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¿Número mínimo de ciclos para una cuantificación eficaz de qPCR?

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He tenido un problema aparente con la contaminación del ADNg en mis controles sin transcriptasa inversa (NRT) por la aparición de picos de fluorescencia en mis datos de qPCR.

Tengo / estoy probando múltiples tratamientos con DNasa (Turbo DNase, Life Technologies) y limpieza de ARN (Qiagen, RNeasy). El factor limitante que me preocupa es que voy a destruir todo mi ARNm disponible con múltiples tratamientos / limpiezas.

Mi pregunta es: ¿puedo reducir la cantidad de ciclos que utilizo para medir la fluorescencia? ¿Hay algún aspecto que saldrá mal (en términos del experimento en sí para el análisis de datos) si, digamos, bajo el número de ciclos a 25-30? Todas mis contaminaciones comienzan a aparecer dentro del rango de aproximadamente 30 ciclos y más (según lo determinado por los valores de Ct).

¡Por favor, avíseme si necesita cualquier otra información que pueda ayudar a obtener una respuesta!

Mejor


Una guía para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)

qPCR & # 8211 también conocido como reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real & # 8211 es actualmente el estándar de oro para la detección y cuantificación de ARN en una pequeña cantidad de tejidos. Sin embargo, la técnica en sí depende de una serie de factores. Permítanos echarle un vistazo a algunos consejos y trucos para aumentar sus posibilidades de éxito.

Esta pieza original fue escrita en colaboración con The Addictive Brain, una iniciativa de comunicación científica. ¡Estamos encantados de presentar los consejos y trucos personales de Chinmaya & # 8217 basados ​​en la experiencia de primera mano al ejecutar innumerables reacciones de PCR y qPCR!


Abstracto

Este estudio tuvo como objetivo seleccionar y validar diferentes estrategias metodológicas para cuantificar la expresión de los genes de virulencia. ascC y ascV por qPCR en Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida (Aer. salmonicida).

Métodos y resultados

Utilizando los algoritmos geNorm, Normfinder y BestKeeper, se seleccionaron genes de referencia para qPCR en función de su in vitro estabilidades de expresión en tres Aer. salmonicida son. La eficiencia de amplificación de genes se calculó mediante los programas Real-time PCR Miner y LinReg PCR, que no se han utilizado previamente en el análisis de la expresión génica bacteriana. La expresión del ascC y ascV genes de virulencia en un virulento Aer. salmonicida La cepa se evaluó mediante tres modelos de cuantificación, incluidos los genes de referencia únicos (menos o más estables) o los tres más estables, combinados con una eficiencia de amplificación de genes constante o específica. Los genes de referencia más estables fueron gyrB, proC y rpoC, tiempo rpoD y fabuloso eran los menos estables. Los modelos de cuantificación mostraron diferentes patrones de expresión.

Conclusiones

La estrategia óptima para cuantificar la expresión de ARNm fue utilizar una combinación de los tres algoritmos y el modelo de cuantificación que incluye los tres genes de referencia más estables. PCR Miner en tiempo real o LinReg PCR fueron herramientas valiosas para estimar la eficiencia de amplificación.

Importancia e impacto del estudio

Los métodos utilizados en este estudio proporcionaron datos de expresión más fiables utilizando qPCR que los métodos publicados anteriormente. La dinámica de cuantificación y expresión de los genes de virulencia contribuirá a una mejor comprensión de cómo Aer. salmonicida interactúa con su huésped y el medio ambiente y, por tanto, con la prevención de epizootias debidas a este patógeno.


Resultados

TaqMan®, UPLs®, la estrategia basada en la cola dan resultados comparables en ddPCR

Primero determinamos si Universal Probe Technologies (UPL ®, Roche) funcionaba de manera comparable a las sondas de hidrólisis 5 ′ tradicionales (Taqman ®) en una configuración ddPCR. Utilizando dos genes, comparamos, con dilución de entradas de cDNA, el nivel de detección en ddPCR (Figura SI, SII). La primera comparación se realizó entre las sondas TaqMan® y UPL® (Figura SI) con cebadores que detectan los exones 7 y 8 de hTERT (transcriptasa inversa de telomerasa humana, NCBI Gene ID: 7015) a partir de ADNc. En nuestros experimentos, las sondas universales fueron tan efectivas como las sondas de hidrólisis 5 'tradicionales, como lo demuestra la fuerte correlación asociada (bondad de ajuste) encontrada entre las regresiones lineales (R 2 = 0,9999 p & lt 0,0001).

Para confirmar aún más que las sondas de Roche (oligómeros de ADN de 8 a 9 modificados con LNA de Universal Probes Library®) funcionan en la PCR digital de gotitas, realizamos una prueba adicional en un gen de referencia común, HPRT (hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa, NCBI Gene ID: 3251). Como prueba de principio, probamos una estrategia de 5 ′ de cola o "sonda universal" (denominada gota de PCR-Tail digital o ddPCR-Tail) 19. En esta estrategia, la secuencia complementaria a una secuencia de sonda universal (Roche Universal Probes®) se agrega al extremo 5 'del cebador directo (descrito en la Fig. 1 y SII). En esta situación, se puede cuantificar con precisión el material de entrada (es decir, la cuantificación de la biblioteca para el nivel de NGS o ARNm) sin conocer la secuencia entre los cebadores directo e inverso. Para validar este concepto, primero probamos la estrategia "ddPCR-Tail" en un sistema de cuantificación simple (es decir, expresión génica: un producto de amplificación). Utilizamos cebadores de genes de referencia para HPRT con una biblioteca de sonda universal interna nº 22 (UPL nº 22) a los cebadores y una sonda de cola 5 'de secuencia única (UPL nº 52). Usamos diluciones seriadas de ADNc a partir de ARN total para determinar si la cola y la estrategia de la sonda interna dieron valores de concentración similares. Observamos una fuerte correlación entre las dos técnicas, como lo revelan las dos curvas de regresión lineal (bondad de ajuste R 2 = 0,9923, p & lt 0,0001), lo que indica una detección similar entre las diferentes estrategias (TaqMan ®, UPL internas y con cola ®) ( Figura SII).

La titulación de bibliotecas NGS con ddPCR-Tail proporciona recuentos absolutos de moléculas de entrada

Aplicamos la estrategia ddPCR-Tail a la cuantificación de NGS agregando una secuencia 5 'al cebador universal PE 1.0 (Illumina) y comparamos el método ddPCR-Tail con las otras técnicas utilizadas para la cuantificación de la biblioteca de ADN de NGS. La misma muestra se cuantificó (con 6 índices diferentes) con kits comerciales utilizando QuBit, qPCR, ddPCR y ddPCR-Tail (Fig. 2). Las molaridades se calcularon de acuerdo con la tecnología respectiva y se corrigieron con una curva estándar cuando fue necesario (por ejemplo, KapaBiosystem para qPCR). Todos los métodos de cuantificación estimaron con éxito las bibliotecas en el mismo rango de concentración (50–250 nM). Para un índice (ATTCCT), la molaridad fue diferente con el kit ddPCR (465 nM), un valor atípico que potencialmente revela una incompatibilidad entre las sondas utilizadas en ese kit y esa secuencia de índice en particular. Sin embargo, tomadas por separado, todas las mediciones de bibliotecas indexadas son significativamente diferentes al comparar cada método (Fig. 2c). De hecho, los valores de p ajustados calculados utilizando la prueba de comparación múltiple de Sidak (alfa = 0,05) revelaron valores de p por debajo de 0,0001 con una excepción (GATCAG: ddPCR-Tail vs valor de p ajustado de qPCR = 0,0956). Por lo tanto, solo el resultado del resultado de la secuenciación determinará claramente qué método de cuantificación fue el más confiable. El uso de ddPCR o ddPCR-Tail no requiere el cálculo inverso de la biblioteca frente a un tamaño medio determinado por un ensayo Bioanalyzer (Fig. 2b), lo que hace que las cuantificaciones basadas en ddPCR requieran menos tiempo y menos reactivo. La cuantificación con QuBit o qPCR requiere equipo adicional para determinar la molaridad de las bibliotecas con cálculos adicionales. qPCR y QuBit dan medidas relativas mientras que ddPCR son absolutas.

(a) Diagrama del diseño experimental de secuenciación de próxima generación (NGS). Utilizando cuatro métodos de cuantificación, titulamos bibliotecas de ADN preparadas a partir de células HeLa, siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se agregaron seis índices diferentes en el paso de amplificación. De los ocho carriles de la celda de flujo NGS, se utilizaron cuatro carriles para comparar cada método (carril de índice único) y cuatro carriles para la precisión de agrupación (conjunto de seis índices por carril). (B) Imagen del bioanalizador de las bibliotecas, que muestra un frotis homogéneo de ADN de 280 a 450 pb. Los seis índices muestran tamaños promedio similares. (C) Resultado de la cuantificación para todos los índices utilizando enfoques QuBit, qPCR, ddPCR y ddPCR-Tail, respectivamente. Todas las cuantificaciones (excepto ddPCR-Tail) se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante (Invitrogen, BioRad y KapaBiosystem). La estrategia ddPCR-Tail utilizó el mismo aparato que el ddPCR con ligeras modificaciones (cebadores 50 nM de hibridación por PCR de tres pasos a 65 ° C durante 30 segundos, tiempo de extensión de 30 segundos a 72 ° C). Experimentos realizados por triplicado, media calculada mediante curva de dilución (promedio de 12 valores por cuantificación, 6 para QuBit). Se muestra la media ± DE.

DdPCR-Tail proporciona una valoración sensible y confiable para NGS

Usando cuatro carriles de un experimento de secuenciación Paired-End (PE-Seq), agrupamos los 6 índices basados ​​en el método de titulación utilizado y los secuenciamos (PE-100nt, HiSeq2500 Illumina). Nuestro propósito era comparar diferentes métodos de titulación, por lo que el enfoque se dirigió hacia la calidad y la distribución de las lecturas en lugar de las secuencias reales contenidas en las lecturas (Fig. 3, SIII). Primero examinamos los datos de FastQ utilizando puntuaciones Q. La puntuación Q es un valor que indica la probabilidad de que una base (nucleótido) se llame incorrectamente. Se dan puntuaciones Q a cada nucleótido de la lectura (el cálculo se realiza mediante un algoritmo similar a phred, similar al desarrollado originalmente para los experimentos de secuenciación de Sanger) 20 . A nivel mundial, una puntuación Q de 20 representa una tasa de error de 1 en 100, con una precisión de llamada correspondiente del 99%. En PE-seq, una puntuación Q es "buena" cuando está por encima de 34 (tasa de error de aproximadamente 1 en 2500 99,96% de precisión). En estos experimentos, observamos que QuBit y ddPCR-Tail dieron puntuaciones Q ligeramente mejores (ANOVA unidireccional p & lt 0.0001 sin diferencias significativas solo entre QuBit y ddPCR-Tail usando la corrección para comparaciones múltiples) con un promedio de 34 y respectivamente. desviación estándar (DE) de ± 0,15 y ± 0,13. En comparación, ddPCR y qPCR promedian una puntuación Q de 33 (precisión del 99,95%), con valores de SD de ± 0,17 y ± 0,15, respectivamente (Fig. 3a). Sin embargo, el valor de la puntuación Q está incompleto sin considerar el número total de lecturas (Fig. 3b). Los métodos DdPCR y qPCR produjeron más lecturas (media ± SD ddPCR = 414 ± 2,42 y qPCR = 402 ± 27 millones de lecturas PF, es decir, lecturas que pasaron el filtro de illumina), lo que sugiere una posible sobrecarga del carril que dificulta la separación de grupos y, por lo tanto, una Q más baja puntaje. Esto podría explicarse por una subestimación de la concentración de las bibliotecas, una consecuencia de los fallos de amplificación de la PCR o problemas relacionados con la sonda / enzima que favorecen secuencias específicas en ambos ensayos de titulación.

(a) Tabla de los puntajes de calidad promedio (Q) de los cuatro carriles separados (informados como carga única) y los seis índices agrupados en los cuatro métodos de titulación (todos de la lectura 1 total de 7 puntajes Q promedio para cada titulación). Los puntajes de calidad son bastante buenos (siendo 34 el estándar de oro para los resultados de QE), con resultados mejores que óptimos de las estrategias QuBit y ddPCR-Tail (media ± SD, QuBit = 34.23 ± 0.15 ddPCR-Tail = 34.18 ± 0.13). (B) El número total de lecturas (lecturas PF) disponibles a partir de los resultados de la secuenciación (del experimento no agrupado y agrupado), es decir, representa el número de lecturas que pasan el control básico y se identifican como grupos únicos. Para cada ensayo, las lecturas no indexadas representan menos del 2% (qPCR = 1,55%, QuBIT = 1,54%, ddPCR = 1,32%, ddPCR-Tail = 1,49% respectivamente). Todos los métodos dieron más de 350 millones de lecturas: qPCR y ddPCR (402, 414) QuBit y ddPCR-Tail (357, 372). La media ± DE se muestra calculada a partir de experimentos duplicados. (C) Se muestra la representación del índice promedio Media ± DE. (D) La distribución específica de los seis índices dentro de los cuatro carriles diferentes, a partir de los cuatro métodos de titulación diferentes.

A continuación, utilizando nuestro enfoque indexado, evaluamos la reproducibilidad de los métodos de titulación independientemente de la secuencia de indexación, ya que todas las bibliotecas son idénticas (de la misma preparación exacta) y representan réplicas técnicas. Idealmente, una técnica confiable y sensible permitirá la indexación de múltiples muestras de manera homogénea (proporciones iguales). El equilibrio óptimo de las bibliotecas indexadas daría como resultado una

16% por biblioteca indexada (aproximadamente una sexta parte del 100%). QuBit y ddPCR-Tail proporcionaron los resultados más estables (Fig.3c), con la menor cantidad de variabilidad entre las medidas en relación con una menor variación entre las bibliotecas indexadas de ADN (informado por una desviación estándar más baja, respectivamente, ddPCR-Tail SD ± 3,1 QuBit SD ± 1,9 qPCR SD ± 7,2 y ddPCR SD ± 8,9). Sin embargo, al representar los datos para apreciar el verdadero reparto entre las secuencias de índices (Fig. 3d), observamos que algunos índices están muy sobrerrepresentados. Por ejemplo, el índice ATTCCT está sobrerrepresentado con la titulación de qPCR, mientras que está casi completamente ausente con la titulación de ddPCR. Estas disparidades podrían estar relacionadas con un problema con la secuencia del índice en sí o con una falla parcial de la titulación. Los ensayos ddPCR-Tail y QuBit lograron los mejores resultados con respecto al equilibrio del índice, lo que permite multiplexar experimentos de secuenciación de una manera precisa y equilibrada. Por lo tanto, esto puede reducir el sesgo y minimizar potencialmente el costo de secuenciación por muestra al cargar más bibliotecas indexadas en el mismo carril con la confianza de que cada biblioteca se secuenciará por igual.

Para evaluar la sensibilidad del método ddPCR-Tail, cuantificamos algunas bibliotecas de NGS desafiantes con bajas cantidades de ADN, amplia heterogeneidad en los tamaños de ADN y trazas de dímeros de cebadores. Comparamos los resultados con el método de cuantificación más utilizado, qPCR. Analizamos bibliotecas complejas preparadas para la secuenciación de Hi-C (Fig. 4a, b), una técnica basada en NGS para investigar la estructura de la cromatina en todo el genoma 21,22. Debido a los numerosos pasos enzimáticos necesarios para el ensayo, la cantidad de ADN preparado es limitante. Uno debe tener un medio muy sensible para cuantificar la biblioteca antes de NGS para reducir el sesgo de PCR [18]. En este caso, una biblioteca deficiente resultará no solo en menos lecturas, sino también en una falta de secuencias representativas. Las ligaduras raras pueden pasarse por alto y los niveles relativos de interacciones pueden distorsionarse debido al sesgo introducido durante la amplificación por PCR [18]. El método ddPCR-Tail proporcionó resultados de cuantificación equivalentes a los calculados a partir del método qPCR en 4 de 6 bibliotecas (Fig.4a NGS-2, p = 0,99 NGS-3, p = 0,99 NGS-4, p = 0,94 NGS- 6, p = 0,99 respectivamente, valores de p ajustados calculados utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Sidak (alfa = 0,05). Esto complementa nuestra observación anterior de que ddPCR-Tail es tan confiable como qPCR para la cuantificación del ADN.

(a) Comparación de dos métodos para bibliotecas de NGS de baja abundancia, resultados de titulación utilizando qPCR y el sistema ddPCR-Tail. Ensayo realizado por triplicado y media calculada mediante factores de corrección de dilución (promedio de 18 valores por muestra). Se muestra la media ± DE. (B) Resultados de la imagen del bioanalizador utilizados para calcular la molaridad final para la medición de qPCR, algoritmo proporcionado por KapaBiosystem utilizando el tamaño medio de la biblioteca NGS combinado con la curva estándar de qPCR. (C) Todas las bibliotecas se cuantificaron con éxito con alta confianza (regresión lineal en 0,9), la estrategia ddPCR Tail mostró una mejor linealidad general independientemente de la heterogeneidad de las bibliotecas.

Finalmente, abordamos la estabilidad de la técnica en bibliotecas heterogéneas de Hi-C (Fig. 4c). DdPCR-Tail proporciona mejores correlaciones de regresión lineal (prueba T de Student p = 0,04 Fig. 4c) y desviaciones estándar más pequeñas en comparación con qPCR (Fig. 4a NGS-1 y NGS-5). Dos posibles fuentes de error que podrían explicar las grandes desviaciones estándar observadas en NGS-1 y NGS-5 incluyen variaciones intra-experimento (es decir, actividad enzimática) y variabilidad técnica (pipeteo).

Sin embargo, para minimizar la variabilidad inducida por la técnica y aumentar la fuerza del análisis estadístico, realizamos el ensayo por triplicado o triplicado (triplicado de cada punto de dilución, en 3 ensayos diferentes para un total de 18 valores por muestra como mínimo), la cuantificación de las dos bibliotecas es estadísticamente diferente y más variable en comparación con el resultado proporcionado por ddPCR-Tail (Fig.4a Valor p ajustado de NGS-1 & lt 0,0001 Valor p ajustado de NGS-5 p & lt 0,0001, prueba de comparaciones múltiples de Sidak). DdPCR-Tail proporciona cuantificaciones que son más reproducibles en comparación con qPCR, como muestran las seis titulaciones de bibliotecas de HiC diferentes. Dado que ddPCR-Tail es extremadamente sensible, como lo demuestra la gran dilución utilizada para cuantificar las bibliotecas, se podría aplicar este método para valorar las bibliotecas con una amplificación mínima por PCR: moviendo la limitación del material de ADN necesario para los experimentos de NGS hacia la capacidad del secuenciador .


2. Consideraciones conceptuales

2.1 Sensibilidad analítica se refiere al número mínimo de copias en una muestra que se puede medir con precisión con un ensayo, mientras que sensibilidad clínica es el porcentaje de individuos con un trastorno dado que el ensayo identifica como positivos para esa condición. Normalmente, la sensibilidad se expresa como límite de detección (LOD), que es la concentración que se puede detectar con una certeza razonable (se usa comúnmente una probabilidad del 95%) con un procedimiento analítico dado. El LOD más sensible teóricamente posible es 3 copias por PCR (28), asumiendo una distribución de Poisson, una probabilidad del 95% de incluir al menos 1 copia en la PCR y detección de una sola copia. Los procedimientos experimentales suelen incluir pasos de procesamiento de muestras (es decir, extracción) y, cuando sea necesario, transcripción inversa. Si se tienen en cuenta los cambios de volumen y las eficiencias de estos pasos, el LOD más sensible teóricamente posible se puede expresar en unidades relevantes para el experimento, como copias por nanogramo de tejido. Los resultados experimentales inferiores al LOD teóricamente posible nunca deben informarse. También se deduce que los resultados de "0" no tienen sentido y son engañosos. Las estimaciones de LOD en los análisis de qPCR se complican por la naturaleza logarítmica de Cq, porque Cq no está definido cuando la concentración de la plantilla es cero. La determinación y el modelado apropiados del LOD en la qPCR es el foco de la investigación continua (26).

2.2 Especificidad analítica se refiere al ensayo de qPCR que detecta la secuencia diana apropiada en lugar de otras dianas no específicas también presentes en una muestra. Especificidad diagnóstica es el porcentaje de individuos sin una afección determinada que el ensayo identifica como negativos para esa afección.

2.3 Precisión se refiere a la diferencia entre las concentraciones medidas experimentalmente y las reales, presentada como cambios de veces o estimaciones del número de copias.

2.4 Repetibilidad (precisión a corto plazo o varianza intraensayo) se refiere a la precisión y solidez del ensayo con las mismas muestras analizadas repetidamente en el mismo ensayo. Puede expresarse como SD para Cq diferencia. Alternativamente, se puede usar la SD o el CV para el número de copias o la variación de la concentración. Los CV no deben usarse con Cqs, sin embargo (29).

2.5 Reproducibilidad (precisión a largo plazo o variación entre ensayos) se refiere a la variación en los resultados entre ejecuciones o entre diferentes laboratorios y se expresa típicamente como la DE o CV de los números de copias o concentraciones. Cq Los valores generados a partir de diferentes ejecuciones están sujetos a una variación inherente entre ejecuciones (30), por lo que se informan entre ejecuciones Cq la variación no es apropiada.

Las publicaciones que describen las concentraciones de ARNm para los genes diana deben dejar claro con precisión cuáles son las dianas. Las transcripciones de la mayoría de los genes humanos y muchos genes en otros organismos multicelulares se empalman alternativamente (31) (32), y estas variantes de empalme especifican isoformas de proteínas alternativas, con variación en los patrones de empalme informados en diferentes tejidos o en diferentes etapas de desarrollo. En consecuencia, los ensayos RT-qPCR basados ​​en un solo exón pueden detectar una serie de variantes de corte y empalme, mientras que los cebadores que abarcan intrones pueden ser más selectivos pero pueden pasar por alto algunas variantes de empalme por completo. Más recientemente, se han descrito genes autosómicos no impresos que muestran un desequilibrio alélico en su expresión (33). Tomados en conjunto, estos hallazgos implican que el uso de un ensayo de RT-qPCR que simplemente se dirige a uno o como máximo 2 exones de un ARNm ya no es suficiente para describir el nivel de expresión de un gen en particular. En consecuencia, la información de la secuencia para los cebadores debe proporcionarse junto con una evaluación de su especificidad con respecto a las variantes de corte y empalme conocidas y las posiciones de polimorfismo de un solo nucleótido documentadas en bases de datos de transcripción y polimorfismo de un solo nucleótido. Para los conjuntos de cebadores seleccionados de la base de datos RTprimerDB (34) (35), esto se hace fácilmente consultando el sitio web de RTprimerDB (http://www.rtprimerdb.org), que contiene toda la información relevante. Para los ensayos comerciales, se requiere la información del lote y los criterios de validación experimental de los proveedores. Se desaconseja enfáticamente la notificación de resultados de ensayos comerciales no validados y de ensayos que hayan sido validados solo in silico.

Debe recordarse que la detección de la presencia de un ARNm no proporciona información sobre si ese ARNm se traducirá en una proteína o, de hecho, si una proteína funcional se traduce en absoluto.

La inmunohistoquímica, la transferencia Western u otros métodos de cuantificación de proteínas no siempre pueden corroborar los datos cuantitativos del ARNm celular. Ahora está bien establecido que con frecuencia existe una falta de concordancia entre los datos de concentración de ARNm y de proteína (36), lo que es particularmente cierto para los ARNm que especifican proteínas que forman parte de complejos de proteínas multifunción (37). Finalmente, ha quedado claro que el conocimiento de la presencia y función de microARN específicos es tan importante para comprender la expresión génica como poder cuantificar las especies de ARNm (38).

También es necesario tener en cuenta que la mayoría de los datos cuantitativos de ARN no son absolutos, sino relativos. Por lo tanto, los genes o materiales de referencia utilizados para la estandarización son críticos, y cualquier evaluación de la validez de un experimento RT-qPCR también debe considerar la idoneidad de la referencia de cuantificación relativa. Por lo tanto, el desarrollo de materiales de calibración de ADN y ARN de referencia universal, aunque es muy útil (39) (40), no será una panacea universal (41) (42).

Gran parte de la variación en los valores de expresión informados producidos en los experimentos de RT-qPCR no se debe simplemente a la variación en los protocolos experimentales, sino que está causada por correcciones aplicadas por varios algoritmos de procesamiento de datos, cada uno de los cuales hace sus propias suposiciones sobre los datos. En consecuencia, aunque la qPCR se ha proclamado con frecuencia como una piedra de toque o un estándar de oro, en la práctica este “estándar” es variable, y el informe de los resultados requiere una considerable sofisticación de análisis e interpretación (43).


Método PMA-qPCR modificado para la cuantificación rápida de viables Lactobacillus spp. en Productos Lácteos Fermentados

La cuantificación de bacterias de ácido láctico viables es un índice de calidad importante de los productos lácteos fermentados, pero el método de detección actual, que es el recuento en placa, requiere mucho tiempo. Este estudio describe un ensayo de PMA-qPCR modificado que permite la detección y enumeración de viables totales Lactobacillus spp. en productos lácteos fermentados comerciales. Aquí, se diseñó un nuevo par de cebadores específicos de género y sondas de unión de surcos menores basándose en las secuencias del gen de ARNr 16S de 24 cepas de referencia, 13 de las cuales eran de diferentes Lactobacillus especies comúnmente utilizadas en productos lácteos fermentados comerciales. Posteriormente, en comparación con el método de destrucción por calor, se eligió el método de homogeneización de 20 ciclos para la optimización inicial de PMA-qPCR. Se prepararon curvas estándar y la eficiencia obtenida fue del 97% (R 2 = 0,992), lo que demuestra que este método PMA-qPCR era factible y eficaz. Además, el viable Lactobacillus spp. el rango de detección fue de 10 3 –10 9 UFC / mL, que cumple con los requisitos de detección en productos lácteos fermentados. Además, el número total de viables Lactobacillus spp. en seis productos lácteos fermentados comerciales diferentes se estimó mediante tres métodos individuales (recuento en placa en agar MRS, qPCR y PMA-qPCR). La comparación de los resultados obtenidos por PMA-qPCR y los recuentos en placa fue similar, y ambos disminuyeron en consecuencia, mostrando una buena correlación con la disminución de la vitalidad de la cepa, 30 días después de la fecha de vencimiento. El procedimiento PMA-qPCR establecido en este trabajo permite la cuantificación de viables Lactobacillus spp. en aproximadamente 3 h, mejorando enormemente la eficiencia de detección y tiene amplias perspectivas de aplicación en la prueba de productos lácteos fermentados.

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Optimización del recocido de la imprimación

En este paso, la temperatura de reacción se reduce para permitir la unión de los cebadores al ADN diana. A menudo, un tiempo de incubación de 0,5 a 2 minutos es suficiente para el recocido del cebador. La temperatura de recocido se determina calculando la temperatura de fusión (Tmetro) de los cebadores seleccionados para la amplificación por PCR. Una regla general es comenzar con una temperatura de recocido 3-5 ° C más baja que la T más bajametro de los cebadores.

Tmetro se define como la temperatura a la que el 50% del cebador y su secuencia complementaria forman un dúplex, y se puede calcular de varias formas. El método más simple para estimar el cebador Tmetro es por el número de nucleótidos presentes en el oligo de ADN, utilizando la fórmula:

Dado que la concentración de sal (Na +) de la reacción afecta el recocido del cebador, Tmetro se puede calcular con mayor precisión con la fórmula:

Tmetro = 81,5 + 16,6 (log [Na +]) + 0,41 (% GC) - 675 / longitud del cebador

Usando la estabilidad termodinámica de cada par de dinucleótidos adyacentes del oligo, en combinación con concentraciones de sales y cebadores, Tmetro también se puede calcular con un método llamado método del vecino más cercano [1,2]. Este método también es la base de nuestra herramienta en línea para determinar las temperaturas de hibridación del cebador recomendadas para ADN polimerasas específicas.

Una consideración importante en Tmetro el cálculo es el uso de aditivos de PCR, codisolventes y nucleótidos modificados. La presencia de estos reactivos reduce la Tmetro del complejo cebador-molde. Por ejemplo, DMSO al 10% puede disminuir la temperatura de recocido entre 5,5 y 6,0 ° C [3]. Asimismo, la sustitución de dGTP con 7-deaza-dGTP en PCR también disminuirá la Tmetro. En estos casos, la temperatura de recocido debe ajustarse en consecuencia.

Tenga en cuenta que la T calculadametro El valor se entiende como una temperatura de referencia inicial para el recocido del cebador. La temperatura de recocido puede necesitar una mayor optimización, dependiendo de los resultados de la amplificación. Por ejemplo, si los resultados son nulos o con baja amplificación, la temperatura de recocido puede reducirse en incrementos de 2-3 ° C durante la optimización. Sin embargo, si aparecen productos de PCR inespecíficos, la temperatura de hibridación se puede elevar en incrementos de 2-3 ° C (hasta la temperatura de extensión) para mejorar la especificidad (Figura 4).

Figura 4. Resultados de la amplificación por PCR asociados con diferentes temperaturas de hibridación. La temperatura de hibridación calculada del juego de cebadores en este experimento es de 54 ° C.

Para ayudar a minimizar este paso de optimización y ahorrar tiempo, el tampón de reacción de algunas ADN polimerasas está diseñado con componentes isestabilizantes. Esta formulación especial aumenta la estabilidad de los dúplex cebador-molde durante el paso de hibridación, mejorando así el rendimiento y aumentando la especificidad de la PCR. Además, el tampón permite el apareamiento de cebador-molde de PCR a una temperatura universal (p. Ej., 60 ° C), incluso con cebadores de diferentes temperaturas de fusión.

Video: vea los beneficios de una temperatura de recocido universal para PCR

Conozca la importancia del paso de hibridación en la PCR, cómo sortear los pasos de optimización utilizando un tampón de PCR especialmente formulado y los beneficios de una temperatura de hibridación universal habilitada por el tampón.

Para optimizar las temperaturas de recocido, los bloques de termociclador de gradiente son opciones populares, donde las temperaturas más alta y más baja se establecen en todo el bloque para que las variaciones de temperatura se puedan evaluar en una serie de pozos o reacciones al mismo tiempo. En la práctica, es difícil lograr un verdadero gradiente con un control preciso de la temperatura de los pozos y se recomiendan bloques "mejores que los gradientes" con unidades de calentamiento / enfriamiento separadas para un control preciso de la temperatura sobre la optimización de la PCR (Figura 5). (Obtenga más información: Consideraciones sobre el termociclador).

Figura 5. Comparación de temperaturas de bloque de termocicladores que utilizan tecnologías de gradiente "mejor que gradiente" frente a tecnologías de gradiente estándar.


5. CONCLUSIÓN

Es probable que las decisiones de gestión se tomen cada vez más utilizando los resultados de las encuestas de eDNA, por lo que los datos generados por los estudios de eDNA deben ser confiables, defendibles y ejecutados con estándares de garantía de alta calidad. El desarrollo, las pruebas y la validación de ensayos de ADN ambiental son pasos críticos en el proceso, y se necesitan definiciones claras del rendimiento del ensayo en la comunidad de ADN electrónico. Informar las métricas de rendimiento de la calidad del ensayo en condiciones ideales con concentraciones conocidas es un primer paso en cualquier estudio de eDNA y debe ir seguido de una demostración adicional del ensayo utilizando muestras de campo. Comprender los límites de los ensayos proporciona una base sólida sobre la que construir el resto de los protocolos de encuestas de eDNA. Describimos un conjunto coherente de definiciones y métodos de determinación que se pueden aplicar a los estudios de eDNA, y las definiciones y enfoques, a su vez, guían la interpretación y el uso de estas métricas. Los informes claros de estas y otras métricas de rendimiento de qPCR facilitan la evaluación y comparación de los datos de qPCR entre estudios y proporcionan a los administradores de recursos una base sólida para la toma de decisiones.


Un enfoque de simulación para evaluar el número mínimo de réplicas de PCR en tiempo real para la cuantificación de GM

La cuantificación de ingredientes genéticamente modificados (GM) en alimentos y piensos generalmente utiliza PCR cuantitativa en tiempo real (RT-QPCR). En los últimos años, una multitud de nuevos ensayos RT-QPCR han facilitado un mayor rendimiento del método. El nivel de replicación de la muestra dentro de estos ensayos es un aspecto fundamental que debe tenerse en cuenta para producir resultados con alta confianza. En este artículo describimos el uso de un enfoque de modelado aplicado a conjuntos de datos de GM y RT-QPCR, para evaluar objetivamente el efecto de diferentes niveles de replicación de PCR en términos de la variabilidad asociada con un resultado, y demostrar que es posible utilice un nivel reducido de replicación sin una reducción posterior en la confianza de un resultado. Utilizando un conjunto de datos de ejemplo, mostramos que es posible reducir el nivel de replicación de la muestra de seis a tres réplicas de PCR, sin un cambio significativo en el valor medio del resultado. El uso de tal enfoque puede facilitar el uso del número mínimo de réplicas para producir un resultado preciso, ahorrando así importantes recursos involucrados en los ensayos de cuantificación.

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Archivos de datos adicionales

Los siguientes datos adicionales están disponibles con la versión en línea de este documento: una figura que muestra gráficas de estabilidad de expresión de geNorm (archivo de datos adicional 1) una figura que muestra el valor CV medio de miARN en el conjunto de muestra de neuroblastoma (archivo de datos adicional 2) una figura que muestra el cumulative distribution of miRNA CV values (Additional data file 3) a figure showing ChIP-chip results for the miR-17-92 cluster (Additional data file 4) a figure showing ChIP-qPCR results for the miR-17-92 cluster (Additional data file 5) a figure showing ChIP-chip results for the miR-181a-1/miR-181b-1 cluster (Additional data file 6) a figure showing miR-17-92 expression in neuroblastoma cell lines (Additional data file 7) a figure showing overall differential miRNA expression in the neuroblastoma sample set (Additional data file 8) a figure showing fold change expression difference correlation for MYCN downregulated miRNAs (Additional data file 9) a figure showing hierarchical clustering of neuroblastoma cell lines based on miRNA expression (Additional data file 10) a table listing the MIQE checklist (Additional data file 11) a collection of RDML files containing miRNA expression for all data sets (Additional data file 12).


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