Información

11.4: La glicosilación de proteínas ligadas a N comienza en el servicio de urgencias - Biología

11.4: La glicosilación de proteínas ligadas a N comienza en el servicio de urgencias - Biología


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

La glicosilación es una modificación importante de las proteínas eucariotas porque los residuos de azúcar añadidos se utilizan a menudo como indicadores moleculares o señales de reconocimiento para otras células que entran en contacto con ellas. Hay dos tipos de glicosilación de proteínas, y ambas requieren la importación del polipéptido diana en el RE. La glicosilación ligada a N en realidad comienza en el retículo endoplásmico, pero la glicosilación ligada a O no se produce hasta que el polipéptido ha sido transportado al aparato de Golgi. Por lo tanto, también es el caso de que la glicosilación ligada a N puede (y está) comenzando normalmente como un mecanismo de cotraducción, mientras que la glicosilación ligada a O debe tener lugar después de la traducción. Otras diferencias importantes en los dos tipos de glicosilación son (1) la glicosilación ligada a N ocurre en residuos de asparagina (N) dentro de una secuencia NXS o NXT (X es cualquier aminoácido que no sea P o D) mientras que la glicosilación ligada a O ocurre en el oxígeno hidroxilo de cadena lateral de residuos de serina o treonina determinado no por la secuencia circundante, sino por la estructura secundaria y terciaria; (2) La glicosilación ligada a N comienza con un "árbol" de 14 residuos de azúcares específicos que luego se podan y remodelan, pero sigue siendo bastante grande, mientras que la glicosilación ligada a O se basa en la adición secuencial de azúcares individuales, y generalmente no se extiende más allá algunos residuos.

Técnicamente, la N-glicosilación comienza incluso antes de que se traduzca una proteína, ya que el oligosacárido pirofosfato de dolicol (es decir, el "árbol" de azúcar, que no es un término oficial, por cierto) se sintetiza en el ER (Figura ( PageIndex {12} )) sin ser provocado por la traducción o la entrada de proteínas.

El dolichol es un hidrocarburo de cadena larga [entre 14-24 unidades de isopreno de 4 + 1 carbonos] que se encuentra principalmente en la membrana del RE y sirve como ancla temporal para el oligosacárido de N-glicosilación a medida que se sintetiza y espera una proteína apropiada para glicosilar. La síntesis de oligosacáridos comienza con la adición de dos residuos de N-acetilglucosamina al conector pirofosfato, seguido de una manosa. De esta manosa, el oligosacárido se ramifica, con una rama recibiendo tres residuos de manosa más y la otra recibiendo uno. Hasta ahora, todas estas adiciones al oligosacárido han tenido lugar en el citoplasma. Ahora el glicolípido es volteado hacia el interior de la luz de ER! Una vez en el lumen, se agregan cuatro manos más y finalmente tres residuos de glucosa rematan la estructura.

No todos los nucleósidos se utilizan para este proceso: los azúcares solo se han encontrado vinculados a UDP, GDP y CMP. UDP es la N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-acetilglucosamina (GlcNAc), ácido N-acetilmurámico, galactosa, glucosa, ácido glucurónico y xilosa más versátiles que se unen. El GDP se usa para manosa y fucosa, mientras que el CMP solo se usa para ácido siálico.

Las enzimas que realizan la glicosilación son glicosiltransferasas específico tanto para el residuo de azúcar añadido como para el oligosacárido diana. Los azúcares utilizados por las enzimas no son simplemente el azúcar, sino azúcares nucleotídicos, generalmente un azúcar unido a un nucleósido difosfato, por ejemplo, uracil difosfato glucosa (UDP-glucosa) o GDP-manosa.

El oligosacárido ligado a N tiene dos funciones fisiológicas: actúa como base para una glicosilación adicional y se utiliza como marcador para la verificación de errores del plegamiento de proteínas por parte del sistema calnexina-calreticulina (Figura ( PageIndex {13} ) ). Una vez que el oligosacárido se une al nuevo polipéptido, el proceso de glicosilación adicional comienza con la acción de una glucosidasa que elimina dos de las glucosas. La última glucosa es necesaria para ayudar a la glicoproteína a acoplarse con calnexina o calreticulina (Figura 13, paso 1 o 4), que son proteínas muy similares que tienen una actividad glucosidasa lenta y se asocian con una actividad similar a la isomerasa disulfuro de proteína.

La actividad similar a la de la disulfuro de isomerasa de la proteína proviene de ERp57, que técnicamente es una tiol oxidorreductasa, pero es funcionalmente similar a la PDI.

La principal diferencia es que la calreticulina es soluble en la luz del RE, mientras que la calnexina está unida a la membrana del RE. Ambos retienen temporalmente la glicoproteína dándole tiempo para (re) doblar y posiblemente reorganizar los enlaces disulfuro, luego elimina la glucosa, lo que permite que la glicoproteína continúe su camino. Es importante destacar que si la glicoproteína no se ha plegado completamente (paso 2a), la enzima UDP-glucosa: glicoproteína glucosiltransferasa (GT) la reconoce y agrega el residuo de glucosa (paso 3), lo que la obliga a pasar nuevamente por el ciclo de calreticulina / calnexina. con la esperanza de plegarse correctamente esta vez. Si se ha plegado correctamente (paso 2b), puede ser reconocido por ER-α-1,2-manosidasa, que elimina una manosa, completando las modificaciones de glicosilación en el RE.

La mayoría de las glicoproteínas continúan con la remodelación de oligosacáridos una vez que se han movido desde el RE al aparato de Golgi por transporte vesicular. Allí, una variedad de glicosidasas y glicosiltransferasas podan y agregan al oligosacárido. Aunque la glicosilación es consistente y estereotipada para una proteína dada, todavía no está claro exactamente cómo se determinan los patrones de glicosilación.

Dos antibióticos comunes, tunicamicina y bacitracina, pueden atacar la glicosilación ligada a N, aunque sus propiedades antibióticas provienen de interrumpir la formación de las paredes celulares bacterianas. La tunicamicina es un análogo de UDP-GlcNAc, y dentro de las células eucariotas puede interrumpir la formación inicial de oligosacáridos bloqueando la adición inicial de GlcNAc al dolicol-fosfato. Dado que se puede transportar a las células eucariotas, la tunicamicina no es clínicamente útil debido a su toxicidad. La bacitracina, por otro lado, es un pequeño polipéptido cíclico que se une al dolichol-PP evitando su desfosforilación a dolichol-P, que es necesario para construir el oligosacárido. La bacitracina no es permeable a las células, por lo que aunque tiene una actividad similar a la tunicamicina en las bacterias al interrumpir la síntesis de glicolípidos extracelulares necesaria para la formación de la pared celular, es inofensiva para los eucariotas y, por lo tanto, es un antibiótico terapéutico útil.


Biotecnología industrial y productos básicos

Abstracto

La glicosilación de proteínas es una modificación postraduccional compleja que manipula la actividad biológica y la función de las glicoproteínas terapéuticas. Hasta la fecha, se han descrito en la literatura una gran cantidad de funciones relacionadas con la composición de glucanos: desde la solubilidad, la estabilidad, la localización celular, el tráfico molecular, el autorreconocimiento, el aclaramiento, el transporte, la inmunogenicidad y la vida media circulante. Más recientemente, la composición de glicanos ha sido objeto de modificación para mejorar la seguridad y eficacia de las terapias de glicoproteínas. Estos vínculos entre la naturaleza compleja de los glucanos y sus funciones asociadas han generado serias preocupaciones dentro de las autoridades reguladoras de medicamentos en todo el mundo. Los glicanos son la clase de moléculas más compleja y heterogénea debido a su proceso biosintético no impulsado por molde, lo que dificulta la caracterización de los glicanos. No existe un método universal disponible que pueda caracterizar la estructura de glicoproteína intacta completa; es esencial aplicar varios métodos ortogonales para medir parámetros individuales como el análisis del sitio de glicosilación, la secuencia de oligosacáridos y el contenido de monosacáridos de una glicoproteína terapéutica. En este artículo, discutimos varios enfoques y estrategias glicoanalíticos de última generación para evaluar la estructura y función de la glicoproteína total.


Introducción

Los glicanos están presentes en las células como uniones covalentes a otras moléculas como proteínas (glicoproteínas) o lípidos (glicolípidos), aunque los glicanos aislados también pueden unirse a proteínas como ligandos 1,2,3. Estos glicanos se han relacionado con un número creciente de procesos biológicos importantes 4. Los dos enlaces glicosídicos principales a las proteínas involucran nitrógeno en la cadena lateral de la asparagina (norte-glicanos enlazados) 5 u oxígeno en la cadena lateral de serina o treonina (O-glicanos enlazados) 6. Los gangliósidos que contienen ácido siálico son un tipo de glicosilación de lípidos 7. Además, las proteínas se pueden unir a la superficie de la membrana mediante un enlace entre el grupo carboxilo-terminal y un anclaje de glucofosfatidilinositol (GPI) 8.

La glicosilación de proteínas es una de las modificaciones postraduccionales más importantes en la célula y se espera que más de la mitad de todas las proteínas en la naturaleza estén glicosiladas 9. norteLa glicosilación ligada es un proceso químico en el que la oligosacariltransferasa cataliza la en bloque político transferencia de la porción de oligosacárido de un oligosacárido ligado a lípidos (LLO) al aceptor asparagina de proteínas nacientes, definido por la secuencia de consenso Asn-X-Thr / Ser (X ≠ Pro) 10,11,12. Luego, la estructura de glicanos unida a proteínas se procesa adicionalmente y se deriva químicamente. Por otra parte, OLa glicosilación ligada comienza con la adición de un solo monosacárido GalNAc (por un norte-acetilgalactosaminiltransferasa) a serina / treonina en un sitio que no tiene un motivo de secuencia bien definido y esta GalNAc puede alargarse o modificarse aún más 13.

Modificaciones de proteínas por norte- o O-glicanos modulan las propiedades biofísicas de la proteína y, en consecuencia, regulan la función de la proteína nativa codificada por el genoma 14. Numerosos experimentos han revelado que la glicosilación puede alterar las características termodinámicas, cinéticas y estructurales de las proteínas, confiriendo un contenido de información adicional más allá de lo que dicta su secuencia 15. norteLa glicosilación ligada es quizás la modificación de proteína más compleja químicamente y ubicua en todos los eucariotas [11]. Los carbohidratos hidrófilos grandes adheridos a las proteínas han sido implicados en una miríada de procesos biológicos, incluida la modificación del plegamiento de proteínas 16, la modulación de la estabilidad de las proteínas, la oligomerización y la agregación 15,17, el control de calidad del retículo endoplásmico (RE) y el tráfico de proteínas 18, la célula huésped -interacciones superficiales 19 y modulación de la actividad enzimática 20.

Existe un interés considerable en el desarrollo de enfoques generales para predecir las consecuencias estructurales de la glicosilación específica del sitio y para comprender cómo estos efectos pueden explotarse en el diseño de proteínas con propiedades ventajosas. Este conocimiento es esencial para desarrollar terapias de glicoproteínas en la medicina moderna 21. En este estudio, los impactos de norte-glicanos en las glicoproteínas plegadas se investigan en términos de estructura y dinámica de proteínas en sus formas glicosiladas y desglicosiladas utilizando un enfoque computacional integrado del análisis de estructura del Protein Data Bank (PDB) y simulaciones de dinámica molecular atomística (MD). Nuestro estudio revela que norte-glucosilación no induce cambios globales / locales significativos en la estructura de la proteína, pero disminuye la dinámica de la proteína, lo que probablemente conduce a un aumento en la estabilidad de la proteína.


DESCUBRIMIENTO Y ANTECEDENTES

El enlace GlcNAc & # x003b21 & # x02013Asn se descubrió mediante análisis bioquímicos de ovoalbúmina. La secuencia de aminoácidos mínima para recibir un N-glicano es Asn-X-Ser / Thr en la que & # x0201cX & # x0201d es cualquier aminoácido excepto Pro. Sin embargo, no todos los residuos de Asn en este sequon están N-glicosilados, como se analiza a continuación. Otros enlaces a Asn incluyen Glc a Asn en laminina de mamíferos, la capa S en Archaea y adhesinas en algunas bacterias Gram-negativas, GalNAc y GlcNAc a Asn en Archaea y ramnosa o bacilosamina a Asn en bacterias. En una glicoproteína de maíz dulce, Arg se encuentra en enlace N a Glc.

La síntesis de N-glicanos comienza en una molécula de poliisoprenoide similar a un lípido denominada dolicol-fosfato (Dol-P) en eucariotas. Tras la síntesis de un oligosacárido que contiene hasta 14 azúcares, el N-glicano se transfiere & # x0201cen bloc & # x0201d a la proteína. Esta vía sintética se conserva en todos los metazoos, plantas y levaduras. Las bacterias utilizan mecanismos relacionados para sintetizar la pared celular (capítulo 21). Los N-glicanos afectan muchas propiedades de las glicoproteínas, incluida su conformación, solubilidad, antigenicidad, actividad y reconocimiento por las proteínas de unión a glicanos. La introducción de un sitio de N-glicano (Asn-X-Ser / Thr) se usa como método para localizar u orientar una glicoproteína o para seguir su movimiento a través de la célula. Los defectos en la síntesis de N-glicanos conducen a una variedad de enfermedades humanas (capítulo 45).


Plegamiento y ensamblaje de proteínas en el retículo endoplásmico

La proteína recién sintetizada que emerge a través de la membrana del RE entra en un entorno único para el plegado y ensamblaje. A diferencia del citosol, el ER proporciona un ambiente oxidante, tiene altos niveles de calcio y contiene enzimas para la glicosilación ligada a N. La cadena polipeptídica naciente en crecimiento se modifica en muchos casos de manera cotraduccional con azúcares ligados a N y comienza a plegarse mientras aún está unida al ribosoma. La formación de enlaces disulfuro estabiliza la estructura terciaria de la proteína. El plegamiento y ensamblaje in vivo de proteínas nacientes requiere un delicado equilibrio entre permitir que se produzca el plegamiento y prevenir interacciones incorrectas que, en última instancia, conducirían a un plegamiento y / o agregación inadecuados. En los últimos años, se han identificado y caracterizado dos grupos de proteínas que interactúan transitoriamente con proteínas ensambladas y plegadas de forma incompleta en el RE. El primer grupo consta de enzimas que promueven o estabilizan el plegamiento de proteínas. El segundo está compuesto por proteínas denominadas "chaperonas moleculares" que se unen transitoriamente a polipéptidos nacientes y aparentemente previenen el plegamiento incorrecto enmascarando aquellas regiones que podrían conducir a interacciones incorrectas entre dominios o agregación de proteínas.


Recursos de productos relacionados

La estructura de la proteína está determinada por la secuencia de aminoácidos que componen la proteína y cómo la proteína se pliega en formas más complejas.

  • Estructura primaria se define por la secuencia de aminoácidos de la proteína.
  • Estructura secundaria se define por interacciones locales de tramos de la cadena polipeptídica, que pueden formar hélices α y láminas β a través de interacciones de enlace de hidrógeno.
  • Estructura terciaria define la estructura tridimensional general de la proteína.
  • Estructura cuaternaria define cómo interactúan múltiples subunidades de proteínas para formar complejos más grandes.

Abstracto

La biosíntesis de glicoproteínas unidas a asparagina utiliza un donante de glicosilo unido a dolichilpirofosfato (Dol-PP-GlcNAc2Hombre9Glc3), que se ensambla mediante la serie de glicosiltransferasas unidas a la membrana que comprenden la vía del dolicol. Esta vía biosintética está altamente conservada a lo largo de la evolución eucariota. Si bien los enfoques genéticos y bioinformáticos complementarios han permitido la identificación de la mayoría de las enzimas de la vía del dolicol en Saccharomyces cerevisiae, las funciones de dos de las manosiltransferasas en la vía, Alg2 y Alg11, han permanecido ambiguas porque estas enzimas parecen catalizar sólo dos de las cuatro transformaciones restantes no anotadas. Para abordar este problema, se adoptó un enfoque bioquímico utilizando Alg2 recombinante y Alg11 de S. cerevisiae y sustratos definidos unidos a dolichilpirofosfato. Una fracción de membrana celular aislada de Escherichia coli Se usó la sobreexpresión de Alg2 marcado con tiorredoxina para demostrar que esta enzima realmente lleva a cabo una α1,3-manosilación, seguida de una α1,6-manosilación, para formar el primer intermedio de pentasacárido ramificado de la ruta. Luego, utilizando Alg2 marcado con tiorredoxina para la síntesis quimioenzimática del pentasacárido de dolichilpirofosfato, fue posible definir la función bioquímica de Alg11, que es catalizar las dos siguientes α1,2-manosilaciones secuenciales. La elucidación de la función dual de cada una de estas enzimas completa así la identificación del conjunto completo de glicosiltransferasas que comprenden la vía del dolicol.

Este trabajo fue apoyado en su totalidad por el NIH Grant GM68692.

A quién debe dirigirse la correspondencia. Teléfono: 1-617-253-1838. Fax: 1-617-452-2419. Correo electrónico: [email & # 160protected]


Ver el vídeo: C-glicosilación (Febrero 2023).