrolla / desenrolla El ADN se separa, los enlaces h se rompen Los nucleótidos del ARN alinean el emparejamiento de bases complementarias / ejemplo de emparejamiento U reemplaza a T ARNm polimerasa (une nucleótidos) ARNm se modifica, se eliminan los intrones

La transformación es el proceso de intentar introducir el plásmido recombinante en la bacteria. Explica cómo podrías identificar las bacterias que contienen el plásmido.

placa de agar que contiene ampicilina / sin tetraciclina y placa de agar que contiene tetraciclina en bacterias con ADN humano El gen de la tetraciclina ya no es funcional / no es resistente a la tetraciclina Las bacterias con el ADN humano crecen en la placa con ampicilina / sin tetraciclina pero mueren por las bacterias tetraciclinas con sin ADN extra en el plásmido no muerto,

Describir y explicar cómo se controla la expresión génica (pretranscripción).


El brillante avance de la biotecnología

Estos ratones están brillando porque los científicos insertaron un gen que se encuentra en ciertas medusas bioluminiscentes en su ADN. Ese gen es una receta para una proteína que se ilumina en verde cuando es golpeada por luz azul o ultravioleta. La proteína está presente en todo su cuerpo. Como resultado, su piel, ojos y órganos emiten una luz inquietante. Solo su pelaje no brilla.

Teru Wakayama Teru Wakayama

en Advanced Cell Technology en Worcester, Mass., estos ratones llaman la atención sobre lo poderosa que se ha vuelto la ingeniería genética. También subrayan la importancia de la proteína verde fluorescente o GFP. La proteína brillante es ahora un resaltador biológico ampliamente utilizado que ayuda a los científicos a encontrar y estudiar genes más rápidamente. Pero pocos se dieron cuenta cuando

Osamu Shimomura Osamu Shimomura

, entonces científico de Princeton, descubrió la GFP hace 40 años.

Osamu Shimomura Osamu Shimomura

notó por primera vez la proteína verde fluorescente (GFP) en 1962. Al principio, era una mera nota a pie de página en un artículo científico sobre una pequeña medusa bioluminiscente llamada Aequoria Victoria. El estudio del brillo de esa medusa se convirtió en el trabajo de toda la vida de Shimomura.

Durante 20 años a partir de 1967, Shimomura hizo una peregrinación de verano a Friday Harbor en el estado de Washington. Con su esposa, hijo e hija, podría recolectar más de 3,000 medusas por día. Durante varios meses, eso podría sumar hasta 50.000 medusas con un peso total de dos toneladas y media.

A partir de esa enorme carga de medusas, sería posible purificar quizás unos cientos de miligramos de las proteínas brillantes para su estudio. Una sola medusa no necesita mucha proteína emisora ​​de luz para que su cuerpo en forma de lente brille.

La Aequoria Victoria promedio tiene de tres a cuatro pulgadas de ancho y tiene la forma de un paraguas, con 100 órganos productores de luz del tamaño de semillas de amapola espaciados en su borde exterior. Dentro de cada órgano, dos reacciones químicas producen el brillo verde.

Una proteína llamada aequorin produce la luz a través de una reacción que involucra iones de calcio. Pero esta luz es azul. La proteína verde fluorescente absorbe este azul y lo reemite como un resplandor verde. Durante años, Aequorin recibió la mayor parte de la atención. Siete años después de que se identificara por primera vez la GFP, un equipo de investigadores de Harvard la "descubrió", sin haber oído hablar de ella antes.

La aequorina resultó útil, especialmente como herramienta para estudiar los nervios, que utilizan los iones de calcio con los que reacciona. La GFP eventualmente se convertiría en una herramienta vital que los biólogos moleculares usarían para seleccionar los genes que desean estudiar. Pero primero, era necesario encontrar el gen que crea la proteína GFP. Eso llevaría décadas.

William Ward William Ward

Douglas Prasher Douglas Prasher

en una expedición de caza de medusas en la década de 1980. Ward, profesor de la Universidad de Rutgers, había pasado una década convirtiéndose en uno de los expertos mundiales en la proteína verde fluorescente que se encuentra en la medusa Aequoria. Prasher quería encontrar el gen que produce GFP.

Prasher, investigador del Instituto Oceanográfico Woods Hole, ya conocía bien Aequoria. Clonó la otra proteína brillante de la medusa, Aequorin, mientras realizaba su trabajo de posgrado en la Universidad de Georgia. Pero la clonación del gen GFP resultaría difícil de financiar y terminar.

Después de buscar fondos, Prasher consiguió una subvención de tres años de la Sociedad Estadounidense del Cáncer. Usó los tres años tratando de encontrar una secuencia genética que coincidiera con la proteína, una tarea que podría hacerse rápidamente hoy. Cuando terminó en 1992, no le quedaban fondos suficientes para poner el gen en bacterias, una prueba necesaria si quería estar seguro de que tenía la secuencia de ADN correcta.

Martin Chalfie Martin Chalfie

en la Universidad de Columbia y

en la Universidad de California en San Diego terminó probando la proteína en otros organismos, usando secuencias de Prasher. A Chalfie generalmente se le atribuye la popularización de la proteína. Prasher no recibió la titularidad en WHOI y se mudó a un campo completamente diferente.

Ahora es genetista de poblaciones en el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos en Wood's Hole, Massachusetts.

A principios de la década de 1990, un profesor de Columbia llamado

Martin Chalfie Martin Chalfie

Escuché que otro investigador, Douglas Prasher, estaba tratando de localizar el gen de una proteína verde fluorescente (GFP) que se encuentra en las medusas. Entusiasmado, Chalfie llamó a Prasher y le pidió una copia del gen.

Pero cuando Prasher finalmente encontró el gen después de años de investigación, Chalfie se tomó un año sabático en la Universidad de Utah. "En ese momento, nunca estaba al teléfono", dice Prasher. "Él tenía una novia ahí fuera".

Prasher siguió adelante y publicó su descripción del gen GFP. Chalfie encontró ese artículo científico mientras trabajaba con un estudiante de posgrado, y los dos investigadores finalmente se pusieron en contacto. Prasher le envió a Chalfie una copia del gen secuenciado.

Muchos dudaban que el gen GFP produjera la proteína brillante por sí solo. Pero cuando Chalfie lo puso en bacterias y las iluminó con una luz azul, brillaron. El artículo de Chalfie de 1994 sobre el gen lo popularizó como marcador genético. Los científicos podrían vincular la GFP con otro gen si este fragmento de ADN presente en una célula brillaría.

En cuanto a la novia de Chalfie, una destacada investigadora de la mosca de la fruta llamada Tulle Hazelrigg: los dos se casaron y ambos son profesores en Columbia. Hazelrigg hizo su propia gran contribución a la investigación de GFP: fue una de las primeras en unir GFP a otras proteínas, lo que permitió a los científicos observar dónde van las proteínas individuales dentro de una célula.

La creación de Martin Chalfie de bacterias que brillaban con una proteína verde fluorescente hizo que la biología molecular explotara con un nuevo color. Los científicos podrían unir el gen GFP a otros genes. En lugar de realizar pruebas complicadas para ver si habían logrado insertar un gen en un organismo, los científicos podían simplemente hacer brillar una luz azul y observar el resplandor.

"Es como tener un corrector ortográfico que subraya las palabras si ha cometido un error", dice el profesor Bill Ward de Rutgers, quien se sorprendió de que las bacterias de Chalfie brillaran en absoluto. "El resto de nosotros sabíamos que no funcionaría", dice Ward.

Otras proteínas bioluminiscentes no se encienden a menos que estén presentes ciertas enzimas. Pero la GFP es una pared de hormigón de una molécula: se curva alrededor de sí misma de modo que no hay lugar para que una enzima se una. "Es como los pies de alguien en las películas de gánsteres de Jersey donde te dan chanclos de hormigón", dice el investigador de GFP Roger Tsien.

Otra sorpresa: muchos genes producen proteínas a medio cocer que necesitan interactuar con otras proteínas, fabricadas por otros genes, para funcionar. Pero esto no es cierto para GFP, no necesita ninguna ayuda.

La proteína verde fluorescente se usó originalmente para descubrir si los genes estaban presentes. Luego

Tul Hazelrigg Tul Hazelrigg

, profesor de Columbia, modificó genes en moscas de la fruta para que las proteínas que producen tengan GFP adherida a ellas. El resultado es como atar una linterna a la cabeza de su perro. Incluso en la oscuridad total, puedes ver dónde está.

Usando tales proteínas de fusión, un científico puede seguir exactamente dónde se mueve una proteína en una célula o en el cuerpo de un animal. En este caso, Hazelrigg estaba estudiando una proteína involucrada en la producción de esperma y óvulo. Los puntos brillantes de esta larva masculina son los testículos de la mosca. El resto de las larvas es verde debido a la bioluminiscencia en su intestino, la GFP se expresa principalmente en los órganos reproductores.

La creación de animales transgénicos que contienen el gen GFP se ha vuelto cada vez más importante. En ratones, por ejemplo, la GFP ha permitido la investigación con células madre adultas. Las células madre extraídas de un ratón y colocadas en otro pueden identificarse por su brillo verde.

Los científicos que quieren insertar proteína verde fluorescente en las células ya no están restringidos al verde. La proteína ahora viene en variedades amarillas y azules. Generalmente, la GFP que se ve en el laboratorio no es la misma sustancia que se encuentra en las medusas.

, profesor de la Universidad de California en San Diego, mutó y alteró el gen GFP para producir varios colores. También logró hacerlo más brillante. La GFP que se encuentra en la medusa Aequoria produce parte de su luz cuando es golpeada por luz ultravioleta, y parte cuando es golpeada por varios tonos de azul. La versión de Tsien de la proteína produce toda su luz cuando es golpeada por un solo color.

GFP es una herramienta valiosa y los retoques de Tsien la hicieron más valiosa. Las aguas de propiedad intelectual que rodean todo el trabajo de GFP son turbias, pero las patentes de Tsien eran lo suficientemente fuertes como para servir como una de las bases de una biotecnología llamada Aurora Biosciences. Aurora fue comprada recientemente por Vertex Pharmaceuticals por casi $ 600 millones en acciones.


Isotiocianato de fluoresceína (FITC)

El isotiocianato de fluoresceína es uno de los tintes / sondas fluorescentes orgánicos más populares utilizados en citometría de flujo e inmunofluorescencia. Se caracteriza por una absorbancia máxima / pico de 495 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm con interacciones de fluoresceína a fluoresceína que dan como resultado la transferencia de energía y el autoapagado cuando se concentra.

El marcado de moléculas con el tinte se puede utilizar para los siguientes propósitos:

  • Detección de proteínas tras separaciones electroforéticas
  • Análisis de microsecuenciación de proteínas y péptidos
  • Análisis de moléculas mediante electroforesis de zona capilar
  • Seguimiento y detección de moléculas en biointeracciones.
  • Detección de antígenos en células y sección de tejido.
  • Detección de apoptosis mediante el etiquetado de fragmentos de ADN.

Además de ser fácil de usar para la preparación de conjugados debido a su solubilidad en agua, el isotiocianato de fluoresceína también es muy fluorescente (debido a los grandes coeficientes de extinción y los altos rendimientos cuánticos después de la conjugación), lo que lo convierte en el tinte de elección para muchos procesos.

* En la citometría de flujo y la microscopía de inmunofluorescencia, el tinte se conjuga con varios anticuerpos (anticuerpos primarios o secundarios) para examinar y estudiar estados como la inmunodeficiencia de IL-17 y el papel de CD63 en las funciones renales, etc.

* Como derivado de la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína contiene un grupo reactivo de isotiocianato que contribuye a su naturaleza reactiva hacia los grupos anime y sulfhidrilo que se encuentran típicamente en las biomoléculas.


Resumen de la charla

Las imágenes de células vivas se han revolucionado con el descubrimiento de la proteína verde fluorescente (GFP). Roger Tsien habla sobre proteínas fluorescentes y cubre la historia de GFP, cómo se pliega y se vuelve fluorescente, cómo se ha mutado para producir colores adicionales (azul, cian, amarillo). También cubre nuevas proteínas fluorescentes fotoconmutables y fotoactivatibles, cuyo color puede cambiarse con la luz, y nuevas proteínas fluorescentes infrarrojas.

Preguntas

  1. ¿De qué organismo se derivaron las proteínas rojas fluorescentes?
  2. ¿Cuál de las siguientes afirmaciones es verdadera para la generación del fluoróforo GFP?
    1. El peróxido de hidrógeno se genera en la reacción.
    2. La química para producir el fluoróforo GFP ocurre unos segundos después del plegamiento de la proteína.
    3. El fluoróforo se formará en entornos anaeróbicos.
    4. El carbonilo de glicina es crucial para la reacción de ciclación.
    1. Mejora el pliegue de proteínas
    2. Cambiar el espectro de emisión
    3. Cambiar el espectro de excitación
    4. Produce una maduración más rápida del fluoróforo.
    1. Dendra se fotoactiva con luz azul y cambia su emisión de azul a verde
    2. La propiedad única de Dronpa es que su fluorescencia desaparece pero puede ser fotoactivada por la luz roja.
    3. La proteína azul fluorescente sería una buena opción para la obtención de imágenes de tejidos profundos
    4. Las proteínas fluorescentes infrarrojas requieren el cofactor biliverdina

    Respuestas


    ¿Cómo dirigen los genes la producción de proteínas?

    La mayoría de los genes contienen la información necesaria para producir moléculas funcionales llamadas proteínas. (Algunos genes producen moléculas reguladoras que ayudan a la célula a ensamblar proteínas). El viaje de un gen a la proteína es complejo y está estrictamente controlado dentro de cada célula. Consta de dos pasos principales: transcripción y traducción. Juntas, la transcripción y la traducción se conocen como expresión génica.

    Durante el proceso de transcripción, la información almacenada en el ADN de un gen se pasa a una molécula similar llamada ARN (ácido ribonucleico) en el núcleo celular. Tanto el ARN como el ADN están formados por una cadena de bloques de construcción llamados nucleótidos, pero tienen propiedades químicas ligeramente diferentes. El tipo de ARN que contiene la información para producir una proteína se llama ARN mensajero (ARNm) porque transporta la información, o el mensaje, desde el ADN fuera del núcleo al citoplasma.

    La traducción, el segundo paso para pasar de un gen a una proteína, tiene lugar en el citoplasma. El ARNm interactúa con un complejo especializado llamado ribosoma, que "lee" la secuencia de nucleótidos del ARNm. Cada secuencia de tres nucleótidos, llamada codón, generalmente codifica un aminoácido en particular. (Los aminoácidos son los componentes básicos de las proteínas). Un tipo de ARN llamado ARN de transferencia (ARNt) ensambla la proteína, un aminoácido a la vez. El ensamblaje de proteínas continúa hasta que el ribosoma encuentra un codón de "parada" (una secuencia de tres nucleótidos que no codifica un aminoácido).

    El flujo de información del ADN al ARN y a las proteínas es uno de los principios fundamentales de la biología molecular. Es tan importante que a veces se le llama el "dogma central".

    A través de los procesos de transcripción y traducción, la información de los genes se utiliza para producir proteínas.


    3 ejemplos importantes de animales transgénicos | Genética

    Los siguientes puntos destacan los tres ejemplos importantes de animales transgénicos. Los ejemplos son: 1. Plataforma rodante de clonación 2. Ratones transgénicos 3. Sistema informador.

    Ejemplo n. ° 1. Clonación de Dolly:

    En febrero de 1996, Ian Wilmut y colaboradores del Instituto Roslin y PPL Therapeutics, ambos en Edimburgo, Escocia, informaron en la revista Nature que habían clonado con éxito una oveja de una célula extraída de la ubre de una oveja de seis años.

    El cordero clonado se llamó Dolly. En el pasado, los embi70 de animales genéticamente idénticos se habían creado solo con células de anfibios, y los creados a partir de núcleos adultos nunca habían llegado con éxito a la edad adulta. La clonación en la que los núcleos provenían de células fetales o células de líneas celulares había tenido éxito antes en mamíferos. La palabra clon significa crear una copia genéticamente idéntica.

    Para clonar un animal, es necesario comenzar con un huevo, la única célula conocida que inicia y apoya el desarrollo. Para clonar un individuo es necesario conseguir un óvulo sin núcleo y luego trasplantar en él un núcleo de origen conocido.

    Las técnicas de trasplante nuclear se habían elaborado con ranas y sapos en la década de 1950. Los científicos escoceses lograron obtener huevos de oveja, enucleándolos (removiendo sus núcleos) y luego transfiriéndolos en núcleos de donantes fusionando las células de donantes y los huevos enucleados con un pulso eléctrico.

    El pulso eléctrico también inició el desarrollo del huevo. Aunque sólo una preñez de las veintinueve iniciadas tuvo éxito, el cordero que nació parecía normal en todos los aspectos ya que había tenido descendencia.

    Otros habían probado este tipo de experimentos con muchos tipos de animales, incluidos los ratones. No tuvieron éxito por numerosas razones. La explicación más probable del éxito reciente, según los científicos, es que las células del donante se mantuvieron en una fase de no crecimiento durante varios días, lo que puede haberlas sincronizado con el ovocito.

    Por tanto, el núcleo y el ovocito se encontraban en la misma etapa del ciclo celular y, por tanto, eran compatibles. No se conoce con certeza otra reorganización que tuvo que tener lugar en los cromosomas donantes, pero una cosa está clara: el núcleo de una célula adulta en la oveja tiene todo el material genético necesario para mantener el crecimiento y desarrollo normal del óvulo. Desde entonces, el trabajo se ha repetido con cabras, vacas y ratones.

    Hay varias ramificaciones para el éxito de este trabajo:

    1. La clonación de mamíferos podría convertirse en un procedimiento de rutina. Esto nos permitiría estudiar el desarrollo de los mamíferos y replicar individuos genéticamente idénticos, particularmente animales transgénicos que tendrían un genoma particular de valor.

    2. También podemos utilizar estas técnicas para estudiar el envejecimiento, como un núcleo & # 8220old & # 8221 en el inicio del desarrollo de un nuevo organismo.

    3. También es de interés la interacción de un genoma particular con un citoplasma particular, ya que el citoplasma contiene no solo el material necesario para el desarrollo temprano, sino también orgánulos celulares, incluidas las mitocondrias que tienen su propio material genético.

    Ejemplo # 2. Ratones transgénicos:

    Las células animales, como los protoplastos de las células vegetales, pueden absorber cromosomas extraños o ADN directamente del medio ambiente con una eficiencia muy baja (en presencia de fosfato cálcico). La inyección directa de ADN mejora enormemente la eficiencia.

    Por ejemplo, los ratones transgénicos ahora se preparan de forma rutinaria inyectando ADN en ovocitos o en embriones de una o dos células obtenidos de ratones hembras después de un tratamiento hormonal apropiado.

    Después de la inyección de aproximadamente 2 picolitros (2 x 10-12 litros) de ADN clonado, las células se reimplantan en los úteros de hospedadores femeninos receptivos. En aproximadamente el 15% de estas inyecciones, el ADN extraño se incorpora al embrión.

    Los animales transgénicos se utilizan para estudiar la expresión y el control de genes eucariotas extraños. En 1988, un ratón transgénico propenso al cáncer fue el primer animal modificado genéticamente en ser patentado. Por tanto, el ratón proporciona un modelo excelente para estudiar el cáncer. (Surgió una controversia sobre si los organismos superiores modificados deberían ser patentables en la actualidad).

    Los ratones ya han sido transfectados con éxito con un gen de la hormona del crecimiento de rata y se han producido ovejas transgénicas que expresan el gen de un factor de coagulación humano. La última disputa sobre el ADN recombinante surgió a partir de la clonación de ovejas en 1997.

    La transfección también puede estar mediada por retrovirus (virus de ARN que contienen el gen de la transcriptasa inversa). Por ejemplo, un vector retrovírico se sometió a ritrodusión y se reparó un glóbulo blanco humano que carecía de la enzima adenosina desaminasa.

    Un retrovirus responsable de una forma de leucemia en roedores, los virus de la leucemia murina de Moloney se diseñaron para eliminar todos los genes del virus y reemplazarlos con un marcador antibiótico (resistencia a la neomicina) y el gen de la adenosina desaminasa humana.

    El virus se une a la superficie celular y se introduce en la célula, su ARN se convierte en ADN mediante transcripción inversa y el ADN se incorpora a una de las células, los cromosomas. No es posible que el virus altamente modificado ataque y dañe las células.

    Ejemplo # 3. Sistema de reporteros:

    Se usan dos sistemas informadores para indicar que un experimento de transfección fue exitoso. Las plantas se pueden transfectar con los plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens. Cuando una planta se infecta con A. tumefaciens que contiene el plásmido Ti, se induce un tumor de agallas en la corona que transfiere la región del ADN-T.

    Las células transfectadas con el ADN-T son inducidas a crecer y a producir opiniones de las que se alimentan las bacterias. Gran parte de la investigación reciente se ha concentrado en la ingeniería de plásmidos Ti para que contengan otros genes que también se transfieren a las plantas huésped durante la infección, creando plantas transgénicas. Una serie de experimentos ha sido especialmente encantadora.

    Las plantas de tabaco han sido transinfectadas por plásmidos Ti que contienen el gen de luciferasa de luciérnagas. The product of this gene catalyzes the ATP- dependent oxidation of luciferin, which emits light. When a transfected plant is watered with luciferin, it glows like a firefly. The value of these experiments is not the production of glowing plants but rather the use of the glow to “report” the action of specific genes.

    In further experiments, the promoters and enhancers of certain genes were attached to the luciferase gene. As a result, luciferase would only be produced when these promoters were activated thus, the glowing areas of the plant show where the transfected gene is active.

    One of the more recent reported systems developed uses a gene from jellyfish that produces green fluorescent protein. The value of this system is that it “reports” when ultra-violet light falls on it, rather than it requiring an addition, as in the luciferase system (see Tamarin, 2002).


    Lecture 17: Genomes and DNA Sequencing

    Professor Martin talks about DNA sequencing and why it is helpful to know the DNA sequence, followed by linkage mapping and then the different methods of sequencing DNA.

    Instructor: Adam Martin

    Lecture 1: Welcome Introdu.

    Lecture 2: Chemical Bonding.

    Lecture 3: Structures of Am.

    Lecture 4: Enzymes and Meta.

    Lecture 5: Carbohydrates an.

    Lecture 9: Chromatin Remode.

    Lecture 11:Cells, The Simpl.

    Lecture 16: Recombinant DNA.

    Lecture 17: Genomes and DNA.

    Lecture 18: SNPs and Human .

    Lecture 19: Cell Traffickin.

    Lecture 20: Cell Signaling .

    Lecture 21: Cell Signaling .

    Lecture 22: Neurons, Action.

    Lecture 23: Cell Cycle and .

    Lecture 24: Stem Cells, Apo.

    Lecture 27: Visualizing Lif.

    Lecture 28: Visualizing Lif.

    Lecture 29: Cell Imaging Te.

    Lecture 32: Infectious Dise.

    Lecture 33: Bacteria and An.

    Lecture 34: Viruses and Ant.

    Lecture 35: Reproductive Cl.

    PROFESSOR: And today I'm going to talk about DNA sequencing. And I want to start by just sort of illustrating an example of how knowing the DNA sequence can be helpful. So you remember in the last lecture, we talked about how one might identify a gene through functional complementation. And this process involved making a DNA library that had different fragments of DNA cloned into different plasmids and then involved finding the needle in the haystack where you find the gene that can rescue a defect in a mutant that you have.

    So if this line that I'm drawing here is genomic DNA, and it could be genomic DNA from, let's say, a prototroph for LEU2, the leucine gene. So this is from a prototroph.

    Then you could cut up the DNA with EcoRI. And if there is not a restriction site in this LEU2 gene, you get a fragment that contains the LEU2 gene. And then you could clone this into some type of plasmid that replicates in the organism that you're introducing it and propagating it in.

    And so that would allow you to then test whether or not this piece of DNA that you have compliments a LEU2 auxotroph, OK?

    Now one thing I want to point out is that because these EcoR1 sites, these sticky ends, would recognize this EcoR1 one end or this EcoR1 end, you can imagine that this gene-- if the gene reads this way to this way-- it could insert this way into the plasmid. Or it could insert in the opposite direction. So it could be inverted. So this would have some sort of origin of replication and some type of selectable marker.

    But if you have the same restriction site it can insert one way or the opposite way. That's just one thing I wanted to point out.

    Now let's say rather than leucine, you're interested in cycling dependent kinase, and you had a mutant end CDK and you had this sequence of your yeast CDK gene. Well, rather than having to dig through a whole library of pieces of DNA for the CDK gene, basically you're sort of fishing for that needle in the haystack. If you knew the sequence of the human genome, you'd be able to identify similar genes by sequence homology.

    And you could then take a more direct approach, where you take-- let's say you have a piece of human DNA now, double stranded DNA, and it has the CDK gene. You could take human DNA with this CDK gene. And you have unique sequence around the CDK gene, which would allow you to denature this DNA. And if you denature the DNA, you'd get two single strands of DNA. And you could then design primers that recognize unique sequences flanking the CDK gene.

    So you could imagine you'd have a primer here and a primer here. And then you could use PCR to amplify specifically CDK gene from, it could be the genome or from some library. And then you get this fragment here, which includes CDK. So knowing the sequence of the genome would allow you to more rapidly go from maybe a gene that you've identified as being important in one organism, and find the human equivalent that might be doing something similar in humans. So this step here is basically PCR.

    And let's say the CDK gene had restriction sites. Let's see, we'll say restriction site K and A here. Then if you have these restriction sites in your fragment of DNA, you can then digest or cut that piece of DNA with these restriction endonucleases. And then you'd get a fragment of CDK that has K and A sticky ends. We'll pretend that both of these have sticky ends.

    And now you have unique sticky ends between K and A. And you might have a vector that also has these two sites. And you could digest this vector with these two enzymes. And that would allow you to insert the specific gene in this plasmid.

    And if you have two unique sites, because K only recognizes K here and A only recognizes A, then it will ligate in. But you can do it with a specific orientation because you have two different restriction sites. So I hope you all see how it's with one restriction site versus two.

    Está bien. Now let's say you want to do something more complicated than this. Let's say rather than just identifying the gene that's involved in cell division, you want to engineer a new gene, in order to determine where this particular protein, CDK, localizes in the cell. So we have CDK, which could be from yeast or human, it doesn't matter. And you want to engineer a new protein, basically, that you can see.

    So remember Professor Imperiali introduced green fluorescent protein earlier in the year. And this green fluorescent protein is from a gene from jellyfish. So now we could, using what I've told you, reconstruct or engineer a gene that has DNA from three different organisms, in order to make a CDK variant that we are able to see in the cell.

    So remember, a green fluorescent protein is like a beacon, if it's attached to a protein. If you shine blue light on it, it emits green light. And so you can use a fluorescent microscope in order to see it.

    In this case, let's say there's also another restriction site here, R. And let's say you have a fragment of GFP that has two restriction sites, A and R. You could then cut this fragment and this fragment with these restriction enzymes A and R. And you could insert GFP at the C terminus of the CDK gene. So you could go and have a gene that has CDK GFP inserted inside a bacterial vector.

    Now which one of these junction sites do you think would be most sensitive in doing this type of experiment? So there are three junction sites. There's this one, this one, and this one. Which is the one you're probably going to put the most thought into when you're doing this experiment?

    ADAM MARTIN: The A site. Miles is exactly right. This one is going to be important. And why did you choose that site?

    AUDIENCE: Of the three sites, two are half insert, half originals [INAUDIBLE]. But at A, both sides of it are inserts. So [INAUDIBLE] carefully.

    ADAM MARTIN: And if you're trying to make a fusion protein, what's going to be an important quality of this? Malik, DID you have a point?

    AUDIENCE: Well, they try to [INAUDIBLE] we'd have to make sure that the [INAUDIBLE].

    ADAM MARTIN: Excellent job. So Malik just pointed out two really important things. To make this a fusion protein, you have two different open reading frames. These two open reading frames have to be in frame with each other.

    So this junction here has to be in frame where GFP is in frame with CDK, meaning that you're reading the same triplet codons for GFP, there in the same frame as CDK. Also, you want to make sure there's no stop codon here. Because if you had a stop codon here, you're just going to make a CDK protein. And then it's going to stop and then you won't have it fused to GFP.

    And you guys will work through more of these in the homework. So you'll be able to get a sense of it.

    So now for the remainder of this lecture and also for Monday's lecture, I want to go through a problem with you. Basically, if you have a given disease that's heritable, how might you go from knowing that disease is heritable to finding out what gene is responsible for that given disease? And this is going to involve thinking about different levels of resolution, in terms of maps.

    So the highest resolution map you can have for a genome is the sequence. You can have the full nucleotide sequence of a genome. And that's the highest possible resolution because you have single nucleotide resolution as to what every single base pair is. But that's like knowing like your apartment number and your street number and basically knowing everything. But starting out, you might want to know what continent it's on, or what country is it in.

    And so you first have to narrow down the possible locations for a given disease gene. And that will, at first, involve establishing what chromosome and what region of a chromosome a given disease allele is linked to. And that involves making essentially a linkage map, where you establish where a disease gene is located based on its linkage to known markers that are present in the genome.

    Now this is going to require that you remember back two weeks ago, to when we talked about linkage and recombination. And you'll recall that we were looking at the linkage between genes and flies and genes and yeast. One difference between that type of linkage mapping and human linkage mapping is we don't have really clear traits that are defined by single genes. You can't just take hair color and map the hair color gene to link it to a disease gene. Because hair color is determined by many, many different genes.

    So in fruit flies, you can take white eyes and see if it's connected with yellow body color because both of those are determined by single genes. So we need something other than just having phenotypic traits that we can track. We need what are known as molecular markers to be able to perform linkage mapping.

    And so what we need in these molecular markers-- well, if we just think about if we wanted to determine the linkage between the A and B genes. And if you did this cross, would you be able to determine linkage?

    Georgia, you made a motion that was correct. Tell me. Why did you shake your head no?

    AUDIENCE: They'd all be heterozygous.

    ADAM MARTIN: Yeah they'd all be heterozygous. Because this individual has the same allele on both chromosomes, you're not going to be able to differentiate one chromosome from the other. And so the point I want to make is that in order to see linkage, what you need is variation.

    So we need to have variation. And another term for genetic variation is polymorphism. So we need polymorphism, or genetic variation, between these molecular markers.

    We also need genetic variation in the disease. But we have that. We have individuals that are affected by a disease and individuals that are not affected by a disease. So we have variation in alleles there. But in order to map it with a molecular marker, to map linkage to a molecular marker, you also need variation here. So the problem with this cross is here you need to have heterozygote. There needs to be variation in this individual, where both of these alleles are heterozygous.

    So now I want to talk about some of these molecular markers that we can use, and how they vary between individuals and between chromosomes. Now this is going to be maybe the lowest resolution map. But I'm talking about this linkage map here. And you can see highlighted that the bottom here are various types of polymorphisms that we can use to link a given disease allele to a specific chromosome and a specific place on chromosome.

    So I'll start with the first one, which is a simple sequence repeat. It goes by many names. But I will stick with what's on the slide.

    So a simple sequence repeat is also known as a microsatellite. So you might see that term floating around, if you're reading about this. And what a simple sequence repeat is, as the name implies, it's a simple sequence. It could be a dinucleotide, like CA. And it's just a dinucleotide that's repeated over and over again.

    So on a chromosome, you might have a unique sequence, which I'll just draw as a line. , And then you could have a CA dinucleotide that's repeated some number of times, N. And then that's followed by another unique sequence. And that's what's present in it.

    So that would be one strand. And then in the opposite strand, you'd have a unique sequence, the complement of CA, which is GT, and then, again, unique sequence. And so there's variation in the number of repeats of the CA. And so there's polymorphism. So we can use this to establish linkage between this marker and a phenotype, like a disease phenotype.

    So how might you detect the number of repeats that are present here? Anyone have an idea of a tool that we've discussed that could be used here? So one hint that I gave you is that the sequence here is unique and the sequence here is unique. So is there a way we can leverage that unique sequence to determine whether there's a difference in the number of repeats?

    What's a technique we discussed that involves some component of the technique recognizing a unique sequence? Yeah, Natalie?

    ADAM MARTIN: Well, CRISPR Cas9 is a possibility. Jeremy, did you have an idea?

    ADAM MARTIN: PCR-- so it's true. You could get it to recognize that. But then you have to detect it, somehow. So what's more commonly used is PCR. Those are both good ideas. But using PCR, you could design a primer here and a primer here. And you could amplify this repeat sequence. And the number of repeats would determine the size of your PCR fragment.

    So if you did PCR, then you'd get a PCR fragment that has the primers on each end, but then has this certain size based on the number of repeats. So in that case, we need some sort of tool that enables us to determine the size of a particular DNA fragment. And so I'm going to just introduce to you one such tool, which is gel electrophoresis.

    And gel electrophoresis involves taking DNA that you've generated, by either PCR or by cutting up DNA with a restriction enzyme, and loading it in a gel that has agarose. Maybe it's composed of agarose. It could be composed of polyacrylamide. And then because DNA is negatively charged, the backbone, if you run a current through it, such as the positive electrode is at the bottom, then the DNA is going to snake through this gel.

    Now we'll do a quick demonstration, if you two could come up. I need one volunteer. Ori, find 10 of your friends and bring them down. Está bien. That's probably good. Sí.

    All right, Hannah, why don't you-- you guys have to link up, OK? Stay over here. We'll start at this end. This is the negative electrode over here. The positive electrode is going to be down there. And Jackie is going to be our single nucleotide. You guys link like-- yeah. You don't have to do-si-do, or anything like that.

    Está bien. Now what I want you guys to do is I want you to slalom through these cones like it's all agarose gel. So that you're going towards the other side. And I'm going to turn on the current now. So go. All right, stop.

    Está bien. See how the shorter DNA fragment is able to more easily navigate through the cones and get farther. So it was somewhat rigged. Sé. But I just needed some way to make sure you always remember that the shorter nucleotide, or the shorter fragment, is going to migrate faster.

    You guys can go back up. Thank you for your participation. Let's give them round of applause.

    Está bien. So what you just saw is that the longer DNA fragments, they're going to be more inhibited by moving through the gel. And so they're going to move slower and thus, not move as far in the gel. Whereas, the small fragments are going to move much faster because they're able to maneuver their way through this gel much more quickly. So there's going to be an inverse proportionality between the size of the DNA chain and its rate of movement. You're always going to see the shorter DNA fragment moving faster.

    So what one of these gels actually looks like is shown here. So this is a DNA gel that's agarose. And DNA has been run in these different samples. And what you're seeing is this gel is subsequently stained with a dye, like ethidium bromide, which allows you to visualize the individual DNA fragments. And so a band on this gel indicates a whole bunch of DNA fragments that are all roughly the same length. So essentially, you can measure DNA length using this technique.

    What's over here at the end of the gel, this is probably some sort of DNA ladder, where you have DNA fragments of known length that you can use to calibrate the length of these bands over here. So this is how you measure DNA length. And we're going to use it over and over again, as we talk about DNA and sequencing.

    So now, let's think about how this is going to help us establish linkage between a particular marker in the genome and a genetic disease. So if we think about these microsatellite repeats, I told you they're polymorphic. They exhibit a lot of variation in size. And so here's an example showing you a female who has two intermediate sized microsatellites. And if you look at this-- if you did PCR and measured the size of these, you get two different bands because there are two different alleles of different length here.

    So you can see this individual has two intermediate length repeats. And this person has had children with an individual that has a short and a long microsatellite. And you can see that on the gel, here.

    Now this female is affected by some disease. And these two individuals have children. And you can see that a number of those children are affected by the disease. So what mode of inheritance does this look like? If you had your choice between autosomal recessive, autosomal dominant, sex linked dominant, and sex linked recessive, what mode of inheritance is this looking like? Oh, Carmen.

    AUDIENCE: Autosomal recessive.

    ADAM MARTIN: Autosomal recessive? Why do you go with recessive? Yeah, go ahead.

    AUDIENCE: Because there is a male that's affected. But not both of the parents are affected. So it seems like the father is heterozygous and the mother is homozygous recessive.

    ADAM MARTIN: That's possible. That's exactly the logic I want to see. Is there another possibility? Yeah, Jeremy.

    AUDIENCE: Autosomal dominant.

    ADAM MARTIN: It could also be autosomal dominant. So you're right. Tienes razón. If this was not a rare disease, then that male could care be a carrier and could be passing it on to half the children. So that's good. You'd essentially need more information to differentiate between autosomal recessive and autosomal dominant.

    For the purposes of this, we're going to go with autosomal dominant. And what you see is that you want to look at the affected individuals and see if the disease phenotype is linked, or connected, with one of these microsatellite alleles. So if we look at-- we basically PCR DNA from all these individuals. And if you look at who is affected, each one of the individuals has this M double prime band. And none of the unaffected individuals has it.

    So obviously, it would be better to have more pedigrees and more data to really establish significance between this linkage. But this is just a simple example, showing what you could possibly see if you have one of these molecular markers linked to a particular disease allele. So that kind of establishes the principle.

    Now let's think about what are some other molecular markers that are possible? So another type of marker, and this is one that's the most common one, if I go here. So here, you see here's is a linkage map, here. And you see most of these bands are green. And the green markers, here, are what are known as Single Nucleotide Polymorphisms, or SNPs.

    So single nucleotide polymorphisms-- and this is abbreviated SNP. And what a single nucleotide polymorphism is, is it's a variation of a nucleotide at a single position in the genome. So it's just a one base pair difference at a position. So there's variation of single nucleotide at a given position, at a position in the genome. And because that's a pretty general definition, there are tons of these in the genome.

    Now one thing to think about is you could have a mutation in an individual that creates a SNP. So you could have a de novo formation of a SNP. But if you have a SNP and it gets incorporated to the gametes of an individual, then that variant is going to be passed on to the next generation. So this is something that could occur de novo. But it is also heritable. And if it's heritable, then you can follow it and use it to determine if a given variant is linked to a given phenotype, like a disease.

    So to identify a single nucleotide polymorphism, it's helpful to be able to sequence the DNA. And I'll talk about how we could do that in just a minute. But before I go on, I just want to point out a subclass of SNPs that can be visualized without sequencing. And these are called restriction fragment length polymorphisms.

    So restriction fragment-- so it's going to involve some type of restriction enzyme digest length polymorphism. It's a long word. But it's abbreviated RFLP. And what this is, is it's a variation of a single nucleotide. But this is a subclass of SNP. Because this is when the variation occurs in a restriction site for a restriction enzyme.

    So if you remember your good friend EcoR1, EcoR1 recognizes the nucleotide sequence GAATTC. And EcoR1 only cleaves DNA sequence that has GAATTC. So if there was a single nucleotide variation in the sequence, such that it's now GATTTC, or something like that, that destroys the EcoR1 site. And so EcoR1 will no longer be able to recognize this site in the genome and cut it.

    So you could imagine that if you had one individual in the genome having three EcoR1 sites, if you digest this region, you'd get two fragments. But if you destroyed the one in the middle, then if you digested this piece of DNA, then you'd only get one fragment. And that's something. Because it results in different sizes of fragments, that's something you can see just by doing DNA electrophoresis. And maybe you would use some method to detect this specific region, so that you're not looking at all the DNA in the genome, but you're establishing linkage to this specific area.

    You could use PCR. You can have PCR primers here and here. And you could then cut with EcoR1. In one case, you'd get two fragments. In this case, you'd get two fragments. In this case, if you amplified this region of the genome and cut with EcoR1, you'd only get one fragment. So you'd be able to differentiate between those possibilities.

    AUDIENCE: When you use PCR, are there [INAUDIBLE]?

    AUDIENCE: Are there [INAUDIBLE]?

    ADAM MARTIN: Oh. You're saying what causes it to stop? That's a great question, Malik. Sí.

    So initially, it's not going to stop. That's absolutely right. But because every step, each time you replicate, it's then primed with another primer. So you'd replicate something like this that's too long. But then the reverse primer would replicate like this. And it would stop.

    So if you go back to my slide from last lecture, look through that and see if it makes sense how it's ending. Because if you do this 30 times, you really will enrich for a fragment that stops and ends at the two primers, or begins and ends at the two primers, I should say. Buena pregunta. Gracias.

    Está bien. Now, let's talk about DNA sequencing. Because as I showed you, obviously, these SNPs, because there are so many of them, are probably the most useful of these markers to narrow in on where your disease gene is. And to detect a SNP, we need to be able to sequence DNA.

    So I'm going to start with an older method for DNA sequencing, which conceptually, is very similar to how we do DNA sequencing today. And so it will illustrate my point. And then at the end, I'll talk about more modern techniques to sequencing.

    So the technique I'm going to introduce to you is called Sanger sequencing. And that's because it was identified by an individual named Fred Sanger. And I'm going to just take a very simple DNA sequence, in order to illustrate how Sanger sequencing works.

    So let's take a sequence that's really simple. This is very, very simple, and then more sequence here. So let's say we want to determine the nucleotide that's at every position of this DNA fragment. So one way we could maybe conceptually think about doing this, is to try to let DNA polymerase tell us where given nucleotides are. And if we're going to use DNA polymerase, what are we going to need, in order to facilitate this process? Yes, Rachel.

    ADAM MARTIN: You're going to need nucleotides, definitely. So we're going to need nucleotides. What else? To start, what are you going to need? Miles?

    ADAM MARTIN: You're going to need a primer, exactly. Buen trabajo. So you need a primer. So here's a primer.

    And now, we're going to try to get DNA polymerase to tell us whenever there is a given nucleotide in this DNA sequence. And so think with me. Let's say we were able to get DNA polymerase to stop whenever there was a certain nucleotide.

    So if we go through just a couple nucleotides, let's say, at first, we want DNA polymerase to stop whenever there's an A. So let's say there was a possibility it would stop at this A. If it's stopped at this A, you'd generate a fragment of this length. But if it read on through that A, there's another possibility that it would stop at this A.

    So we're kind of looking at when these are stopping. And the final possibility is it goes on and stops at this A. So if this DNA polymerase stopped only at As, you'd get fragments that are these three discrete lengths.

    Now let's consider another possibility. So pink here is stop at A. And in blue, I'm going to draw what would happen if it stopped at T. So they all start from the same place. If it stopped at T, it would just stop one nucleotide beyond this A in this simple sequence. So in blue here, this is stop at T.

    But if it's just a possibility, it stops. And some of the polymerases could go beyond this T and go to the next T and stop here. And again, this would be one nucleotide length longer than this pink one, here. And the final one would-- I'll just draw it down here-- would get out to this last T, here.

    So what you see is if we could get DNA polymerase to stop at these discrete positions, we'd get a different sized fragments, whether it was stopping at one nucleotide versus the other nucleotide. You all see how this is resulting in different fragment lengths. Yes, Andrew.

    AUDIENCE: How would you create a pattern [INAUDIBLE]?

    ADAM MARTIN: There are companies now. You can basically take nucleotides and synthesize these primers chemically, not using DNA polymerase.

    AUDIENCE: I'm saying how would you know what primer to use, if you don't know the sequence?

    ADAM MARTIN: Oh, in this case, you'd have to start with some sequence that you know. So in most sequencing technologies, you kind of make a DNA library, where you know the sequence of the vector. And then you'd use the vector sequence as a primer to sequence into the unknown sequence. Gran pregunta. Buen trabajo.

    Está bien. So what we need now then is some sort of tool or ability to stop DNA polymerase when there's a certain nucleotide base. And to do that, we can use this type of molecule, here, which is known as a dideoxynucleotide. Remember, for DNA polymerase to elongate a chain, it requires that the last base have a three prime hydroxyl.

    And so what this dideoxynucleoside triphosphate is, is it's a nucleoside triphosphate that lacks a three prime hydroxyl. Here, I'll highlight that.

    So you see this guy? You see it bolt the highlight H? There's a hydrogen there on the three prime carbon, rather than the normal hydroxyl group. So if this base gets incorporated into a elongating chain, DNA polymerase is not going to be able to move on.

    So this method where you can add a certain dideoxynucleoside triphosphate to stop chain elongation is known as a chain termination method. So you're getting chain termination. And you're getting this chain termination with a specific dideoxynucleoside triphosphate. So these dideoxynucleotide triphosphates, if they get incorporated into the DNA, are going to halt the synthesis of that DNA strand.

    So if we take our example, here, this might be a reaction that has dideoxythymidine triphosphate. So if we had dideoxythymidine triphosphate in this sample and it's elongating, then when the polymerase reaches this point, there's a possibility that it will incorporate the dideoxynucleoside triphosphate. And if this is a dideoxynucleoside triphosphate, then there won't be a three prime hydroxyl.

    And DNA polymerase will just be like, oh, I can't go on! Because it's not going to have a three prime hydroxyl. So it's not going to be able to continue with the next nucleotide. So this is known as chain termination.

    So let me take you through an example, here. Está bien. So here's an example that you have a slide of. And again, there's a template strand, which is the top strand. And this method requires that you have a primer. And what's often done is you label the primer.

    So the first step is you have to denature your DNA. So you have to go from double stranded DNA to a single stranded DNA. And then you mix the double stranded DNA with first, this labeled primer, such that the primer can then yield to the single stranded DNA. You need DNA polymerase, as I've mentioned. And as, I believe, Rachel mentioned before, you need the building blocks of DNA. So you need the four dideoxynucleoside triphosphates.

    So you always have the four dideoxynucleotide triphosphates. But what's special here is you're going to spike several reactions with one of the dideoxynucleoside triphosphates. So you spike the reaction with a tiny amount of one of your dideoxynucleoside triphosphates.

    So let's say you have a reaction, here. And this this one here has dideoxyadenosine triphosphate. Then polymerase will along get this strand until there's a thymidine on the template. And then there's a possibility that it will incorporate this dideoxy NTP. And if it does, then you get chain termination. And you get a fragment of this length.

    But the other possibility, because there is still the deoxy form of the NTP present, it's possible that it incorporates a deoxyadenosine triphosphate there. And keeps going, and then incorporates a dideoxy ATP later on, where you have another T. And so the polymerase will essentially randomly stop at these different thymidine residues, depending on whether or not a dideoxynucleoside triphosphate is incorporated. And that means for a given reaction, one in which you have dideoxy ATP, you get a certain pattern of bands that represent the length of fragments, where you have, in this case, a thymidine base.

    And then you do this for all four bases, where you have four reactions, each with a different base that's dideoxy. So when you're adding these, you're going to do four reactions, one with dideoxy ATP spiked in, one with dideoxy TTP, one with dideoxy CTP, and the last with dideoxy GTP. And because these nucleotides are present in different positions along the sequence, you're going to get distinct banding pattern for each of these reactions. But using that banding pattern, you can then read off the sequence of DNA that's present on the template strand.

    So this is how sequencing was done for many, many years. These days, it's been made cheaper and faster. And now what's often used is next generation sequencing. And one the pain in the ass about sequencing before is you'd use a lot of radioactivity. Your primer would be radioactive, so that you could detect these bands. Right now, everything's done using fluorescence, which makes it much nicer, I think.

    And so in next generation sequencing, your template DNA is attached to a solid substrate, such that it's immobilized on some type of substrate. And then you add each of the four nucleoside triphosphates. In this case, they're labeled with a dye, such that each one is a different color. But the dye also functions to prevent elongation, such that, again, it's this chain termination. When you incorporate one of these, the polymerase just can't run along the DNA. It incorporates one and then stops.

    So if you get your first nucleotide incorporated, it will incorporate one of these four. And it will be fluorescent at a certain wavelength, which you can see using a device or microscope. And then what you then do is chemically modify this base, such that you remove the dye and allow it to extend one more base pair. And so you go one nucleotide at a time. And you read out the pattern of fluorescence that appears. And that gives you the sequence of DNA on this molecule that's stuck to your substrate.

    And you can do this in parallel. You can have tons, many different strands of DNA. And you can be reading out the sequence of each one of these strands in parallel.

    Excelente. Any questions about DNA sequencing? está bien. Muy bien. I will see you on Monday. Have a great weekend.


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