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¿Existe alguna alternativa al cribado x-gal blanco / azul para el seguimiento de la actividad beta-galactosidasa de pseudomonas aeruginosa en placa de agar?

¿Existe alguna alternativa al cribado x-gal blanco / azul para el seguimiento de la actividad beta-galactosidasa de pseudomonas aeruginosa en placa de agar?


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Quiero proyectar un pseudomonas aeruginosa biblioteca mutante que lleva un lacZ fusión transcripcional para la desregulación de mutaciones. Traté de hacerlo en placas xgal pero la acumulación del color azul dificulta la proyección. Vi que la gente usa macconkey o medios de endo agar para la detección de beta-gal de dos híbridos en E. coli por ejemplo. Me pregunto si sería algo para probar incluso con pseudomonas (que solo poseería el lacZ gen, así que no permease, etc ...) y si alguien aquí alguna vez lo intentó? ¿O si se pudieran utilizar otros sustratos beta-gal para esta aplicación? gracias Julian


Creo que su problema será aún peor cuando use placas MacConkey o Endo. Puede ver diferencias entre diferentes tipos de bacterias / expresión de ciertas enzimas en esas placas, pero la coloración / decoloración se basa en compuestos solubles que se difunden fácilmente.

La hidrólisis de xgal crea una insoluble producto que se queda más o menos en su colonia. Por supuesto que no es perfecto y después de un tiempo tienes una placa completamente azul, pero esto sucedería mucho más rápido con un compuesto soluble.

Intente ajustar sus condiciones para que pueda mirar la placa antes de que esté completamente azul. Cosas que podrías probar: mira antes, ponlas un poco más diluidas para que las colonias estén más separadas, usa menos xgal para que tu coloración final sea menos intensa, busca algunos papeles que usen xgal para el cribado y roba sus trucos.


Técnicas asépticas de laboratorio: métodos de enchapado

Los microorganismos están presentes en todas las superficies inanimadas creando fuentes ubicuas de posible contaminación en el laboratorio. El éxito experimental se basa en la capacidad de un científico para esterilizar las superficies de trabajo y el equipo, así como para evitar el contacto de los instrumentos y las soluciones estériles con las superficies no estériles. Aquí presentamos los pasos para varios métodos de placas que se utilizan de forma rutinaria en el laboratorio para aislar, propagar o enumerar microorganismos como bacterias y fagos. Los cinco métodos incorporan técnicas asépticas o procedimientos que mantienen la esterilidad de los materiales experimentales. Los procedimientos descritos incluyen (1) cultivo de bacterias en placas en estrías para aislar colonias individuales, (2) en placas de vertido y (3) en placas de extensión para enumerar las colonias bacterianas viables, (4) superposiciones de agar blando para aislar los fagos y enumerar las placas, y ( 5) placa de réplica para transferir células de una placa a otra en un patrón espacial idéntico. Estos procedimientos se pueden realizar en la mesa de laboratorio, siempre que involucren cepas de microorganismos no patógenos (Nivel de Bioseguridad 1, BSL-1). Si trabaja con organismos BSL-2, estas manipulaciones deben realizarse en una cabina de bioseguridad. Consulte la edición más actual del Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos (BMBL) así como Fichas de Datos de Seguridad del Material (MSDS) para Sustancias Infecciosas para determinar la clasificación de riesgo biológico, así como las precauciones de seguridad y las instalaciones de contención requeridas para el microorganismo en cuestión. Las cepas bacterianas y las reservas de fagos se pueden obtener de investigadores de investigación, empresas y colecciones mantenidas por organizaciones particulares como la Colección de cultivo tipo americano (ATCC). Se recomienda que se utilicen cepas no patógenas al aprender los diversos métodos de enchapado. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los estudiantes deberían poder: & # x025cf Realizar procedimientos de enchapado sin contaminar los medios. & # x025cf Aísle colonias de bacterias individuales mediante el método de placas en placas. & # x025cf Utilice métodos de esparcido y esparcido para determinar la concentración de bacterias. & # x025cf Realice superposiciones de agar blando cuando trabaje con fagos. & # x025cf Transfiera células bacterianas de una placa a otra utilizando el procedimiento de placa de réplica. & # x025cf Dada una tarea experimental, seleccione el método de enchapado apropiado.


Introducción

los Burkholderia cepacia El complejo (Bcc) engloba bacterias estrechamente relacionadas genéticamente, actualmente distribuidas en 17 especies con nombres válidos (Vandamme y Dawyndt 2011). Las especies de Bcc portan grandes genomas multirreplicones, lo que les confiere un potencial notable para adaptarse a diversos nichos ecológicos. De hecho, desde la primera descripción ecológica de B. cepacia como patógeno de la cebolla, se han aislado cepas de Bcc de suelos, aguas, rizosferas, pacientes inmunodeprimidos y productos industriales (Burkholder 1950 Mahenthiralingam et al. 2005 Vial et al. 2011). Dos motivos principales de preocupación para los seres humanos son que las especies Bcc pueden ser rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) eficientes, pero también representan una amenaza significativa para la vida de las personas inmunodeprimidas, como las que padecen fibrosis quística (FQ) (Govan et al. 2000). Los tremendos avances en las técnicas de identificación y taxonomía han revelado que los miembros de Bcc se distribuyen amplia pero heterogéneamente según los nichos, algunas especies muestran un potencial de virulencia particularmente alto hacia los pacientes con FQ, mientras que otras actúan como PGPR eficientes (Mahenthiralingam et al. 2008). Aún así, casi todas las especies de Bcc se han aislado de fuentes ambientales y clínicas, lo que sugiere que la adaptación a un nicho específico no está estrictamente vinculada a la afiliación de una especie en particular (Mahenthiralingam et al. 2008 Vial et al. 2011). En consecuencia, como el medio ambiente es aparentemente un reservorio de bacterias potencialmente mortales, no se recomienda el uso comercial de cepas Bcc y, de hecho, se coloca bajo una moratoria impuesta por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) (Chiarini et al.2006).

La detección de quórum (QS) es un sistema de comunicación bacteriano de célula a célula, basado en la liberación de moléculas de señalización en el microambiente cuando la población bacteriana crece, la concentración de moléculas aumenta, alcanzando un umbral que desencadena la regulación de genes diana (Williams 2007 ). El primer sistema QS se descubrió en Vibrio fischeri e implicó a la LuxI sintasa, responsable de la producción de una norte-acilhomoserina lactona (AHL) como molécula señal, que se une a su regulador transcripcional afín LuxR (Engebrecht y Silverman 1984). Desde entonces, se han identificado sistemas QS de tipo LuxRI similares, que se basan en moléculas AHL, en la mayoría de las bacterias gramnegativas. En las especies Bcc, existe un sistema tipo LuxRI llamado CepRI (Lewenza et al. 1999). CepRI confía en norte-octanoilhomoserina lactona (C8-HSL) y norte-hexanoilhomoserina lactona (C6-HSL) como moléculas señal, siendo la primera generalmente la más abundante (Lutter et al. 2001). Se ha descrito que algunos fenotipos, como la producción de sideróforos, las actividades proteolíticas y la formación de biopelículas, se colocan bajo el control de QS en las bacterias Bcc (Eberl 2006). Dado que el QS suele estar implicado en la regulación de los factores de virulencia, la mayoría de los estudios se han centrado principalmente en las bacterias patógenas (Sokol et al. 2007). Sin embargo, QS podría considerarse de manera más general como un medio para que las bacterias perciban e interactúen con sus microambientes (Williams 2007 Mellbye y Schuster 2011). Estudios recientes que implican a los no patógenos Burkholderia cepas han demostrado que QS es importante para las relaciones bacterianas dentro de la rizosfera, para la interacción con plantas y en comunidades polimicrobianas (Chan et al. 2011 Suarez-Moreno et al. 2012).

El Cco Burkholderia ambifaria La especie está mayormente aislada del suelo y es especialmente predominante en la rizosfera de varios cultivos (Coenye et al. 2001 Coenye y Vandamme 2003). El tipo de cepa B. ambifaria Se aisló LMG19182 T (o AMMD) de la rizosfera de guisantes sanos y posteriormente se utilizó como agente de control biológico (Coenye et al. 2001 Chiarini et al. 2006). Esta especie rara vez se aísla de pacientes con FQ, donde causa infecciones transitorias y no transmisibles (Chiarini et al. 2006 Mahenthiralingam et al. 2008). Sin embargo, se demostró que la cepa clínica AU0212 es clonal de AMMD, lo que sugiere que el medio ambiente representa un reservorio de cepas clínicas (Payne et al. 2005). El sistema QS de B. ambifaria no se ha estudiado en detalle. No obstante, se incluyó en algunos estudios que comparan miembros de Bcc, revelando que también posee un sistema CepRI, que se basa en C6-HSL y C8-Moléculas señal HSL (Lutter et al. 2001 Zhou et al. 2003). La actividad proteolítica, la formación de biopelículas y la virulencia hacia los nematodos son fenotipos controlados por QS, pero parecen depender de la cepa (Wopperer et al. 2006). Curiosamente, la producción de moléculas antifúngicas también está controlada por QS en esta especie de Bcc (Zhou et al. 2003 Schmidt et al. 2009). Hemos llevado a cabo un estudio fenotípico y un cribado de mutagénesis de transposón de genoma completo para identificar genes controlados por QS y funciones de una clínica. B. ambifaria cepa que hemos informado anteriormente (Vial et al. 2008, 2010). Este estudio contribuirá al conocimiento de las funciones reguladas por QS en una especie de Bcc poco virulenta y con grandes propiedades biotecnológicas.


Introducción

La adquisición y propagación de resistencia a los antibióticos entre las bacterias patógenas plantea una gran amenaza para la salud pública, especialmente a la luz de la escasez de nuevos antibióticos que se están desarrollando [1]. En consecuencia, existe la necesidad de nuevos antimicrobianos que puedan usarse como alternativas a los antibióticos convencionales. Los péptidos antimicrobianos y las bacteriocinas se consideran alternativas potenciales [2, 3]. Las bacteriocinas son péptidos sintetizados ribosómicamente con actividad antimicrobiana producidos por muchas especies bacterianas. En la mayoría de los casos, las bacteriocinas inhiben el crecimiento de bacterias estrechamente relacionadas, aunque algunas exhiben un amplio espectro inhibidor contra el deterioro de los alimentos y las bacterias patógenas [4]. La gran mayoría de estas moléculas se sintetizan inicialmente intracelularmente como precursores inactivos más grandes, y muchas de ellas se someten además a diferentes modificaciones enzimáticas, como la ciclización, glicosilación y la introducción de lantionina y beta-metil lantionina [5]. Según el último esquema de clasificación, las bacteriocinas se pueden dividir en tres grupos principales [2, 6]. La clase I está representada por péptidos antimicrobianos que han sido modificados enzimáticamente. Clase II, que comprende péptidos no modificados o mínimamente modificados, que se dividen además en varios subgrupos. Clase III, que contienen proteínas antimicrobianas grandes, no modificadas, sensibles al calor, con mecanismo bacteriolítico o algún otro. de acción.

Bacterias del género Bacilo y géneros relacionados producen muchas sustancias con actividad antimicrobiana, incluidos péptidos y lipopéptidos no sintetizados ribosómicamente [7-9], compuestos policétidos [10] y bacteriocinas. En efecto, Bacilo las cepas producen bacteriocinas de las tres clases [11]. Los representantes de la clase I son subtilina, ericina A, ericina S, mersacidina, paenibacilina, sublancina 168 [11, 12], haloduracina, liquenicidina y subtilosina A [13-15]. Bacteriocinas de clase II que se encuentran en Bacilo cepas incluyen coagulina, producida por Bacillus coagulans [16], liquenocina 50.2, producida por B. licheniformis VPS50.2 [17] y otros [18]. En Bacilo, la clase III está representada por proteínas grandes que tienen actividad enzimática, como la familia de bacteriocinas megacina producidas por cepas de Bacillus megaterium [18–20].

Compuestos antagonistas producidos por bacterias del género Brevibacillus También se han estudiado en los últimos años [21] y las cepas de Brevibacillus laterosporus son productores bien conocidos de agentes antibacterianos y antifúngicos [22-24]. Se consideran una herramienta importante para el control biológico debido a sus propiedades biopesticidas contra insectos y nematodos [25, 26]. El recientemente caracterizado Br. laterosporus OSY-I1 produce brevibacilina, un lipopéptido antimicrobiano de 1583 Da con una estructura lineal que contiene 13 aminoácidos y un C6 ácido graso en el N-terminal [27]. La brevibacilina muestra una fuerte actividad antimicrobiana contra algunas bacterias grampositivas patógenas y que estropean los alimentos, en particular las resistentes a la meticilina. Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. El mecanismo de acción de esta molécula se basa muy probablemente en su naturaleza anfifílica y la capacidad de los aminoácidos catiónicos para interactuar con los fosfolípidos cargados negativamente de la membrana celular, provocando la rotura y despolarización de la membrana [27]. Un mecanismo similar se observó en el caso de la paenibacterina, un lipopéptido antimicrobiano de amplio espectro producido por Paenibacillus thiaminolyticus [28]. Además, se encontró que el aislado bacteriano marino Brevibacillus laterosporus PNG-276 mostró actividad antibiótica de amplio espectro (produciendo policétidos las basiliskamidas A y B y péptidos no ribosomales: loloatinas A-D y bogoroles A-E) contra los patógenos humanos MRSA, VRE, Tuberculosis micobacteriana, Candida albicans, y Escherichia coli [29].

Desde la perspectiva de la bacteriocina, la laterosporulina es un ejemplo de una bacteriocina de clase IId producida por la cepa GI-9, identificada preliminarmente como Br. laterosporus [30]. La laterosporulina es activa contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas y se encontró que es resistente a una variedad de enzimas proteolíticas. Los estudios estructurales revelaron que el péptido consiste en una hoja β retorcida e incluye tres enlaces disulfuro [31]. La laterosporulina es relativamente rica en cisteína y aminoácidos polares, lo que es atípico para las bacteriocinas en general, mientras que su estructura mostró similitudes con las defensinas de mamíferos. Más recientemente, laterosporulina 10, producida por la cepa Brevibacillus sp. SKDU10 se caracterizó [32] y, aunque se considera similar, muestra sólo el 57,6% de identidad con laterosporulina. Además, esta nueva bacteriocina tiene un espectro antimicrobiano diferente al de la laterosporulina, ya que la actividad se limita a las bacterias Gram-positivas. Sin embargo, la laterosporulina 10 también ha demostrado ser una nueva molécula anticancerígena prometedora que presenta un efecto citotóxico sobre las células cancerosas [33].

Un numero de Br. laterosporus Se han secuenciado cepas y sus genomas depositados en Genbank. Estos incluyen LMG 15441 (con el número de acceso AFRV00000000, [34]), GI-9 (con los números de acceso CAGD01000001 a CAGD01000061, [35]), B9 (con los números de acceso CP011074-CP011076, [36]), Lak 1210 (con el número de acceso número NDIP00000000, [37]), OSY-I1 (con el número de acceso NOLX00000000, [38]), DSM25 (número de acceso ARFS00000000), ZQ2, UBA5783, DSM25, PE36 (número de acceso NZ_AXBT00000000.1) y Uniss_18.

El estudio actual se centró en el aislamiento de nuevas bacterias cultivables que producen moléculas antimicrobianas naturales eficaces contra patógenos multirresistentes de humanos, animales y plantas, independientemente de su taxonomía. Este enfoque condujo a la caracterización y determinación de la actividad antimicrobiana de tres nuevas cepas aisladas de Br. laterosporus del ensilaje para determinar su potencial como agentes de biocontrol.


Resultados

Selección de bacterias degradantes de AHL

Las 450 cepas estudiadas en este trabajo se aislaron de un criadero de peces en Salobre & # x000f1a (Granada, España) y se eligieron en función de la morfología de las diferentes colonias. Realizamos un cribado inicial de la actividad de degradación de AHL de los aislados en placas de microtitulación de 96 pocillos en presencia de AHL comerciales con cadenas de ácidos grasos de diferentes longitudes (C6-HSL y C10-HSL ver Materiales y Métodos). Los AHL restantes en los medios se detectaron utilizando las cepas biosensoras. C. violaceum CV026 (Figura complementaria S1), que produce violaceína en presencia de AHL con cadenas de ácidos grasos cortas y medianas y C. violaceum VIR07 (Figura complementaria S1), que origina un pigmento de violaceína en presencia de C10-HSL. Encontramos que los sobrenadantes asociados con 112 cepas no activaron las dos cepas biosensoras utilizadas, lo que significa que degradaron tanto C6-HSL y C10-HSL. Estos experimentos se realizaron por triplicado y obtuvimos los mismos resultados. Todos los experimentos se realizaron a pH 7 para prevenir la lactonólisis de los AHL (que ocurre a pH básico) y la inactivación de biosensores, dando resultados falsos positivos (Yates et al., 2002).

Como segundo cribado, se llevó a cabo un ensayo de difusión de pocillos en placa de agar de las 112 bacterias seleccionadas anteriormente en presencia de siete AHL comerciales (C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, 3-oxo-C12-HSL y 3-OH-C10-HSL). El resultado fue la selección de 12 cepas con la capacidad de degradar una amplia gama de AHL. Como se muestra en Mesa & # x200B Mesa1 1 las 12 cepas degradan las AHL de cadena media y larga de manera más o menos eficiente, incluidas las AHL no sustituidas, sustituidas con oxo e hidroxilo. Sin embargo, ninguno de ellos muestra actividad QQ contra C4-HSL.

Tabla 1

Actividad de extinción de quórum (QQ) de las bacterias marinas seleccionadas e identificación taxonómica.

CepaC4-HSLC6-HSLC8-HSLC10-HSLC12-HSL3-oxo-C12-HSL3-OH-C10-HSLIdentificación taxonómica% De identidad
PQQ-1-+++++++++-Pseudoalteromonas paragorgicola99.78%
PQQ-5-++++++++-Pseudoalteromonas tetraodonis99.7%
PQQ-8-+++++++++-Alteromonas stellipolaris99.59%
PQQ-18-+++++++++-Pseudoalteromonas carrageenovora99.7%
PQQ-20-++++++++++-Pseudoalteromonas atl & # x000e1ntica99.44%
PQQ-31-++++++++-Pseudoalteromonas tetraodonis100%
PQQ-33-++++++++++-Alteromonas genovensis99.6%
PQQ-37-++++++++++++Alteromonas stellipolaris99.7%
PQQ-39-+++++++++-Pseudoalteromonas tetraodonis99.48%
PQQ-42-++++++++++++Alteromonas stellipolaris99.7%
PQQ-44-++++++++++++Alteromonas stellipolaris99.7%
PQQ-84-+++++++++-Pseudoalteromonas distincta99.7%

Caracterización de la actividad de degradación de AHL por HPLC-MS

Aplicamos análisis HPLC-MS para confirmar aún más la degradación de AHL por las cepas degradantes de AHL seleccionadas. Para ello elegimos una AHL de cadena media y larga (C6-HSL y C10-HSL). Los resultados indicaron que las 12 cepas seleccionadas fueron capaces de reducir significativamente la concentración de ambos tipos de AHL aunque esta capacidad fue mayor frente a C10-HSL (datos no mostrados). Con base en estos resultados junto con los obtenidos de los ensayos en placa de agar de difusión de pocillos (Mesa & # x200B Mesa1 1 ), se eligió la cepa PQQ-42 para estudios posteriores.Degradó todos los AHL ensayados, mostrando una actividad cercana al 100% en todos los casos (Figura & # x200B Figura1 1 ).

Mediciones de cromatografía líquida de alta resolución más análisis de espectrometría de masas (HPLC-MS) de C6-HSL y C10-HSL en los medios de cultivo libres de células del norte-acilhomoserina lactonas (AHL) -cepa degradante PQQ-42 después de 24 h. Se utilizó medio MB libre de células como control negativo. La concentración inicial de AHL fue de 10 & # x003 bcM. Las barras de error representan una desviación estándar.

Identificación taxonómica de cepas seleccionadas

Para identificar las 12 bacterias que degradan AHL, determinamos sus secuencias de genes de ARNr 16S. Las secuencias comparten altas homologías con las de algunas especies del género Alteromonas (cinco cepas) y Pseudoalteromonas (siete cepas) (Mesa & # x200B Mesa1 1 ) en comparación con las secuencias de genes de ARNr 16S de referencia obtenidas de las bases de datos GenBank y EMBL utilizando la búsqueda BLAST y el programa EzTaxon-e EzBioCloud.

La cepa PQQ-42 degrada los extractos de AHL de patógenos Vibrio spp.

Para determinar si se puede utilizar la cepa PQQ-42 en vivo Para interrumpir los sistemas QS de otras bacterias, primero evaluamos su capacidad para degradar las AHL producidas por patógenos asociados a la acuicultura. Vibrio son in vitro. Para ello, evaluamos la actividad QQ de la cepa PQQ-42 frente a extractos brutos de las cuatro cepas patógenas. V. anguillarum ATCC 19264 T, V. nigripulchritudo CIP 103195 T, V. metschnikovii NCTC 8483 T y V. mediterranei VibC-Oc-097. Las cantidades restantes de AHL se analizaron mediante ensayos de difusión en placa de agar (Figura & # x200B Figura2 2 ) y luego analizado por TLC que confirmó la actividad QQ (datos no mostrados). Como cepas de biosensores usamos A. tumefaciens NTL4 (pZLR4) para detectar AHL de cadena media y larga y C. violaceum CV026, que se activa en presencia de AHL de cadena corta y media (datos no mostrados). No pudimos detectar moléculas de AHL en todas las pruebas Vibrio extractos crudos.

Actividad degradante de la cepa PQQ-42 de AHL producida por patógenos Vibrio spp. visualizado en un ensayo en placa de agar por medio de la cepa biosensor Agrobacterium tumefaciens NTL4 (pZLR4). Medio MB sin células añadido con Vibrio mediterranei Extractos de VibC-Oc-097 AHL (control A). Cultivo de la cepa PQQ-42 añadida con V. mediterranei Extractos de VibC-Oc-097 AHL (B). Medio MB sin células añadido con V. metschnikovii NCTC 8483 T AHL extractos (control C). Cultivo de la cepa PQQ-42 añadida con V. metschnikovii Extractos NCTC 8483 T AHL (D). Barra de escala, 1 cm.

Tipo y ubicación de la actividad de degradación de AHL en PQQ-42

Para detectar si la actividad de QQ se debía a una enzima tipo lactonasa, acidificamos los sobrenadantes de los cultivos de la cepa PQQ-42 tras la incubación con las diferentes AHL ensayadas (C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, 3-oxo-C12-HSL y 3-OH-C10-HSL). Esta acidificación permite que el anillo de lactona se reestructure en el caso de que haya sido previamente abierto por una lactonasa. La recuperación de la concentración de AHL después de la acidificación de los cultivos fue insignificante en comparación con el control negativo (MB agregado con la misma cantidad de AHL y acidificado en las mismas condiciones Figura complementaria S2). Esto indica que la actividad de degradación de la cepa PQQ-42 puede deberse a la actividad de una enzima diferente de una lactonasa.

Para determinar la ubicación celular de la enzima, se obtuvo sobrenadante y CCE de los cultivos de la cepa PQQ-42 y se realizaron ensayos de degradación de AHL con ellos en presencia de C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, 3-oxo-C12-HSL y 3-OH-C10-HSL. La concentración de proteína tanto en el sobrenadante como en la CCE se ajustó previamente a 35 & # x003bcg mL -1. La actividad QQ de la cepa seleccionada se encontró en el CCE en todos los casos, pero no se encontró actividad en los medios de cultivo libres de células (Figura complementaria S3).

La cepa PQQ-42 degrada las AHL y reduce la actividad de proteasa y la motilidad de Vibrio Especies en co-cultura

Para llevar a cabo experimentos de co-cultivo, en primer lugar evaluamos si la cepa PQQ-42 degradadora de AHL seleccionada interfería con el crecimiento de las cuatro cepas patógenas. V. anguillarum ATCC 19264 T, V. nigripulchritudo CIP 103195 T, V. metschnikovii NCTC 8483 T y V. mediterranei VibC-Oc-097 mediante un experimento de antagonismo (ver Materiales y métodos). Nuestros resultados indican que PQQ-42 no tuvo ningún efecto negativo en el crecimiento de ninguno de los Vibrio cepas probadas (datos no mostrados). Por lo tanto, PQQ-42 se cultivó en SFSWYE para realizar experimentos de co-cultivo con cada uno de los cuatro patógenos Vibrio cepas en seis proporciones diferentes (consulte Materiales y métodos). Después de 24 h de incubación, los AHL se extrajeron de los co-cultivos y se verificaron con el biosensor. A. tumefaciens NTL4. Los mejores resultados se obtuvieron cuando 10 2 UFC mL -1 de un cultivo nocturno de cualquiera de los Vibrio Las cepas ensayadas se añadieron a un cultivo nocturno de 105 UFC mL -1 de PQQ-42. No se detectaron AHL en cada experimento de cocultivo. Esta relación se mantuvo a lo largo de los experimentos de cocultivo, como se confirmó mediante recuentos de placas en TCBS (donde Vibrio produce colonias de color amarillo) y MA (donde Vibrio produce colonias blancas lisas y PQQ-42 produce colonias blancas cóncavas).

Los co-cultivos en esta relación también se utilizaron para evaluar el efecto de la degradación de AHL sobre los factores de virulencia producidos por los cuatro patógenos. Vibrio son. Mediante el uso de diferentes ensayos (ver Materiales y métodos), encontramos que diferentes fenotipos de la Vibrio las cepas se vieron afectadas en las condiciones de nuestro ensayo (Mesa & # x200B Mesa2 2 ), como la actividad de la proteasa y la motilidad de natación de V. mediterranei VibC-Oc-097 (Figura complementaria S4).

Tabla 2

Fenotipos de Vibrio cepas después de cocultivo con la cepa PQQ-42 que degrada AHL.

FenotipoVibrio mediterraneiVibrio mediterranei + PQQ-42Vibrio anguillarumVibrio anguillarum + PQQ-42Vibrio nigripulchtritutdoVibrio nigripulchritudo + PQQ-42Vibrio metschnikoviiVibrio metschnikovii + PQQ-42
AHL++-++-++-++-
Motilidad++++++++++++
Hemólisis+++++++++++++++
Proteasa+++++++--+++
Amilasa--+++--+-
ADNasa+++++++++++++
Quitinasa+-++++++-
Lipasa (Tween 20)+++++++++++++
Lipasa (Tween 80)++++++++++++
Lipasa (tributirina)--------
Sideróforos--------
Biofilm++++++++++++++++

La cepa PQQ-42 reduce la virulencia de Vibrio mediterranei en el coral Oculina patagonica

En vivo Los ensayos se realizaron en colonias de coral escleractiniano. Patagonica utilizando la cepa PQQ-42. Corales tratados con la cepa PQQ-42 y V. mediterranei VibC-Oc-097 mostró menos daño tisular que los infectados con el Vibrio cepa solaFigura & # x200B Figura3A 3A ), como podemos ver reflejado en los niveles de clorofila a detectados en los tejidos del coral (Figura & # x200B Figura3B 3B ). Este resultado indica que la cepa PQQ-42 reduce significativamente la patogenicidad de V. mediterranei VibC-Oc-097 sobre el coral Patagonica mostrando un menor grado de daño tisular (29,25 & # x000b1 14,63%) en su presencia, en comparación con cuando el coral estaba infectado con V. mediterranei VibC-Oc-097 solo (77,53 & # x000b1 13,22%). Además, los niveles de clorofila a fueron similares en los corales de control y en los corales tratados con la cepa PQQ-42 (Figura & # x200B Figura3B 3B ), lo que demostró que esta bacteria no produce ningún daño a Patagonica (Figura & # x200B Figura3A 3A ).

Oculina patagonica colonias de coral después de 10 días de tratamiento y # x02019s que muestran el grado variable de blanqueamiento según la bacteria agregada [1: medio MB libre de células (control), 2: PQQ-42, 3: PQQ-42 +V. mediterranei VibC-Oc-097, 4: V. mediterranei VibC-Oc-097]. Barra de escala, 1 cm (A). Niveles de clorofila a (B) y número de vibrios (UFC g -1 C) en el tejido de Patagonica después de 5 y 10 días de tratamiento. Las barras de error representan una desviación estándar. Grupos definidos por post hoc Prueba SNK después de ANOVA (pag-valor & # x0003c 0.05) se realizaron y se muestran mediante números.

En cuanto al número de UFC de Vibrio en agua (Figura complementaria S5) y en tejido coralino (Figura & # x200B Figura3C 3C ), podemos ver que la adición de la cepa PQQ-42 no afectó el crecimiento de la cepa patógena.


Abstracto

Los homólogos de CsrA / RsmA son una extensa familia de proteínas de unión al ácido ribonucleico (ARN) que funcionan como reguladores postranscripcionales globales que controlan procesos celulares importantes como el metabolismo secundario, la motilidad, la formación de biopelículas y la producción y secreción de factores de virulencia en diversas especies bacterianas. . Si bien la unión directa del ARN mensajero por CsrA / RsmA se ha estudiado en detalle para algunos genes, se prevé que existen numerosos objetivos directos adicionales, aún no descubiertos, que median en su regulación global. Para ayudar en el descubrimiento de estos objetivos, proponemos un enfoque basado en secuencias para predecir genes directamente regulados por estos reguladores. En este trabajo, desarrollamos un código de computadora (CSRA_TARGET) que implementa este enfoque, que conduce a predicciones para varios objetivos novedosos en Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. Los objetivos predichos en otras bacterias, específicamente Salmonella enterica serovar Typhimurium, Pectobacterium carotovorum y Legionella pneumophila, también incluyen reguladores globales que controlan la virulencia en estos patógenos, desentrañando intrincados roles reguladores indirectos para CsrA / RsmA. Hemos validado experimentalmente cuatro objetivos RsmA previstos en P. aeruginosa. El enfoque basado en secuencias desarrollado en este trabajo puede conducir a varias predicciones comprobables para objetivos directos de homólogos de CsrA, complementando y acelerando así los esfuerzos para desentrañar la regulación global de esta importante familia de proteínas.


Cribado funcional

Es la capacidad de detectar, aislar y caracterizar genes expresados ​​en una biblioteca metagenómica lo que determina el éxito de cualquier evaluación metagenómica basada en funciones. Se puede utilizar una amplia gama de métodos de detección (resumidos en la figura 1). Entre estos, se distinguen tres estrategias generales de detección (Simon y Daniel 2009):

Detección de inserto fenotípico (PID), donde la expresión de un rasgo particular se usa para identificar clones positivos

Detección modulada (MD), una estrategia que se basa en la producción de un producto génico que es necesario para el crecimiento en condiciones selectivas.

Inducción de sustrato, una estrategia que se basa en la expresión inducida de genes clonados a través de un sustrato específico

Aunque se hace una distinción entre estas tres estrategias de detección, clasificarlas en grupos separados sería incorrecto. A menudo, se utiliza una combinación de ellos para realizar y optimizar el cribado. Por ejemplo, la detección fenotípica a través de un gen indicador de GFP se puede combinar con la expresión del gen de inserción inducida por el sustrato (Uchiyama et al. 2005).

PID es el enfoque más comúnmente utilizado para el cribado funcional de bibliotecas metagenómicas. La pantalla se basa en la detección de rasgos fenotípicos específicos. La intensidad (nivel) de la expresión génica es un tema importante aquí, ya que las señales de expresión débiles pueden pasarse por alto fácilmente en las pruebas de detección de alto rendimiento. Una posible ayuda la ofrecen los enfoques de microfluidos que utilizan volúmenes de nanolitros. Estos pueden ofrecer una mayor sensibilidad del ensayo, ya que se requiere menos producto génico para producir un fenotipo detectable (Taupp et al. 2011).

Los rasgos fenotípicos específicos pueden detectarse de múltiples formas. La primera forma se basa en la expresión directa, por ejemplo, mediante la detección de la pigmentación o la morfología de la colonia (Brady 2007), las cuales pueden resultar directamente del gen insertado expresado (Craig et al. 2010 LeCleir et al. 2007). Otra forma es la reacción (indirecta) o interacción de una sustancia agregada con el producto génico expresado o un producto que es consecuencia de esta expresión. Por último, la detección puede basarse en la coexpresión de un gen indicador que está vinculado al gen diana en la biblioteca. Se ha desarrollado una gran diversidad de métodos en base a estas tres estrategias, de las cuales se comentarán a continuación las más destacadas.

Detección directa

La detección visual es un método de cribado fenotípico que es relativamente sencillo y de “baja tecnología”. Sin embargo, también es bastante laborioso. Este método de cribado funciona mediante clones positivos que muestran un rasgo (como resultado de la expresión de un gen de biblioteca) que es directamente observable. Ejemplos de tales rasgos observables son la pigmentación de las colonias, la morfología irregular de las colonias o la formación de halo en las superposiciones de placas. La combinación de este método de detección directa con tecnologías de alto rendimiento, como la que ofrecen las placas de 384 pocillos, los robots de recolección de colonias y los lectores de microplacas, no solo acorta el tiempo de procesamiento, sino que también mejora la confiabilidad y comparabilidad de los exámenes realizados en diferentes clones. Una desventaja de este método es su baja resolución o sensibilidad. Por ejemplo, si la expresión es baja en un determinado clon positivo, es posible que un rasgo fenotípico no sea fácilmente detectable, lo que da como resultado un rechazo incorrecto de los clones positivos "subumbral". Además, el método no permite que se le dé dirección a la pantalla. En un estudio reciente (Craig et al. 2010), los clones se seleccionaron con alto rendimiento en múltiples hospedadores basándose en los tres rasgos fenotípicos mencionados anteriormente. Estos rasgos se eligieron basándose en el hecho de que se asocian comúnmente con la producción de moléculas pequeñas (Craig et al. 2010). Esto ilustra el hecho de que estos métodos son más adecuados para una exploración de amplio espectro del metagenoma en busca de rasgos pleiotróficos que para búsquedas dirigidas de una vía o metabolito específico.

Medio indicador

El uso de un medio indicador constituye una forma directa de detectar moléculas pequeñas particulares, reacciones químicas o capacidades metabólicas, catabólicas o antibióticas de un clon. Es un método de detección popular dada su idoneidad para aplicaciones de alto rendimiento, así como su facilidad para muchos experimentos, desde exámenes amplios de diversos productos génicos hasta el aislamiento de capacidades metabólicas muy específicas (De Vasconcellos et al.2010 Fan et al. 2011 Morohoshi et al.2011 Tirawongsaroj et al.2008). Además, la sensibilidad relativa de este método le permite detectar cambios en, por ejemplo, pH a niveles de expresión moderados, especialmente cuando se combina con microfluídicos basados ​​en gotas, donde las concentraciones detectables se alcanzan fácilmente debido al pequeño volumen en uso.

Un buen ejemplo del uso de medio indicador en los exámenes de detección es el aislamiento de nuevas metaloproteasas de bibliotecas metagenómicas utilizando placas con infusión de leche. El cribado se basó en la detección de actividad proteolítica en el E. coli clones, que confieren la capacidad de hidrolizar las proteínas de la leche. Los clones de la biblioteca se incubaron en placas de agar que contenían leche desnatada y la actividad proteolítica se detectó mediante la formación de halos transparentes en las placas (Waschkowitz et al. 2009).

El uso de medios indicadores es muy prometedor, ya que la expresión satisfactoria de genes extraños en el huésped puede controlarse fácilmente con un alto rendimiento. Confiar en la expresión exitosa de genes extraños para la detección podría producir pequeñas cantidades de aciertos positivos y, sin embargo, ofrecer la garantía de que el gen es funcional en el metagenoma huésped. Sin embargo, un problema es que las enzimas diana solo se expresan intracelularmente en el metagenoma huésped y la membrana celular puede no ser necesariamente permeable a las sustancias indicadoras presentes en el medio. Por tanto, la secreción del producto génico es necesaria para la detección. Además, pueden surgir otros problemas, como la degradación enzimática o la acumulación de producto intracelular (Sørensen y Mortensen 2005), que pueden resultar en toxicidad. La lisis celular forzada puede retener la solución, ya que puede poner la sustancia indicadora en contacto con las proteínas diana intracelulares (Bao et al. 2011). Sin embargo, se debe tener cuidado de no desnaturalizar las proteínas expresadas por los agentes de lisis, ya que de lo contrario se podría perder la actividad de la proteína así como su interacción con el sustrato indicador. Además, la rotura mecánica de las células puede requerir mucho tiempo y trabajo. Una posible forma de evitarlo es utilizar un vector autolítico. Li y col. (2007) desarrollaron un vector autolítico inducible por UV para su uso en cribados de alto rendimiento. Un SRRz La cassete del gen de lisis se insertó corriente abajo de un promotor inducible por UV en E. coli. La eficacia de la lisis celular se probó expresando β-galactosidasa en E. coli antes de la inducción UV. Después de la lisis inducida por UV, la actividad de la β-galactosidasa extracelular (sobrenadante) se comparó con el total de la actividad de la β-galactosidasa intracelular (sedimento) y extracelular para cuantificar la eficacia de la lisis. Se observó una eficacia de lisis del 60% o más a una temperatura de 30 ° C. Esto es comparable al tratamiento convencional con lisozima. Sin embargo, a 37 ° C, la tasa de lisis fue menos constante. Por lo tanto, el uso de dicho vector autolítico podría proporcionar una alternativa simple a las técnicas de lisis existentes (Li et al. 2007).

Además del cribado basado en beta-galactosidasa, se demostró que varias otras técnicas informadoras cromogénicas y fluorogénicas son eficaces en la identificación de las actividades de las enzimas codificadas por los genes insertados. LeCleir y col. (2007) mostraron así la presencia de enzimas quitinolíticas en una biblioteca metagenómica de estuario mediante la escisión de análogos fluorogénicos de quitina.

MD no se basa en la detección directa de un gen expresado, pero utiliza una ruta de expresión prediseñada. Modulando los sistemas de vector y / o huésped de expresión, se puede manipular la selección y detección de genes insertados, por ejemplo, mediante la coexpresión de genes indicadores o complementación heteróloga. Esto da como resultado cribados más específicos y señales detectables estandarizadas.

Genes reporteros

El uso de genes indicadores es un método adecuado para cribados de alto rendimiento. los lacZ gen que codifica la beta-galactosidasa (que da como resultado la coloración de la colonia al crecer en X-Galmedio que contiene) se utiliza con frecuencia como gen informador. En un experimento para detectar clones metagenómicos que contienen genes que interfieren con la detección de quórum (QS), se utilizó este gen informador. El cribado se logró midiendo la degradación potencial de las moléculas de señalización QS. Un A. tumefaciens cepa que contiene un traI-lacZ En el cribado se utilizó la fusión de genes. Al inducir el traI gen con la molécula de señal QS homoserina lactona 3-oxo-C 8 -HSL, lacZ Está activado. Esto da como resultado la producción de beta-galactosidasa, produciendo colonias azules. Si acaso, 3-oxo-C 8 -HSL es desglosado por el anfitrión, lacZ la inducción se inhibe y no aparece ningún color azul. Esto sería una indicación de una actividad de degradación o inhibición de detección de quórum del clon. El experimento produjo 438 clones positivos que mostraban inhibición de QS (Schipper et al. 2009).

Una gran ventaja de este enfoque es que la detección de clones positivos no depende de la expresión satisfactoria de un producto génico aguas abajo de la transcripción. Una expresión posiblemente débil del gen insertado tampoco dificulta la detección, como podría ocurrir en otros métodos de detección. Esto puede ser muy beneficioso cuando se buscan genes que pueden ser difíciles de expresar en el huésped.

Complementación heteróloga (HC)

La complementación heteróloga (HC) se basa en la exploración de genes extraños para lograr la complementación genética en el huésped, lo que da como resultado la expresión de un producto génico que es vital para el crecimiento en condiciones selectivas. La técnica permite una gran selectividad y, por lo tanto, una pantalla puede dirigirse con precisión para buscar genes específicos (Kellner et al. 2011 Simon et al. 2009). Simon et al. Presentan un ejemplo. (2009) que examinó bibliotecas de fosmidos y plásmidos metagenómicos derivados del hielo glacial para detectar genes que codifican la polimerasa de ADN. Esto se logró mediante el uso de un E. coli cepa que porta una mutación sensible al frío en el dominio de exonucleasa 5′-3 ′ de la ADN polimerasa I, que es letal a temperaturas inferiores a 20 ° C. Al cultivar los clones en placas que contienen antibióticos compatibles con la resistencia del vector, a una temperatura de 18 ° C, se pueden identificar clones positivos que complementan la mutación letal. Usando este enfoque, se recuperaron 17 plásmidos y 1 fosmido con el fenotipo deseado de la biblioteca de clones. El análisis de secuencia de nueve clones positivos indicó que de hecho se habían aislado genes de la ADN polimerasa de la biblioteca. Teniendo en cuenta la naturaleza conservada de los genes de la ADN polimerasa y el grado de homología con los genes conocidos de la ADN polimerasa, este resultado llevó a la conclusión de que los genes se habían recuperado de microorganismos aún no explorados (Simon et al. 2009).

Otro ejemplo de HC lo proporciona un estudio que intentó aislar nuevos genes de lisina racemasa de un metagenoma (Chen et al. 2009). Un E. coli Se usó una cepa portadora de una mutación de auxotrofia de lisina para cribar los genes antes mencionados en una biblioteca metagenómica derivada de suelo de jardín. Los clones se cultivaron en medio suplementado con d-lisina. Dado que solo los clones recombinantes exitosos podrían catabolizar la d-lisina, los clones no exitosos morirían de hambre en el medio. Usando este método, se identificó y secuenció un clon positivo. Para confirmar que el gen insertado se derivó del metagenoma y no de fragmentos de ADN digeridos durante la construcción de la biblioteca, los cebadores basados ​​en el lyr (lisina racemasa). Estos cebadores luego amplificaron con éxito el lyr gen directamente del ADN metagenómico por PCR (Chen et al. 2009).

Inducción por sustrato

La inducción de la expresión génica por sustrato es particularmente práctica para la detección de genes catabólicos. La expresión de genes catabólicos a menudo es inducida por sustratos y / o metabolitos de enzimas catalíticas. Los elementos reguladores de estos genes catabólicos generalmente se sitúan cerca de los genes mismos. Se ha demostrado que estos elementos funcionan en organismos hospedadores como E. coli.

Expresión génica inducida por sustrato

Uchiyama y col. (2005) desarrollaron el llamado sistema de expresión génica inducida por sustrato (SIGEX) para su uso como método de detección de genes catabólicos particulares. Para hacer que este método sea compatible con alto rendimiento, se usó un vector de expresión de GFP de trampa de operón, lo que dio como resultado GFP coexpresado tras la expresión inducida por el sustrato de cualquier gen insertado sensible. Esta expresión de GFP permitió posteriormente la separación de clones positivos mediante clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS). En el estudio, se encontraron genes metagenómicos del agua subterránea que podrían ser inducidos por benzoato y naftaleno. Esto produjo 58 clones positivos para benzoato y cuatro naftaleno (Uchiyama et al. 2005). Al cambiar el sustrato, se puede ajustar el alcance de la pantalla y se pueden apuntar diferentes genes catabólicos. Las funciones génicas posiblemente desconocidas podrían incluso deducirse del sustrato inductor que se utiliza. Sin embargo, la inducción de la expresión por otros efectores distintos del sustrato utilizado puede resultar en la detección de falsos positivos.

Expresión regulada por metabolitos

La expresión regulada por metabolitos constituye una técnica similar a la anterior (Williamson et al. 2005). Tiene como objetivo detectar pequeñas moléculas biológicamente activas mediante un sistema intracelular. luxI – luxR sistema biosensor. En este sistema, la expresión génica será inducida o inhibida por la detección de quórum. Después de que se alcanza una cierta concentración de producto génico, la inducción de la expresión de un activador transcripcional tendrá lugar mediante la unión de luxR, que activa luxI se producirá la expresión posterior de un gen indicador. La expresión exitosa del gen indicador permite un cribado de alto rendimiento mediante FACS. Una ventaja de este sistema es que no depende de la secreción de un producto genético como lo hacen las pantallas con organismos indicadores (una técnica común para identificar antibióticos). En cambio, esta técnica realiza un cribado intracelular de moléculas pequeñas expresadas (Williamson et al. 2005).


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RESULTADOS

Enriquecimiento biológico de fagos que muestran secuencias de péptidos de unión a Hsp16.3 mediante biopanning.

Después de la tercera ronda de cribado de la biblioteca Ph.D.-7 en Hsp16.3, se encontró que de los ocho clones de fagos seleccionados al azar (Seq IDs 1 a 8), que fueron secuenciados para la región codificante del péptido, cinco eran idénticos (Tabla & # x200B (Tabla1). 1). La secuencia ID 9 representa una secuencia consenso, Lys-Met-His-Ala-Thr-Asn-His, que emerge de este experimento de cribado. En el caso de la biblioteca Ph.D.-12, los resultados fueron más sorprendentes. De los 10 clones secuenciados después del tercer cribado, 9 clones (Seq IDs 11 a 20) eran idénticos, y la secuencia del péptido consenso (Seq ID 21) en este caso era Tyr-Pro-His-His-Phe-Lys-His- Arg-His-Ile-Pro-Ile. Cuando se compararon las dos secuencias consenso (Seq IDs 9 y 21), se encontró que el tercer y séptimo residuos de His existían en una posición alineada. La unión de los clones de fagos que presentan péptidos (Seq IDs 9 y 21) a Hsp16.3 se confirmó adicionalmente realizando un ELISA de fagos inverso (Fig. & # X200B (Fig. 1). 1). Para derivar péptidos sintéticos, se añadió el espaciador Gly-Gly-Gly-Ser a las secuencias consenso en los extremos C-terminales para obtener las secuencias de unión eficaces que tienen ID 10 y 22.

ELISA de fagos inverso para confirmar la unión de los clones de fagos que presentan secuencias de péptidos, Seq ID 9 y 21, a Hsp16.3. Los clones de fagos se amplificaron, se concentraron mediante precipitación con PEG y se hicieron reaccionar con Hsp16.3 o con BSA diana no específica revestida en los pocillos de una placa de microvaloración. El fago no unido se eliminó lavando con TBST (Tween 20 al 0,5%) y el fago unido se detectó con anticuerpo monoclonal anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (1: 5.000) y sustrato ABTS. El desarrollo del color se controló espectrofotométricamente a 405 nm. Cada experimento se realizó por triplicado. El gráfico de barras muestra la actividad de unión de los clones de fagos que muestran la secuencia ID 9 (& # x025a1) y la secuencia ID 21 (& # x025aa) a Hsp16.3 y BSA (unión de fondo). Las barras de error representan el SE.

TABLA 1.

Secuencias de péptidos de unión a Hsp16.3 seleccionadas después de un cribado de tercera ronda

Biblioteca de visualización de fagos utilizadaID de secuencia aSecuencia de aminoácidos B
Doctorado-71GlyValGluAsnValSerTrp
2LysReunióSuAlaThrAsnSu
3LysReunióSuAlaThrAsnSu
4LysReunióSuAlaThrAsnSu
5LeuProAlaLysAsnPheSu
6PheProProLeuLysSerPro
7LysReunióSuAlaThrAsnSu
8LysReunióSuAlaThrAsnSu
9 & # x0002aLysReunióSuAlaThrAsnSu
10 & # x02020LysReunióSuAlaThrAsnSuGlyGlyGlySer
Doctorado-1211TyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIle
12TyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIle
13TyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIle
14TyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIle
15TyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIle
16AlaTyrLysProIleAlaSuPheIleSerProAla
17TyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIle
18TyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIle
19TyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIle
20TyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIle
21 & # x0002aTyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIle
22 & # x02020TyrProSuSuPheLysSuArgSuIleProIleGlyGlyGlySer

Las diversas secuencias de péptidos de unión a Hsp16.3 mencionadas en el presente estudio, el método para derivarlas y el ensayo de sus actividades inhibidoras están cubiertos por una solicitud de patente (pendiente) presentada a la Oficina de Patentes y Marcas de Estados Unidos.

Afinidad de unión de los ligandos peptídicos por Hsp16.3.

Las Seq IDs 10 y 22, denominadas péptidos 10 y 22 en adelante, se sintetizaron químicamente y se marcaron con FITC en los extremos N terminales.

Los péptidos fluoresceinados se usaron para medir la unión con Hsp16.3 mediante anisotropía de fluorescencia. La Figura 2A y B muestran las valoraciones de los péptidos conjugados con FITC 10 y 22 (800 nM), respectivamente, con concentraciones crecientes de Hsp16.3. Para cada péptido se realizaron tres valoraciones independientes, y la anisotropía media & # x000b1 el SE se representó frente a la concentración de proteína. La anisotropía aumentó en función de la concentración de Hsp16.3. Los datos se ajustaron a la ecuación de unión de un solo sitio (ecuación 2) y se determinó la constante de disociación. los KD Se encontró que los valores así obtenidos eran 54.2 & # x000b1 13.7 & # x003bcM (PAG & # x0003d 0,001) y 45,7 & # x000b1 18,0 & # x003bcM (PAG & # x0003d 0,023) para los péptidos 10 y 22, respectivamente.

Determinación de la constante de disociación y estequiometría de la unión del péptido a Hsp16.3. Aumento de la anisotropía del péptido 10 (A) y del péptido 22 (B) marcados con FITC en función de la concentración de Hsp16.3 en tampón de fosfato de sodio 50 mM (pH 7,5) que contiene NaCl 300 mM a temperatura ambiente. Los valores de anisotropía son medias & # x000b1 el SE (indicado por barras de error) de tres experimentos independientes. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron de 495 y 519 nm, respectivamente. En el caso del péptido 10, se determinó la estequiometría (C) a partir de la extinción dependiente de la dosis de la fluorescencia de tirosina intrínseca de Hsp16.3 en las mismas condiciones de tampón. Las líneas se dibujaron para determinar la estequiometría de unión.

La extinción de la fluorescencia de tirosina de la proteína Hsp16.3 también se utilizó para estudiar la unión del péptido 10. Dado que el péptido 10 no tiene residuos de tirosina, se puede utilizar como extintor, pero no se pudo realizar un ejercicio similar en el caso del péptido 22, ya que la tirosina forma parte de la secuencia. Figura & # x200B Figura2C 2C muestra el perfil de extinción de la fluorescencia de tirosina de Hsp16.3 (15 & # x003bcM) al unirse al péptido 10. El valor de abscisas de la intersección de la línea asintótica y la dibujada a través de la línea inicial F/F0 los valores representan notario públicot & # x0002b KD, dónde norte es el número de sitios de unión de péptidos por subunidad de Hsp16.3 y PAGt es la concentración de proteína total en términos de monómero. Para determinar norte, los experimentos de extinción se realizaron a dos concentraciones de Hsp16.3: 15 & # x003bcM (Fig. & # x200B (Fig. 2C) 2C) y 5 & # x003bcM (datos no mostrados). Se encontró que los valores de abscisas eran 20,0 (Fig. & # X200B (Fig. 2C) 2C) y 10,2 & # x003bcM, respectivamente. Por lo tanto, tenemos KD & # x0002b 15norte & # x0003d 20.0 y KD & # x0002b 5norte & # x0003d 10.2. Eliminando KD a partir de estas dos ecuaciones, el valor de norte se determinó que era 0,98. Se puede concluir que existe un sitio de unión para el péptido 10 por subunidad de Hsp16.3.

Inhibición específica de la actividad chaperona de Hsp16.3 por parte de los péptidos.

La alcohol deshidrogenasa (ADH) (5 & # x003bcM) se agrega cuando se calienta a 50 & # x000b0C (Fig. 3A, B, D y E). Esta agregación se inhibe hasta el punto de ca. 85% cuando la ADH se coincuba con Hsp16.3 (Fig. 3A y D) en una relación molar de ADH a Hsp16.3 de 5: 4. La adición de cantidades crecientes de péptido 10 dio como resultado una pérdida progresiva de la actividad acompañante de Hsp16.3. A la concentración más alta de 100 & # x02009 & # x003bcM, es decir, con un exceso molar de & # x0223c25 veces, se observó una inhibición significativa (& # x0003e70%) de la actividad chaperona (Fig. & # X200B (Fig. 3A). 3A ). De manera similar, en el caso del péptido 22, el grado de inhibición a 100 & # x003bcM fue de aprox. 60% (Fig. & # X200B (Fig. 3D). 3D). La adición de péptido solo no tuvo ningún efecto sobre las tasas de agregación de ADH (Fig. 3A y D). Usando la misma configuración experimental, se reemplazó Hsp16.3 por alfaB-cristalina, y se analizó el efecto inhibidor, si lo hubiera, de los péptidos sobre esta proteína. Como era de esperar, cuando se mezcló ADH (5 & # x003bcM) con alfaB-cristalina (2,5 & # x003bcM), se observó una protección completa contra la agregación, pero esta protección no pudo revertirse mediante la adición del péptido 10 o del péptido 22 (Fig. .3B y E, respectivamente) a la concentración de 100 & # x003bcM, que da efectivamente un exceso molar de & # x0223c40 veces de péptido sobre la proteína diana alfaB-cristalina. Para obtener una interpretación más cuantitativa, se representó el porcentaje de actividad de chaperona residual (media & # x000b1 el SE de tres experimentos independientes) frente a la concentración de péptido. Esto produjo una curva dosis-respuesta (Fig. 3C y F) a partir de la cual IC50 valores de 53.0 & # x000b1 8.47 & # x003bcM (PAG & # x0003d 0,0079) para el péptido 10 y de 57,1 & # x000b1 4,37 & # x003bcM (PAG & # x0003d 0,0058) para el péptido 22. Las curvas de dosis-respuesta para ambos péptidos también muestran gráficamente que en el contexto de alfaB-cristalina casi no hubo efecto.

Inhibición dependiente de la dosis de la actividad acompañante de Hsp16.3 por los péptidos 10 y 22. Los ensayos de agregación se realizaron calentando ADH 5 & # x003bcM a 50 & # x000b0C directamente en un espectrofotómetro usando un soporte de cubeta termostatizado en un volumen de reacción total de 500 & # x003bcl en tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 7,0) que contiene NaCl 100 mM. La absorbancia se controló a 360 nm durante 1200 s, y se tomaron lecturas cada 100 s de intervalo. Los agregados de ADH tras el calentamiento (A, B, D y E & # x025b4). La incorporación de Hsp16.3 en una relación molar de 5: 4 (A y D) o alfaB-cristalina en una relación molar de 1: 1 (B y E) da como resultado una disminución de la actividad de agregación (& # x02022). Luego se agregaron concentraciones crecientes de péptido de unión a Hsp16.3 10 (A y B) y péptido 22 (D y E) como se indica en las siguientes concentraciones: 25 & # x003bcM (& # x025a1), 50 & # x003bcM (& # x025aa ) y 100 & # x003bcM (& # x025b5). Las estrellas representan la agregación de ADH en presencia del péptido 10 (A y B) y del péptido 22 (D y E). El IC50 para el péptido 10 (C) y el péptido 22 (F) se calculó a partir del gráfico del porcentaje de actividad de chaperona residual frente a la concentración de péptido. Cada punto de referencia en los paneles C y F es un promedio de tres resultados derivados de forma independiente. Las barras de error indican el SE.

Los péptidos afectan la estabilidad de los complejos de sustrato Hsp16.3.

Se ha demostrado anteriormente que las alfa-HSP forman complejos solubles con proteínas propensas a la agregación cuando se calientan juntas a 50 ° C (14). Con el fin de investigar el posible mecanismo de acción de los inhibidores de péptidos, se examinó su efecto sobre la formación del complejo de sustrato Hsp16.3 utilizando el sustrato modelo malato deshidrogenasa (MDH). Se tomó MDH a una concentración de 2 & # x003bcM y se calentó a 50 & # x000b0C. Como era de esperar, formó agregados y precipitó. Cuando el sedimento y el sobrenadante se analizaron por SDS-PAGE, se encontró que la proteína completa estaba presente en la fracción del sedimento (Fig. & # X200B (Fig. 4A, 4A, carril 2). Hsp16.3 (80 & # x003bcM) luego se añadió a MDH en un exceso molar de 40 veces antes de calentar para evitar la agregación. La incorporación de esta cantidad proporcionó la máxima protección, y la mayor parte de la MDH se retuvo en el sobrenadante (Fig. & # x200B (Fig. 4A, 4A , carril 3). Para investigar el efecto del péptido 10 en la formación del complejo, se agregaron dosis crecientes del péptido para inactivar Hsp16.3. (carriles marcados con puntos negros) tras la adición de cantidades crecientes de péptido 10. Sin embargo, Hsp16.3 permaneció soluble hasta una concentración de péptido 10 de 3,2 mM (exceso molar de 40 veces), aunque a una concentración más alta (4,8 mM, es decir, un exceso molar de 60 veces) también se precipitó (Fig. & # x200B (Fig. 4D). 4D). La adición del péptido 22 condujo a consecuencias similares (Fig. & # x200B (Fig. 4C), 4C), pero en este caso se produjo una precipitación casi completa del complejo a una concentración de péptido de 1,2 mM (exceso molar de 15 veces) en comparación con 4,8 mM (exceso molar de 60 veces) en el caso del péptido 10. Otra diferencia notable fue que, a diferencia del caso anterior, la precipitación de Hsp16.3 y MDH se produjo en paralelo cuando se utilizó el péptido 22 como inhibidor (Fig. & # x200B (Fig. 4E). 4E). Dado que en ambos casos se observó una pérdida detectable en la solubilidad de Hsp16.3, se examinó el efecto de estos péptidos sobre la solubilidad de la propia Hsp16.3 a las concentraciones de péptido a las que se precipitaron los complejos. Los resultados indican que en el caso del péptido 10 (Fig. & # X200B (Fig. 4F), 4F), ca. El 70% de la proteína chaperona presente se volvió insoluble en un exceso molar de 60 veces (4.8 & # x02009mM), mientras que en el caso del péptido 22 (Fig. & # X200B (Fig. 4G), 4G), casi el 90% de la misma perdió solubilidad en un exceso molar de 15 veces (1,2 mM).

Efecto de péptidos sobre la estabilidad del complejo Hsp16.3-MDH. (A) MDH (2 & # x003bcM) solo o después de mezclarlo con Hsp16.3 (80 & # x003bcM) se calentó a 50 & # x000bcM durante 30 min, seguido de centrifugación a 15.000 & # x000d7 g. Los sobrenadantes y sedimentos se analizaron mediante SDS-PAGE en un gel al 15%. Los carriles marcados con puntos negros representan fracciones de gránulos en todos los casos. A continuación, se formó el complejo MDH-Hsp16.3 en presencia del péptido inhibidor 10 o del péptido 22 (B y C), respectivamente.Los excesos molares de los péptidos usados ​​con respecto a Hsp16.3 se indican debajo de los carriles. Las bandas se escanearon densitométricamente y la fracción de la proteína (Hsp16.3 o MDH) que apareció en el sobrenadante se representó como el porcentaje de solubilidad frente al exceso molar de péptido 10 o péptido 22 (D y E), respectivamente. (F y G) Se probó el efecto de los péptidos 10 y 22 sobre la solubilidad de Hsp16.3 usando el exceso molar indicado. (H) El efecto comparativo del péptido 22 (carriles marcados con puntos negros) sobre alfaB-cristalina se determinó al lado del control Hsp16.3. (I) De manera similar, se probó el efecto del péptido 22 sobre la formación de un complejo soluble entre alfaB-cristalina y MDH junto con un control de Hsp16.3-MDH. En los dos últimos experimentos, se usó un exceso molar de péptido de 15 sobre Hsp16.3 o alfaB-cristalina.

Aunque la precipitación se observó a concentraciones relativamente altas de péptidos, el fenómeno es específico ya que no ocurre en el caso de BSA y DnaK (datos no mostrados), ni afecta al homólogo relacionado alfaB-cristalina (Fig. & # X200B ( Figura 4H). 4H). Por tanto, cuando se añadió un exceso molar de 15 veces (1,2 mM) de péptido 22 a Hsp16.3 (80 & # x003bcM), se observó una pérdida significativa de solubilidad como se esperaba (Fig. & # X200B (Fig. 4H, 4H). , carril 4), pero cuando se añadió a alfaB-cristalina, no se observó ningún efecto (Fig. & # x200B (Fig. 4H, 4H, carril 8). El efecto de los péptidos en el complejo entre MDH y alfaB-cristalina También se investigó (Fig. & # x200B (Fig. 4I). 4I). Los resultados presentados para el péptido 22 muestran que a la concentración del péptido a la que precipita el complejo Hsp16.3-MDH (Fig. & # x200B (Fig. .4I, 4I, carril 4), no se observó ningún efecto sobre el complejo alfaB-cristalina-MDH (Fig. & # X200B (Fig. 4I, 4I, carril 8). Los ensayos se repitieron varias veces y se encontró el patrón de precipitación Estas observaciones establecen además que los inhibidores de péptidos tienen especificidad de diana.

La precipitación no es una característica esencial para la inhibición.

Para investigar si la pérdida de actividad acompañante de Hsp16.3 observada en los ensayos de agregación espectrofotométrica se debió a la precipitación de la proteína, se realizó primero un ensayo (Fig. & # X200B (Fig. 5A) 5A) esencialmente como se describe en las secciones anteriores y luego, después de alcanzar la agregación en estado estacionario, las muestras se centrifugaron y las fracciones de sedimento se analizaron mediante SDS-15% PAGE (Fig. & # x200B (Fig. 5C). 5C). La presencia de Hsp16.3 (4 & # x003bcM) evita la agregación en una extensión del 60% (Fig. 5A y B). La adición de péptido 10 o péptido 22 en un exceso molar de 50 veces (200 & # x003bcM) restauró la agregación hasta casi el nivel inicial (ADH sola). Hsp16.3 en sí mismo no muestra ninguna agregación. El análisis SDS-PAGE reveló que en presencia de Hsp16.3 había una caída del 55% en la intensidad de la banda de ADH (Fig. 5C y D, carril 3) acorde con la caída observada en el ensayo espectrofotométrico. En presencia de los péptidos, la intensidad volvió a casi el 100%, lo que indica la inhibición de la actividad de Hsp16.3 (Fig. 5C y D, carriles 4 y 5 en comparación con el carril 2). Las fluctuaciones en las intensidades ocurrieron solo en el caso de las bandas de ADH pero no para Hsp16.3, cuya intensidad permaneció en los niveles de fondo (Fig. & # X200B (Fig. 5D). 5D). Esto indica que, en las condiciones del ensayo espectrofotométrico, la inactivación por los péptidos no implica la agregación de Hsp16.3. El resultado sugiere que la unión de los péptidos altera la conformación de Hsp16.3 de modo que se vuelve menos soluble, pero la pérdida de solubilidad se manifiesta realmente cuando las concentraciones de péptidos son altas, es decir, en el rango milimolar. La precipitación, por lo tanto, no es el fenómeno en sí mismo, sino un reflejo de un posible cambio conformacional en Hsp16.3 como resultado de la unión del péptido.

Inactivación de Hsp16.3 mediada por péptidos en las condiciones utilizadas para el ensayo espectrofotométrico de la actividad chaperona. (A) La actividad de la chaperona se midió espectrofotométricamente como se describe en la Fig. & # X200B Fig. 3. 3. La agregación de ADH (5 & # x003bcM) sin acompañante está representada por la curva marcada por círculos blancos, la protección por Hsp16.3 (4 & # x003bcM) por círculos negros, y la inhibición de Hsp16.3 por los péptidos 10 y 22 (200 & # x003bcM) # x003bcM) por cuadrados blancos y negros, respectivamente. La agregación de Hsp16.3 solo se indica mediante triángulos blancos. (B) Las agregaciones de estado estacionario (1200 s) observadas en el panel A están representadas gráficamente. (C) Las muestras agregadas se centrifugaron y las fracciones de sedimento se analizaron mediante SDS-PAGE en un gel al 15%. Las líneas correspondientes a las curvas de agregación se indican mediante símbolos idénticos. Las combinaciones de proteínas y péptidos utilizadas se indican en la parte superior. El diagrama de barras (D) muestra las intensidades de banda de los componentes ADH (& # x025a1) y Hsp16.3 (& # x025aa) en cada carril.

Evidencia de la participación de los residuos de His en la interacción del péptido con Hsp16.3.

Para investigar más a fondo la interacción entre péptidos y Hsp16.3, se realizaron experimentos de RMN. Figura & # x200B Figura6A 6A representa los espectros TOCSY superpuestos de la región NH - & # x003b1H del péptido 10 (2 mM) en ausencia de Hsp16.3 (rojo) y en presencia de Hsp16.3 (azul) en un nivel subestequiométrico concentración (0,1 mM). En estas condiciones de exceso de ligando, solo son visibles los picos de péptidos. El intercambio rápido entre las formas libres y unidas al receptor permite promediar los dos cambios químicos en dos condiciones diferentes. Por tanto, el cambio de desplazamiento químico, en comparación con el péptido libre, representa cambios químicos que son diferentes en el estado unido al receptor y posibles puntos de interacción entre el péptido y el receptor. Figura & # x200B La Figura 6B 6B representa gráficamente las diferencias de desplazamiento químico de los protones de amida de los residuos del péptido 10 en soluciones tampón en presencia o ausencia de Hsp16.3. En el diagrama de barras se desprende claramente que sólo se desplazan unos pocos residuos y que el desplazamiento químico de la mayoría de los residuos permanece sin cambios. Los tipos de residuos se asignaron a partir de la conectividad de espín y la información de desplazamiento químico (datos no mostrados). Los picos de Met no se observaron en los espectros TOCSY, probablemente debido al ensanchamiento de los picos debido al intercambio conformacional. Sin embargo, se pudo observar el pico de Met cuando los espectros se derivaron en agua a 27 ° C (datos no mostrados), lo que confirma que el péptido contenía Met. La comparación de los espectros TOCSY del péptido 10 obtenidos en presencia o ausencia de Hsp16.3 reveló cambios de desplazamiento químico significativos para ambos residuos His del péptido 10 en presencia de Hsp16.3. En el caso de Ala, se observó un efecto menor, pero para los demás el efecto fue insignificante. A partir de este resultado, parece que la región His-X-Y-Y-His del péptido 10 puede ser necesaria para la interacción con Hsp16.3, donde X representa Ala o un aminoácido análogo e Y representa cualquier otro aminoácido. No fue posible un análisis similar con el péptido 22 ya que el complejo del péptido 22-Hsp16.3 precipita a alta concentración, como se demostró anteriormente.

Cambios en el desplazamiento químico de los residuos del péptido 10 debido a la interacción con Hsp16.3. (A) Superposición de espectros TOCSY 2D en la región de huellas dactilares (seleccionada) del péptido 10 2 mM en tampón de fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0) que contiene NaCl 250 mM en H al 90%2O y 10% D2O a 5 ° C en ausencia (rojo) o en presencia (azul) de proteína Hsp16.3 0,1 mM. Los aminoácidos se designan mediante el código de una letra. (B) Representación gráfica de las diferencias de desplazamiento químico (& # x00394 & # x003b4 Hz) de los protones de amida de los residuos del péptido 10 en la solución tampón en presencia o ausencia de Hsp16.3, como se menciona en la leyenda del panel A.


Materiales y métodos

Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de crecimiento

Escherichia coli Las cepas utilizadas fueron DH5α [52], C600 [53], MV10Nal R [54], JM109 [17], HB101 [55], Nissle1917 [56], AL1 (este estudio, Rif R mutante de ratón mi. coli cepa aislada por Alessandro Lazdins en Sydney). Los plásmidos utilizados se enumeran en la tabla S2. Las bacterias se cultivaron aeróbicamente, en caldo L / agar L [33] o en Medio Mínimo M9 [33] (suplementado con aminoácidos a 50 μg ml -1) a 37 ° C. Las concentraciones finales de antibiótico fueron: ampicilina (Ap o Amp), 100 μg ml -1 de kanamicina (Km o Kan), 50 μg ml -1 de cloranfenicol (Cm o Cam), 50 μg ml -1 de ácido nalidíxico (Nal), 25 μg ml -1 rifampicina (Rif) 100 μg ml -1 y tetraciclina (Tc o Tet), 25 μg ml -1. Para el cribado azul / blanco, el agar L se complementó con X-gal (20 μg ml -1) e IPTG (0,5 mM).

Análisis y manipulación de ADN

Las enzimas de restricción se adquirieron de New England Biolabs T4 ADN ligasa y la ADN polimerasa Taq fueron de Invitrogen Velocity La ADN polimerasa de corrección de pruebas fue de Bioline Q5 La polimerasa Taq de alta fidelidad fue de NEB. La amplificación por PCR del ADN se logró utilizando los cebadores (AltaBioscience, Universidad de Birmingham, Reino Unido o Sigma Aldrich) enumerados en la Tabla S3. Las reacciones se ciclaron en un ciclador de laboratorio SensoQuest siguiendo los procedimientos estándar [57]. Los productos de PCR se purificaron usando el kit de purificación de bandas de gel y ADN de PCR Illustra GFX TM (GE TM Healthcare). Se realizaron preparaciones de ADN plasmídico a pequeña escala utilizando el kit de extracción de ADN AccuPrep Plasmid MiniPrep (Bioneer) adaptado del método de lisis alcalina de Birnboim y Doly [58]. Las reacciones de secuenciación de ADN se prepararon y ejecutaron en un analizador de ADN ABI 3730 (Functional Genomics Facility, Universidad de Birmingham, Reino Unido) siguiendo el método de terminación de la cadena [59].

Comparación del número de copias de plásmido

Al menos triplicar cultivos selectivos durante la noche (16 h) de mi. coli que llevaban los plásmidos de consulta más 2 kb del derivado de pACYC194 pDS3 como patrón interno cultivado en LB con agitación a 200 rpm y 37ºC se recogieron y luego se extrajo el ADN plasmídico como se describió anteriormente. El ADN plasmídico se digirió con una enzima que cortaba solo una vez, para linealizar el ADN y hacer uniforme la unión del bromuro de etidio. Las intensidades de banda se determinaron con el software QuantityOne de Biorad y se normalizaron frente a la banda pDS3. Las colonias de la dilución en serie de los cultivos se sembraron por réplica para determinar el% de transporte de plásmido.

Transferencia conjugativa

Después del crecimiento durante la noche, se mezclaron 100 μl de donante con 1 ml de mi. coli Recipiente MV10 Nal R y filtrado en un filtro Millipore estéril de 0,45 μm. Los filtros se colocaron en placas de agar L que se incubaron a 37 ° C durante 6 horas. Las células del filtro se resuspendieron en 1 ml de solución salina estéril al 0,85% (p / v) cada una y se diluyeron en serie antes de esparcirlas en agar selectivo e incubar a 37ºC.

Ingeniería recombinacional (recombinación) de genomas del plásmido IncP-1 conjugativo

Para las inserciones, deleciones o reemplazos, se utilizaron cebadores (Tabla S3) para amplificar por PCR aproximadamente brazos de 500 pb en cualquier lado del punto o región que se va a cambiar. Los brazos se unieron diseñando los cebadores internos para que tuvieran complementariedad, a veces incorporando nuevos sitios de restricción, para permitir la unión mediante PCR SOEing (Splicing by Overlap Extension) [60]. Los productos de PCR iniciales se purificaron, mezclaron y luego se extendieron durante tres ciclos antes de agregar los cebadores externos para los ciclos restantes. El producto se clonó rutinariamente entre los sitios HindIII y SalI de un derivado de pACYC184 pMEL1 que tiene la sacB gen (que permite la contraselección con sacarosa) insertado entre los sitios XbaI y HindIII. Para incorporar los casetes antiF y antiK en un plásmido conjugativo, los brazos de homología se insertaron primero para dar pMILL1 (Tabla S2) y luego los casetes se clonaron entre los brazos (usando sitios de restricción diseñados en los cebadores internos) para dar pMILL2 y pSLK1 respectivamente (S2 Mesa).

El plásmido recombinante se introdujo en mi. coli C600 ya lleva el plásmido diana, seleccionando con Cam y un antibiótico apropiado para el plásmido diana (habitualmente Tet). A continuación, se llevó a cabo la transferencia conjugativa a MV10nal R seleccionando ambos marcadores y Nal: el plásmido derivado de pMEL1 no debería transferirse a menos que se haya recombinado con el plásmido conjugativo. Las colonias individuales se purificaron sembrando en estrías hasta colonias individuales y estas placas se usaron para inocular cultivos líquidos que se cultivaron durante la noche sin Cam. La selección de los productos de resolución se logró luego esparciendo sobre agar L con sacarosa (5% p / v) o aislando el ADN plasmídico y cortando con XbaI que corta en pMEL1 pero no en la columna vertebral IncP-1 para linealizar los plásmidos no deseados de manera que que no transformarán las bacterias.

Prueba de la eficiencia de curado

Para transferir por conjugación, cultivos líquidos durante la noche de mi. coli C600 que lleva el plásmido pCURE a ensayar, o un control apropiado, se lavaron para eliminar cualquier antibiótico selectivo, luego se mezclaron 1: 1 y 1:10 con una cepa que portaba el plásmido diana y un apareamiento de filtro estándar llevado a cabo a 37 ° C para 1 h. A continuación, las bacterias de la membrana se resuspendieron en 1 ml de solución salina estéril (0,85% p / v) y se diluyeron en serie antes de sembrar en placas sobre agar selectivo para determinar el número total de transconjugantes y transconjugantes que todavía llevan el plásmido diana. Desplazamiento de F ’prolac se determinó de dos maneras: primero, extendiendo sobre medio M9 suplementado apropiadamente con y sin prolina para determinar el% de pérdida de fenotipo Pro + segundo, por crecimiento en agar L con IPTG y X-gal cuando la cepa diana adicionalmente portaba pUC18 (seleccionado para con Amp) para dar un fenotipo Lac + debido a la presencia del fragmento lacZ codificado por pUC18, de modo que la pérdida de F'Prolac dio un fenotipo Lac -. Al introducir el plásmido de curado por transformación, las bacterias diana se volvieron competentes mediante CaCl estándar2 el tratamiento y la transformación se realizaron con ADN pCURE purificado.

El ensayo de invasión no seleccionado se llevó a cabo mezclando repetidamente en membranas de nailon como lo describen Fox et al., [35]. Las bacterias donantes se mezclaron con la cepa diana para dar aproximadamente 10 6 donantes y 10 9 bacterias receptoras antes de esparcir 100 μl en un filtro de nitrocelulosa (25 mm de diámetro, 0,45 μm de tamaño de poro, EMD-Millipore, Darmstad, Alemania) en una placa de agar L. Después de 24 h de incubación a 37 ° C, las bacterias se resuspendieron en 1 ml de solución salina, se mezclaron a fondo y se diluyeron en serie para determinar tanto la transferencia como el curado. La suspensión sin diluir (100 µl) se extendió sobre una membrana de nailon nueva en una placa de agar L para iniciar el siguiente período de apareamiento.

Manipulación de plásmidos mini-RK2

Hacer derivados de pCT549 fue incómodo porque la inserción de EcoRI-BglII oriV fragmentos o fragmentos BglII-PacI en este plásmido resultó difícil. Para insertar EcoRI-BglII oriV fragmentos sin el casete antiF oriV El segmento se generó mediante PCR, se unió a pGEM-T Easy y se secuenció. El derivado de pGEMT y pCT549 se cortaron luego con BglII y se ligaron antes de la transformación en mi. coli C2110, que es deficiente en ADN polI, no permite la replicación del replicón pMB1 en el pGEM-T, seleccionando así cointegrantes que también contienen el replicón IncP que es independiente de PolI. Se comprobó el ADN plasmídico de los transformantes para determinar la orientación relativa de los segmentos unidos y se eligió el que podía cortarse con EcoRI y recircularizarse mediante ligación para reemplazar el antiguo. oriV con el nuevo.

Para insertar el casete antiF al lado oriV, los cebadores se diseñaron para colocar los sitios XbaI + EcoRI aguas abajo de oriV y sitios MfeI + PacI corriente arriba, donde BglII es normalmente. Después de clonar el MfeI-XbaI oriV en pGEM-T Easy y comprobando la secuencia se ligó con el derivado de pACYC184 pLAZ2 que se había cortado con EcoRI y XbaI. En pLAZ2, EcoRI define un extremo del casete antiF y el sitio XbaI está en el mismo lado separado por un brazo de homología y el sacB gene. El otro extremo del casete antiF en pLAZ2 está definido por un sitio BglII. Los extremos MfeI / EcoRI pueden unirse pero no regenerar ninguno de los sitios, por lo que esta construcción genera un BglII-antiF-PacI-oriV-Segmento EcoRI-XbaI y este se insertó en pCT549 como se describió anteriormente que implica el corte, ligación y transformación de BglII en C2110. El casete antiF se insertó de manera similar en el plásmido pRK2501 mini-RK2 que ya carecía korB.

Para quitar partes del korA-incC-korB-korF-korG-kfrABC región y restos de trbB cerca trfA, la PCR inversa se llevó a cabo en el casete antiF pCT549 + con cebadores que incorporan un sitio XbaI, ya que XbaI no corta el esqueleto de RK2 ni el casete antiF. La PCR de largo alcance se llevó a cabo con polimerasa Taq de alta fidelidad Q5 utilizando su diseño de cebador recomendado y las condiciones de eliminación korF-trbB, korB-trbB y incC-trbB. El producto se purificó, se cortó con XbaI, se recircularizó y se transformó en DH5α. Para eliminar incC pero no korB los korB orf fue amplificado y más el ΔkorF-trbB plásmido se ligaron después de cortar con XbaI (cortes aguas arriba de trbBp) y SphI que interrumpe incC.

Experimentos con ratones

Todos los procedimientos y experimentos de cuidado de animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Distrito de Salud Local de Western Sydney (protocolo 4276.08.17) de acuerdo con el 'Código de Prácticas de Australia para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos' y se llevaron a cabo esencialmente como descrito anteriormente [9]. Se alojaron ratones hembra BALB / c de cinco semanas de edad (Animal Resource Centre Perth, WA, Australia) en grupos de tres en jaulas de polipropileno M1 con tapa abierta (Able Scientific, Australia) en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h, con comida y agua. disponible ad libitum (Centro de Servicios Biológicos, Instituto Westmead de Investigación Médica). Cada tratamiento diferente involucró grupos de 3 ratones. Los ratones se aclimataron (d-6 a d0) antes de los experimentos, seguido de un rodaje (d1-d3) en la sala experimental para establecer la línea de base. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 h antes de que se les diera acceso al agua con sacarosa y luego se dispuso continuamente de alimentos normales. Los cultivos bacterianos que llevaban un plásmido se resuspendieron en agua con sacarosa (8%, p / v) a una DO600 de

0,4 ± 0,05 y se administró a ratones en días específicos y / o antibióticos (10–50 mg L -1) según corresponda. En los días especificados, cada ratón se transfirió brevemente a una caja de plástico separada para pesar y recoger heces frescas. Las heces (100 mg por ratón) se suspendieron en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), las diluciones se sembraron en CHROMagar con los antibióticos apropiados y las colonias se contaron después de la incubación O / N a 37 ºC. Periódicamente se recogieron 100 colonias en placas adicionales para determinar proporciones precisas de fenotipos de resistencia. PCR para detectar el replicón del plásmido IncK en Rif S mi. coli se realizó utilizando los cebadores AL_IncK_F y AL_IncK_R (Tabla S3). Las soluciones de heces de ratón (100 mg en 1 ml de solución salina) se diluyeron 1: 100 veces en agua y se usaron 3 μl como plantilla en 50 μl de reacción y mi. coli llevar pCT:aph se utilizó como control positivo. Al final del experimento se llevó a cabo una PCR para determinar si alguna pCT:aph El ADN plasmídico podría detectarse si eso no fuera evidente mediante placas directas. Los ratones fueron sacrificados por una sobredosis de CO2 inmediatamente después de la finalización de los experimentos.

Los grupos de ratones fueron los siguientes. Grupo 1 (grupo de control): recibieron alimentos y bebidas normales más agua de sacarosa cuando otros grupos la recibieron pero sin bacterias ni antibióticos. Grupo 2 (grupo de control de antibióticos): recibió alimentos y bebidas normales más agua de sacarosa con antibióticos cuando los grupos 3 y 4 recibieron antibióticos. Grupo 3 (grupo de control de colonización): recibido mi. coli AL1 (pCT:aph) en agua de sacarosa durante los días 3 a 5 más kanamicina durante los días 4 a 6, luego alimentos y agua normales durante el resto del experimento, control mi. coli AL1 (pCT:aph) en las heces hasta el final del experimento. Grupo 4 (curado grupo experimental A): recibido mi. coli AL1 (pCT:aph) en agua de sacarosa durante 3 días más Kan (3 días) como grupo 3, luego desafiado con mi. coli Nissle1917 (pCURE-K-307) durante los días 10-12 y Tet durante los días 11-13 y heces controladas para diferentes conjuntos de mi. coli (colonizador endógeno, cepas curadoras y desafiador). Grupo 5 (curado grupo experimental B): recibido mi. coli AL1 (pCT:aph) en agua de sacarosa durante 3 días más Kan (3 días), luego se desafió con mi. coli Nissle1917 (pCURE-K-307) durante 3 días pero sin antibióticos y heces controladas como se indicó anteriormente. Grupo 6 (curado grupo experimental C): recibido mi. coli AL1 (pCT:aph) en agua de sacarosa durante 3 días más Kan (3 días), luego se desafió con mi. coli Nissle1917 (pCURE-K-307) todos los días durante 8 días (d10-17) y heces monitoreadas como se indicó anteriormente.