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F7. Enlaces y referencias - Biología

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F7. Enlaces y referencias

La reducción del SMN específico del músculo revela enfermedad independiente de la motoneurona en modelos de atrofia muscular espinal

2 Centro de Biología y Enfermedad de las Neuronas Motoras, Centro Médico de la Universidad de Columbia, Nueva York, Nueva York, EE. UU.

3 Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad del Sur de California, Los Ángeles, California, EE. UU.

4 Departamento de Neurología y

5 Departamento de Pediatría, Centro Médico de la Universidad de Columbia, Nueva York, Nueva York, EE. UU.

6 Departamento de Farmacología y Fisiología, Centro Médico de la Universidad de Rochester, Rochester, Nueva York, EE. UU.

Envíe la correspondencia a: Umrao R. Monani, P & ampS, Room 5-422, 630 W.168th Street, Nueva York, Nueva York 10032, EE. UU. Teléfono: 212.342.5132 Correo electrónico: [email protected]

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Publicado el 10 de febrero de 2020 - Más información

La escasez de la proteína de la neurona motora de supervivencia (SMN) desencadena el trastorno de la neurona motora de aparición infantil, a menudo fatal, la atrofia muscular espinal (AME). El aumento de la proteína es un medio de tratar la AME y recientemente llevó a la aprobación de la FDA de un oligonucleótido potenciador de SMN administrado intratecalmente que se usa actualmente. A pesar del advenimiento de esta y otras terapias para la AME, no está claro si la parálisis asociada con la enfermedad se deriva únicamente de neuronas motoras disfuncionales que pueden ser dirigidas de manera eficiente por la administración restringida de agentes que mejoran la SMN al sistema nervioso, o si proviene de defectos más amplios. de la unidad motora, argumentando a favor de la repleción sistémica de SMN. Investigamos los efectos que contribuyen a la enfermedad de un SMN bajo en un órgano periférico relevante, el músculo esquelético, al agotar selectivamente la proteína solo en este tejido. Descubrimos que el músculo privado de SMN estaba profundamente dañado. Aunque el fenotipo de la enfermedad no fue obvio de inmediato, los niveles bajos persistentes de la proteína eventualmente dieron como resultado defectos en las fibras musculares, anomalías en la unión neuromuscular, rendimiento motor comprometido y muerte prematura. Es importante destacar que la restauración del SMN después del inicio de la patología muscular revirtió la enfermedad. Nuestros resultados proporcionan la evidencia más convincente hasta el momento de un papel de contribución directa del músculo en la AME y argumentan que se debe diseñar una terapia óptima para la enfermedad para tratar este aspecto de la unidad motora disfuncional.

Mutaciones homocigotas en la supervivencia de la neurona motora 1 (SMN1) resultan en niveles reducidos de la proteína SMN y desencadenan la enfermedad neuromuscular de inicio infantil, atrofia muscular espinal (SMA) (1 - 3). La pérdida completa de SMN es letal para el embrión (4). De hecho, los pacientes con AME expresan invariablemente proteína residual de un SMN1 paralogue llamado SMN2. La incapacidad de SMN2 para compensar SMN1 proviene de una transición silenciosa C → T en el exón 7 del parálogo. El cambio de base única altera la eficiencia con la que el exón 7 se empalma en las transcripciones de SMN de manera que SMN2 expresa principalmente una isoforma SMNΔ7 (5, 6). El ARNm de SMNΔ7 se expresa abundantemente. Sin embargo, la proteína truncada correspondiente es inestable y está degradada (2, 3, 7). Aún así, la expresión de niveles bajos de la proteína FL-SMN de SMN2 es suficiente para asegurar el desarrollo embrionario y los nacidos vivos. Por el contrario, el desarrollo posnatal temprano, en particular el del sistema neuromuscular, se ve profundamente afectado en ausencia de SMN1. En consecuencia, la mayoría de los pacientes con AME desarrollan rápidamente un fenotipo paralítico cuyas características distintivas incluyen pérdida de neuronas motoras espinales y atrofia muscular proximal (8). Teniendo en cuenta la función de mantenimiento de la proteína SMN en la orquestación de la cascada de empalme (9), la pérdida selectiva de neuronas motoras en la AME permanece en gran parte sin explicación.

Aunque la mayoría de los pacientes con AME se ven gravemente afectados, existe un espectro de fenotipos que se extiende a una enfermedad verdaderamente leve. La AME leve generalmente se asocia con un mayor número de SMN2 copias (10, 11). De hecho, en un caso, un paciente con 8 SMN2 las copias fueron supuestamente asintomáticas (12). El efecto modificador de la enfermedad de SMN2 copias, y por lo tanto la proteína SMN, se demostró posteriormente directamente en ratones modelo nulos para murino Smn pero albergando 8 copias del SMN2 gen (13). El fenotipo WT de tales ratones proporcionó la primera justificación real para apuntar SMN2 para aumentar la proteína SMN como medio para un tratamiento. Los esfuerzos para implementar esta estrategia se reforzaron aún más cuando se demostró que un elemento regulador, ISS-N1, aguas abajo de SMN2 el exón 7 podría dirigirse eficazmente para aumentar los niveles de FL-SMN (14, 15). El resultado del tratamiento de ratones modelo SMA gravemente afectados con oligonucleótidos de conmutación de empalme (SSO) dirigidos al elemento regulador fue notable. La administración oportuna de los niveles terapéuticos de SMN mejorados con oligo restauró la función neuromuscular y prolongó enormemente la supervivencia (16, 17). El SSO utilizado para apuntar a ISS-N1 y modular SMN2 La expresión génica se desarrolló finalmente en el fármaco terapéutico SMA, Spinraza (18).

A pesar de la promesa clínica de Spinraza, abundan las preguntas sobre su eficacia a largo plazo (19, 20). Una preocupación principal proviene de los requisitos espaciales para la proteína SMN y la forma en que se administra actualmente el fármaco, por vía intratecal. Se espera que tal forma de tratamiento dé como resultado una restauración robusta de la proteína SMN en el tejido del SNC. Sin embargo, los órganos periféricos, incluido el músculo, permanecerían privados de los posibles efectos beneficiosos de las concentraciones normales de proteínas. Que los niveles bajos de SMN tienen efectos disruptivos más allá de las neuronas motoras es cada vez más evidente (21, 22). De particular interés, debido al fenotipo de SMA decididamente neuromuscular, es el potencial de tales efectos en el músculo y su contribución a la enfermedad en general. Los estudios para evaluar el papel contribuyente del músculo en la AME han llegado a conclusiones dispares (23 - 30). Aquí, nos hemos comprometido a resolver la incertidumbre de la manera más directa al caracterizar las consecuencias de la enfermedad de privar selectivamente al músculo de SMN. Usando modelos de ratones que se agotaron selectivamente de la proteína en el músculo esquelético, pero que, sin embargo, fueron diseñados para expresar 1 o 2 copias de la SMN2 gen, un genotipo típico y severo de SMA, demostramos que un SMN bajo en este tejido era profundamente dañino. En animales con un solo SMN2 copia, la aparición de la enfermedad fue rápida, con una mediana de supervivencia de aproximadamente P21. Por el contrario, la enfermedad en animales portadores de 2 copias del SMN2 El gen apareció tarde, pero sin embargo dio como resultado una amplia gama de fenotipos musculares, incluido el daño morfológico de las miofibras y las uniones neuromusculares (NMJ), un rendimiento motor deficiente y una incapacidad para generar fuerza muscular de manera óptima. Similar a la enfermedad en mutantes con 1 copia de SMN2, estos defectos eventualmente acortaron la vida útil a aproximadamente 13 meses. A pesar de estos defectos, la restauración de SMN en el músculo esquelético de ratones sintomáticos resultó beneficiosa. Concluimos que el músculo es un sitio de acción celular crítico de la proteína SMN y que la proteína que expresa a partir de 1 o 2 copias del SMN2 gen es insuficiente para prevenir la aparición de un fenotipo muscular autónomo de células severo. Nuestros resultados implican que los regímenes de tratamiento que mejoran el SMN más óptimos para la AME serán aquellos que restauran la proteína en el músculo esquelético.

MyoD-iCre produce una inactivación robusta y específica del músculo del alelo Smn F7. Para investigar los efectos autónomos de las células del agotamiento del SMN en el músculo esquelético, comenzamos probando cuál de los 2 impulsores de Cre muscular, MyoD-iCre y Myf5-Cre (31, 32), se adaptaba mejor a nuestros estudios. Cada uno impulsa la expresión en las células progenitoras del músculo desde E8 (33 - 35) y se ha utilizado para agotar o restaurar selectivamente las proteínas relacionadas con la enfermedad en el músculo esquelético (27, 36). Para determinar la especificidad tisular de las 2 líneas Cre, criamos por separado los ratones transgénicos con animales que albergan un inducible Smn alelo de deleciónSmn F7 ) con sitios loxP a ambos lados del exón 7 (37, 38). Luego usamos PCR para examinar cuál de los tejidos de los transgénicos dobles exhibían evidencia de recombinación mediada por Cre. Como era de esperar, detectamos la presencia del alelo eliminado (Δ7) en los músculos proximales y distales de cada uno de los dobles transgénicos MyoD-iCre Smn F7 y Myf5-Cre Smn F7 animales (Figura 1A). Sin embargo, y en consonancia con otros informes (27, 39), mientras que la recombinación del Smn F7 alelo estaba restringido al músculo esquelético de la MyoD-iCre Smn F7 ratones, también se detectó en el tejido del SNC de la Myf5-Cre Smn F7 animales, este último hallazgo excluyó la línea Myf5-Cre para este estudio. No obstante, procedimos a cuantificar la eficiencia relativa con la que cada uno de los impulsores Cre efectuó Smn F7 inactivación en el músculo esquelético. Para medir directamente la robustez con que cada uno de los controladores convirtió el Smn F7 alelo al eliminado Smn Δ7 forma, utilizamos Q-PCR en ADN genómico del músculo esquelético de P7 MyoD-iCre Smn F7 / + y Myf5-Cre Smn F7 / + animales, y niveles relativos estimados de residuos Smn F7 alelo en cada conjunto de mutantes. ADN del tejido muscular del MyoD-iCre Smn F7 / + Los ratones contenían niveles más bajos de Smn F7 alelo que el ADN del músculo de Myf5-Cre Smn F7 / + ratones (Figura 1B), lo que sugiere que MyoD-iCre es más robusto para inactivar el alelo floxed.

Inactivación robusta y específica de los músculos del Smn F7 alelo con MyoD-iCre. (A) Análisis por PCR de ADN genómico de tejido de ratones que albergan el Smn F7 alelo y MyoD-iCre o Myf5-Cre. El inactivado Smn Δ7 El alelo solo se detecta en el músculo de los ratones MyoD-iCre, mientras que se ve en las localizaciones ectópicas de los transgénicos Myf5-Cre. (B) Datos de Q-PCR que comparan la eficiencia de Smn F7 inactivación en músculo de ratones con controlador MyoD-iCre o Myf5-Cre. **PAG & lt 0.01, t prueba, norte ≥ 4 ratones de cada cohorte. (C) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de Myf5-Cre Smn F7 / - y MyoD-iCre Smn F7 / - ratones. PAG & lt 0,01 entre grupos, prueba de rango logarítmico.

Como segundo medio indirecto para determinar la eficiencia de la recombinación, establecimos cruces para generar MyoD-iCre Smn F7 / - y Myf5-Cre Smn F7 / - mutantes. En tales mutantes, se espera que la proteína SMN sea completamente ablacionada en las células musculares si Smn F7 se convierte en Smn Δ7 . Dado que dicha ablación es incompatible con la supervivencia de la célula y, por tanto, del organismo (4), la incidencia relativa de las respectivas Cre Smn F7 / - mutantes y la gravedad de la enfermedad en cualquier animal resultante, según la evaluación de la esperanza de vida, es una medida indirecta pero sensible de la eficiencia de la recombinación en el Smn F7 alelo. Dada la conversión menos que completa de Smn F7 para Smn Δ7 , como se detectó en nuestros experimentos de PCR, no nos sorprendió obtener vivos y / o nacidos muertos Smn Δ7 / - mutantes que llevan cada uno de los controladores Cre. Sin embargo, de acuerdo con nuestros resultados de Q-PCR que sugieren que MyoD-iCre produce una recombinación superior, el análisis de χ 2 indicó significativamente menos de lo esperado MyoD-iCre Smn F7 / - mutantes al nacer. A diferencia de, Myf5-Cre Smn F7 / - los mutantes y sus compañeros de camada nacieron con las frecuencias previstas (Tabla complementaria 1 material complementario disponible en línea con este artículo https://doi.org/10.1172/JCI131989DS1). Además, mientras que la preponderancia (

90%) de MyoD-iCre Smn F7 / - Los mutantes nacieron muertos o murieron en P0, aproximadamente el 75% de los Myf5-Cre Smn F7 / - los ratones no solo vivieron hasta la edad adulta, sino que también se reprodujeron vigorosamente solo 2 MyoD-iCre Smn F7 / - los mutantes vivieron más allá de P1 y ninguno sobrevivió más allá de P30 (Figura 1C). En conjunto, los datos sugirieron que la línea transgénica MyoD-iCre constituye un impulsor más robusto que su contraparte Myf5-Cre y, por lo tanto, es una elección más prudente de reactivo con el que evaluar los efectos autónomos de la célula de baja expresión de SMN en el músculo. En una confirmación final de nuestra elección del controlador MyoD-iCre con el que agotar el SMN en el músculo, generamos ratones ROSA-YFP (40) con o sin el transgén Cre. Como era de esperar, detectamos una fuerte señal de YFP en la mayoría de las fibras musculares de MyoD-iCre ROSA-YFP, pero no ROSA-YFP animales (Figura suplementaria 1A). La fluorescencia de YFP no se detectó en la médula espinal, el cerebro o el tejido hepático de los ratones MyoD-iCre ROSA-YFP (Figura complementaria 1B). En consecuencia, los estudios restantes se realizaron utilizando el MyoD-iCre línea.

Se observa una enfermedad grave de inicio rápido en mutantes de SMN2 de copia única con depleción de SMN en el músculo. La ablación tisular completa de SMN interrumpe la biogénesis de snRNP y, por lo tanto, es letal (4). Además, una ablación completa de SMN no logra modelar fielmente la AME humana, en la que los niveles residuales de la proteína se derivan de 1 o más SMN2 copias.En consecuencia, para generar mutantes que expresan SMN residual solo en el músculo esquelético, criamos ratones portadores de SMA homocigotos para el SMN2 transgén (13) y heterocigoto para el controlador MyoD-iCre (MyoD-iCre SMN2 + / + Smn +/– ) con Smn F7 / F7 animales. MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - Se obtuvieron mutantes con la frecuencia esperada del 12,5%, pero exhibieron un fenotipo manifiesto, según la evaluación del peso corporal, dentro de las 24 horas posteriores al nacimiento (Figura 2, A y B). Los mutantes también exhibieron movimiento reducido, fallaron en una prueba de rendimiento motor (Figura 2C y video complementario 1) y estaban moribundos en aproximadamente P14. Con frecuencia se los encontró demacrados, desaliñados y con signos de dificultad para respirar (Video complementario 2). La mediana de supervivencia se redujo a alrededor de P21 (Figura 2D). Como era de esperar, los niveles de la proteína SMN en el tejido del músculo esquelético de los mutantes P7 fueron significativamente más bajos y menos de la mitad de los niveles de proteína en los ratones portadores SMA de una línea comúnmente empleada (41) de mutantes severos (tipo 1) (Figura 2, E y F). Llegamos a la conclusión de que los mutantes expresaron aproximadamente el 25% de la proteína WT SMN y que el fenotipo de enfermedad manifiesta observado fue de hecho una consecuencia de la reducción selectiva de la proteína en el tejido muscular de los animales.

Enfermedad grave de inicio temprano en MyoD-iCre Smn F7 / - mutantes que llevan 1 SMN2 Copiar. (A) El gráfico muestra la reducción del peso de los mutantes. t prueba, norte ≥ 10 ratones de cada conjunto. (B) Un compañero de camada mutante y control típico que refleja el tamaño más pequeño del primero. (C) Los mutantes rinden mal en una prueba de reflejo de enderezamiento t prueba, norte ≥ 10 ratones de cada cohorte. (D) Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier representan una vida útil reducida de los mutantes. PAG & lt 0,0001 entre grupos, prueba de rango logarítmico, norte = 25 ratones de cada grupo. (mi) Western blot mostró proteína SMN reducida en el músculo esquelético de un MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - mutante. (F) Niveles relativos de SMN en el músculo esquelético de los mutantes y controles relevantes ANOVA de 1 vía, norte ≥ 3 ratones de cada cohorte. (GRAMO) Las fibras de los músculos respiratorios y de las extremidades tienen un tamaño notablemente reducido en los mutantes P15 t prueba, norte ≥ 600 fibras de norte = 3 ratones de cada cohorte. (H) Secciones transversales teñidas con H & ampE de músculos intercostales de un mutante P15 y control que muestran pérdida de tejido, y fibras con núcleos centrales (flechas) en el primero. Barra de escala: 20 μm. Cuantificación de (I) núcleos centrales y (J) número de fibras en el músculo intercostal de mutantes P15 y controles. t prueba, norte = 3-5 ratones de cada grupo. *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001 para todos los análisis.

Teniendo en cuenta el fenotipo manifiesto severo, de inicio rápido y los efectos bien conocidos del agotamiento sistémico de la proteína SMN en la unidad motora, a continuación examinamos el MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - mutantes para evidencia de patología neuromuscular. Primero evaluamos la morfología de las fibras musculares en los músculos representativos distales (gastrocnemio), proximales (tríceps) y respiratorios (intercostales). Las áreas de miofibras en los mutantes se redujeron en los 3 músculos a las 2 o 3 semanas de edad (Figura 2G y Figura complementaria 2, A – C). Un análisis más detallado de los músculos intercostales en P15 demostró que esta anomalía estaba acompañada de una patología degenerativa distinta caracterizada por áreas desprovistas de fibras musculares y que a menudo albergan infiltrados de monocitos o macrófagos, y un número significativo de miofibras que contienen núcleos centrales anormalmente localizados (Figura 2, H y yo). La cuantificación de las miofibras indicó que aproximadamente un tercio de las células en este músculo respiratorio se había perdido (Figura 2J), un origen probable de disfunción severa del músculo, dificultad para respirar (ver también Video complementario 2) y eventual muerte del mutante animales. Curiosamente, estos defectos fueron menos significativos en P7, pero, no obstante, sugirieron una degeneración postnatal del músculo en el MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - mutantes (Figura complementaria 2, D – F). Además, las anomalías se restringieron al músculo esquelético porque un examen del músculo cardíaco, en el que no se expresa MyoD-iCre, no pareció diferente en los mutantes y controles según lo determinado por el área de miofibras y el grosor de la pared del ventrículo izquierdo (Figura complementaria 2, G – I).

SMA se define por la pérdida de neuronas motoras. El agotamiento selectivo del SMN en estas células es suficiente para desencadenar su pérdida (42), pero no se ha examinado el papel del músculo enfermo en el proceso neurodegenerativo. Por lo tanto, cuantificamos y caracterizamos los somas de neuronas motoras en nuestro MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - mutantes. Los recuentos de cuerpos celulares indicaron que a pesar de un SMN bajo en el músculo, no hubo pérdida de las neuronas motoras espinales (Figura 3, A y B). Además, no encontramos evidencia de tinción reducida de SMN en el soma de las neuronas motoras ni una disminución en el número de gemas, focos subnucleares en los que se localiza la proteína (Figura 3, C-E y ref. 43).

NMJ defectos en MyoD-iCre Smn F7 / - mutantes con 1 copia del SMN2 gene. (A) Secciones transversales de la médula espinal lumbar (L1-L3) de un mutante P21 y control. Barra de escala: 25 μm. Resultados cuantificados de (B) recuentos de neuronas motoras espinales (L1-L3, T7-T10, C5-C6) (C) Intensidad de la señal SMN en las neuronas motoras (D) recuentos de gemas nucleares en las neuronas motoras de los ratones. NS: PAG & gt 0,05, t prueba, norte & gt 150 celdas y norte = 4 ratones de cada grupo. (mi) Una neurona motora lumbar de un mutante que muestra una señal SMN robusta y la presencia de gemas nucleares (flechas). Barra de escala: 8 μm. (F) NMJ en los músculos intercostales de ratones mutantes y de control. Se incluyen imágenes de gran aumento de placas terminales típicas de cada animal que ilustran la complejidad reducida y la presencia de varices terminales ingurgitadas con NF (flechas) en el mutante. Barras de escala: 50 μm y 15 μm, respectivamente. Gráficos de (GRAMO) Complejidad NMJ, (H) tamaño de la placa terminal y (I) Morfología de NMJ en mutantes P21 y controles. **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001, t prueba, norte ≥ 100 NMJ de norte ≥ 3 ratones de cada grupo. (J) La expresión de la proteína atrógena en mutantes y controles mostró pocos cambios en estos marcadores de denervación. NS: PAG & gt 0,05, t prueba, norte = 3 ratones.

Aunque la enfermedad que se origina en el músculo puede no afectar la motoneurona proximal, la miopatía crónica altera el compartimento postsináptico y finalmente compromete la morfología y función de la sinapsis neuromuscular (44). Además, no está claro si un SMN bajo en el músculo contribuye o agrava los defectos de NMJ observados en la AME. En consecuencia, llevamos a cabo un cuidadoso análisis morfológico de los NMJ en nuestros mutantes. Encontramos que los grupos de receptores de acetilcolina (AChR) en los 3 músculos de los mutantes P17-P21 habían adquirido la estructura típica de pretzel de las NMJ maduras (Figura 3F). Sin embargo, una evaluación cuidadosa de sus complejidades relativas basada en el número de perforaciones en los grupos indicó que aunque las placas terminales en el gastrocnemio y el tríceps no eran diferentes entre mutantes y controles, las del intercostal eran menos elaboradas en los mutantes (Figura 3G). Además, de acuerdo con el tamaño más pequeño del músculo mutante, se encontró que los grupos en los 3 músculos eran relativamente diminutos (Figura 3, F y H). Un examen de las terminales nerviosas de los músculos en los ratones mutantes reveló un aumento en las varices inflamadas con proteína neurofilamento (NF), una característica que recuerda los defectos observados en ratones modelo que expresan proteína SMN sistémicamente baja (refs. 45-48 y Figura 3I). Sin embargo, no se detectó evidencia de denervación ni en los estudios inmunohistoquímicos de la NMJ ni al cuantificar los atrogenes, atrogina-1 y MuRF1, que se regulan positivamente de forma rutinaria en el músculo denervado (Figura 3J). Aún así, los defectos observados en combinación con la patología muscular y el fenotipo manifiesto de la MyoD-iCre SMN2 +/– Smn F7 / - los mutantes nos llevan a 2 conclusiones. Primero, los resultados sugieren que un SMN bajo en el músculo esquelético es suficiente para causar enfermedad. En segundo lugar, demuestran que la patología que se origina en el músculo es capaz de desencadenar, muy probablemente de forma retrógrada, anomalías en los nervios. En consecuencia, la escasez de SMN en el músculo actúa tanto de forma autónoma como no autónoma para contribuir a los defectos celulares y al fenotipo general de la AME.

La miopatía se desenmascara después de una lesión muscular en mutantes jóvenes fenotípicamente normales que portan 2 copias de SMN2. AME en pacientes y ratones modelo que albergan una sola SMN2 La copia constituye la forma más grave (tipo 0) de la enfermedad posible y, a menudo, provoca la muerte en el útero (49 - 51). Por tanto, la prevalencia de esta forma de la enfermedad es baja (52) y la gravedad del fenotipo en MyoD-iCre Smn F7 / - mutantes hemicigóticos para el SMN2 transgene tal vez no sea inesperado. Para determinar los efectos de expresar SMN en el músculo de los mutantes a partir de 2 copias del gen, una situación más común entre los pacientes humanos con AME, generamos ratones homocigotos para SMN2 (MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - ).

En contraste con el inconfundible fenotipo de inicio rápido discernido en los mutantes MyoD-iCre que albergan un solo SMN2 copia, solo detectamos anomalías sutiles en ratones adultos jóvenes que expresan 2 copias del gen. Así, por ejemplo, aunque los últimos mutantes exhibieron un peso corporal moderadamente reducido en la segunda semana postnatal de vida en comparación con los controles que carecen del controlador Cre (Figura 4A), las curvas de crecimiento agregadas entre P0 y P21 exhibieron una clara trayectoria ascendente (Figura complementaria 3A). Además, los mutantes no mostraron debilidad en la capacidad de enderezamiento como recién nacidos (Figura complementaria 3B) o en la varilla giratoria a las 6 semanas de edad (Figura complementaria 3C), y no mostraron reducción en la esperanza de vida entre el nacimiento y P60 (16 de 16 mutantes vivos 18 de 18 controles vivos). Las concentraciones de SMN en el músculo esquelético de mutantes de 1 mes permanecieron bajas, aproximadamente al 21% de los niveles de WT (Figura 4, B y C) los niveles de la proteína en otros tejidos no se redujeron.

Poca patología celular en el adulto joven MyoD-iCre Smn F7 / - mutantes que llevan 2 SMN2 copias. (A) Comparaciones de pesos corporales de controles y mutantes que albergan 1 o 2 SMN2 copia ANOVA de 1 vía, norte ≥ 10 ratones de cada cohorte. (B) Resultados de la transferencia Western que muestran el agotamiento selectivo de la proteína SMN en el músculo esquelético de un P30 MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutante. (C) Niveles cuantificados de proteína SMN en ratones mutantes y de control P30 t prueba, norte ≥ 3 ratones de cada grupo. (D) Las secciones transversales de los músculos gastrocnemios teñidos con H & ampE de un mutante P30 y el control no revelaron diferencias morfológicas importantes entre los dos. Barra de escala: 25 μm. Gráficos de (mi) áreas de miofibras, (F) fibras que contienen núcleos centrales, y (GRAMO) niveles séricos de creatina quinasa (CK) en mutantes jóvenes y controles. NS: PAG & gt 0,05, t prueba, norte & gt 150 fibras de norte = 3 ratones de cada grupo para obtener resultados en mi y F NS: PAG & gt 0,05, t prueba, norte = 10 ratones para los valores de CK. (H) NMJ del tríceps de un mutante P30 y un control que muestra una morfología similar de los compartimentos presinápticos y postsinápticos en los 2 ratones. Barra de escala: 30 μm. (I) Gráfico del grado de inervación de NMJ en mutantes y controles P30. (J) Gráfico que representa la complejidad de la placa terminal en mutantes P30 y compañeros de camada de control. NS: PAG & gt 0.05, prueba exacta de Fisher, norte ≥ 300 NMJ de norte = 3 ratones de cada grupo de ratones para análisis en I y J. **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001.

Dada la evidencia de patología neuromuscular en la copia única SMN2 Mutantes MyoD-iCre, se procedió a examinar el músculo y la unidad motora distal de mutantes adultos jóvenes que albergan 2 copias del transgén humano. No se observaron anomalías musculares macroscópicas. A pesar del peso algo menor de los mutantes, las miofibras en los músculos examinados eran en gran medida equivalentes en tamaño a las de los controles (Figura 4, D y E), parecían morfológicamente normales y no mostraban patología en forma de mionúcleos anormalmente localizados en el gastrocnemio e intercostal. El músculo tríceps más vulnerable en los mutantes albergaba un mayor número de núcleos centrales que los controles, pero esto representó menos del 1% de las miofibras totales examinadas (Figura 4F y Figura 4 complementaria, A-E). De acuerdo con la ausencia de patología muscular importante, no encontramos elevación de la creatina quinasa muscular (CK) en el suero de los animales mutantes (Figura 4G) o daño al sarcolema evaluado al examinar si la IgG sérica circulante había penetrado en las miofibras (Figura complementaria 4F). Los análisis de los niveles de expresión de los genes de la cadena pesada de la miosina y los factores miogénicos Pax7, MyoD, Myf6 y miogenina, marcadores conocidos del estado de madurez de las miofibras en los mutantes P7, no revelaron cambios significativos en los animales que albergaban 1 o 2 SMN2 copias (Figura suplementaria 5, A-L), aunque la expresión de MyoD tendió a aumentar, particularmente en los mutantes Δ7 SMA más graves, que sirvieron como 1 conjunto de controles. Los cambios de expresión también fueron indetectables en los mutantes P14 (Figura complementaria 5, M – Q), lo que sugiere que el agotamiento selectivo de SMN en el músculo esquelético del organismo intacto como se efectúa aquí no altera la miogénesis o la diferenciación muscular.

A continuación, investigamos la morfología de NMJ. En contraste con los defectos llamativos observados en mutantes hemicigotos para el SMN2 transgén, los NMJ en los músculos del tríceps de los mutantes de 1 mes homocigotos para SMN2 parecía relativamente normal (Figura 4H). Específicamente, no hay diferencias en el tamaño de la placa terminal (área en μm 2 - controles: 218,1 ± 3,9, mutantes: 225,3 ± 3,7, norte ≥ 150 NMJ de norte = 3 ratones de cada cohorte, PAG = 0.183, t prueba), inervación (Figura 4I), complejidad de la placa terminal (Figura 4J) o incidencia de varicosidades NF (número de placas terminales con inflamación axonal - controles: 7,87 ± 0,69, mutantes: 5,25 ± 1,56, norte ≥ 150 NMJ de norte = 3 ratones de cada cohorte, PAG = 0.2, t prueba). Como un medio más sensible para detectar posibles defectos sinápticos, también examinamos el estado funcional de los NMJ. La frecuencia del potencial de placa terminal en miniatura (MEPP), la amplitud de MEPP, los potenciales evocados de la placa terminal (EPP) y el contenido cuántico fueron todos normales en niños de 4 a 5 semanas MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes (Figura complementaria 6, A – D). De acuerdo con estos resultados, el área de sección transversal y el número medio de fibras cuantificadas en los músculos extensor largo de los dedos mutantes (EDL) fueron equivalentes a los de los controles (Figura complementaria 6, E y F). En conjunto, estos resultados demostraron que el adulto joven MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - los mutantes eran fenotípicamente normales y no mostraban evidencia importante de patología muscular o NMJ.

Considerando la ausencia de defectos importantes en los jóvenes MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes, preguntamos si una lesión aguda del músculo podría desenmascarar una patología subyacente. En consecuencia, inyectamos el gastrocnemio de los mutantes y controles P21 con un agente mionecrótico, cardiotoxina (CTX), y examinamos la capacidad del músculo para regenerarse. Seis días después de la exposición a CTX, las miofibras de mutantes y controles mostraron una degeneración uniforme caracterizada por músculo necrótico y una gran cantidad de miofibras en regeneración de minutos con núcleos centrales (Figura 5A). Dos semanas después de la lesión, la regeneración muscular fue aún más obvia. Sin embargo, la cuantificación de los núcleos centrales versus periféricos en las nuevas miofibras reveló que el músculo mutante no solo se caracterizaba por un mayor número de fibras que aún albergaban núcleos ubicados en el centro, sino también células que contenían múltiples núcleos de este tipo (Figura 5, A y B). El examen de los animales 26 días después de la inyección mostró que el músculo que expresaba niveles normales de SMN se había recuperado por completo, con menos del 2% de las fibras aún albergando núcleos centrales. Por el contrario, el músculo empobrecido de la proteína continuó mostrando evidencia de regeneración aproximadamente la mitad de las fibras en dicho músculo aún estaban inmaduras, contenían 1 o más núcleos ubicados en el centro, mostraban una variación considerable de tamaño y, en algunos casos, todavía se degeneraban (Figura 5, A y C). Estos resultados sugieren que a pesar de la ausencia de una miopatía evidente en los jóvenes MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes, una patología subyacente que surgió en condiciones de lesión muscular, comprometiendo gravemente la capacidad de los animales para reparar el músculo dañado.

Una lesión aguda desenmascara una patología muscular en un adulto joven MyoD-iCre Smn F7 / - mutantes que llevan 2 copias del SMN2 gene. (A) Secciones transversales teñidas con H & ampE de músculo de ratones mutantes y de control examinados 6, 14 y 26 días después de la lesión con CTX. Nótese la persistencia de la patología muscular tipificada por fibras hipotróficas (puntas de flecha sólidas), numerosos núcleos centrales (flechas) y fibras en degeneración (puntas de flecha abiertas) en el día 26 en el mutante. Barras de escala: 25 μm (paneles superiores), 15 μm (paneles intermedios) y 30 μm (paneles inferiores). Los gráficos representan la proporción de fibras con núcleos centrales o ubicados periféricamente en mutantes y controles (B) 14 días y (C) 26 días después de la lesión. ***PAG & lt 0,001, t prueba, norte ≥ 400 fibras de norte ≥ 4 ratones de cada genotipo.

Se observa disfunción motora de aparición tardía y mortalidad temprana en mutantes de 2 copias de SMN2 con depleción selectiva de SMN en el tejido del músculo esquelético. Aunque no pudimos detectar anomalías musculares importantes o enfermedad manifiesta en jóvenes MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes, el resultado de nuestros experimentos con CTX y la revelación de que el daño agudo desenmascara una patología subyacente predijo que tal disfunción eventualmente emergería en forma de enfermedad de inicio tardío. En consecuencia, continuamos vigilando la copia de 2 copias SMN2 mutantes, realizando un segundo y amplio conjunto de análisis entre los 6 y los 7 meses de edad. En los ensayos de varilla giratoria, no pudimos detectar cambios marcados en los mutantes a las 8, 10 y 16 semanas de edad, a pesar de que había una tendencia a que los mutantes tuvieran un rendimiento inferior al de los controles. Sin embargo, a las 18 semanas de edad, la discrepancia se volvió significativa y permaneció así cuando los animales fueron probados a las 20 y 28 semanas, respectivamente (Figura 6A). Estas diferencias fueron aún más prominentes cuando los resultados se estratificaron según el género y sugirieron que, aunque los mutantes generalmente se desempeñan menos que los controles, las hembras se ven afectadas en mayor medida que los machos en la varilla giratoria (Figura complementaria 7, A y B).

Enfermedad de aparición tardía en MyoD-iCre Smn F7 / - mutantes que llevan 2 SMN2 copias. Resultados de (A) rotarod y (B) las pruebas de fuerza de agarre demostraron los efectos de aparición tardía y causantes de enfermedades de la reducción selectiva del SMN en el músculo esquelético t prueba, norte ≥ 25 ratones de cada genotipo. (C) Las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier representan una vida útil reducida de los mutantes. PAG & lt 0,0001 entre mutantes y los 2 conjuntos de controles PAG & gt 0,05 entre los 2 conjuntos de controles, prueba de rango logarítmico. (D) Las secciones transversales de los músculos gastrocnemios de control y mutantes de 6 a 7 meses ilustran la presencia de patología en los mutantes. Se muestran fibras hipotróficas (flechas sólidas), fibras en regeneración con basofilia citoplásmica (punta de flecha abierta), fibras divididas (puntas de flecha sólidas) o fibras en degeneración (flechas abiertas). Barra de escala: 25 μm. Los gráficos representan (mi) tamaños de fibra y (F) número de fibras en los músculos de mutantes y controles de 7 meses de edad t prueba, norte ≥ 500 fibras de norte ≥ 3 ratones de cada genotipo. (GRAMO) Estimaciones de núcleos centrales en músculos de mutantes o controles de 7 meses de edad t prueba, norte ≥ 1000 fibras de norte ≥ 3 ratones de cada genotipo. (H) Secciones transversales de los músculos gastrocnemio de ratones mutantes y de control de 7 meses de edad que representan miofibras IgG positivas dañadas (flechas). Barra de escala: 50 μm. (I) Cuantificación de fibras dañadas del experimento anterior t prueba, norte ≥ 300 fibras de norte ≥ 3 ratones de cada genotipo. (J) Resultados cuantificados de los valores de CK en suero de ratones mutantes y de control de 7 meses de edad. t prueba, norte ≥ 8 ratones de cada cohorte. *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001.

En una prueba de fuerza de agarre, la disfunción se hizo evidente incluso antes. Los mutantes tuvieron un rendimiento inferior en todos los puntos de tiempo examinados (Figura 6B). Además, ambos sexos parecían igualmente afectados (Figura complementaria 7, C y D). Finalmente, una evaluación de la esperanza de vida demostró que un SMN bajo en el músculo esquelético también causaba mortalidad temprana en 2 copias SMN2 mutantes. Considerando que aproximadamente el 95% del control (SMN2 + / + Smn F7 / - ) los animales permanecieron vivos aproximadamente a los 18 meses de edad, solo el 14% de los mutantes aún eran viables a esta edad (Figura 6C). Como era de esperar, no encontramos ninguna diferencia entre SMN2 + / + Smn F7 / - controles y un segundo conjunto de controles que albergaba el controlador MyoD-iCre, pero también llevaba 1 alelo WT SMN (MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / + ), asegurando así niveles heterocigotos de la proteína en el músculo (Figura 6C). Combinado con el análisis del comportamiento de mutantes adultos jóvenes, estos resultados sugieren que la expresión persistente de SMN baja en el músculo esquelético de 2 SMN2 copias fue suficiente para desencadenar un fenotipo de enfermedad manifiesta, aunque en forma de disfunción de inicio tardío.

La miopatía es una consecuencia autónoma celular de aparición tardía de un SMN bajo en el músculo esquelético. Teniendo en cuenta la evidencia de enfermedad manifiesta en los ancianos MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes, consideramos especialmente importante una reevaluación de la patología neuromuscular potencial en los animales. En consecuencia, una vez más comenzamos nuestro análisis examinando la morfología muscular. En contraste con las observaciones en mutantes adultos jóvenes, los resultados de los análisis de ratones mayores (de 6 a 7 meses) fueron sorprendentes. En los 3 músculos examinados, encontramos evidencia obvia de patología caracterizada por fibras necróticas infiltradas por células inflamatorias, fibras en regeneración que exhiben basofilia citoplasmática, fibras angulares que parecen haber surgido de la división de una fibra más grande y la presencia ocasional de grupos de hipotróficos. fibras dentro de lo que parecía haber sido un endomisio individual (Figura 6D y Figura complementaria 7, E y F). La evidencia de patología en el músculo mutante también se demostró en forma de puntos aumentados que se tiñeron positivamente para el marcador microglial / macrófago, Iba-1 (Figura complementaria 7G). En segundo lugar, encontramos que las miofibras mutantes no solo eran generalmente más pequeñas (Figura 6E y Figura complementaria 8, A – C), sino que también tenían un tamaño inconsistente. En tercer lugar, encontramos que los músculos mutantes tenían significativamente menos fibras (Figura 6F), muchos con 1 o más núcleos ubicados en el centro (Figura 6G). La pérdida de miofibras es claramente un evento tardío, ya que encontramos un número equivalente de fibras en los músculos mutantes y de control al mes de edad (Figura 6F). Finalmente, una evaluación del tamaño bruto de los gastrocnemios mostró que el músculo mutante pesaba significativamente menos que el músculo de control (peso en mg: controles - 126 ± 7,3, mutantes - 93,08 ± 4,5, PAG & lt 0.01, norte ≥ 7 ratones, t prueba). La patología en el músculo flexor corto de los dedos (FDB), más vulnerable, fue aún más grave. En los mutantes, solo se encontraron restos del músculo, lo que sugiere una pérdida o degeneración casi completa (Figura complementaria 8D).

Dado el proceso degenerativo muscular en curso en los ancianos MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes y como segundo medio para confirmar la patología, evaluamos la integridad de las miofibras individuales mediante la cuantificación de la penetración por los niveles séricos de IgG y CK. De acuerdo con la patología observada, y en contraste con lo observado en animales jóvenes, un número significativamente mayor de fibras mutantes contenían IgG (Figura 6, H e I), similar a lo observado en la distrofia muscular, aunque en menor medida (Suplemento Figura 4F). Los niveles de CK mutante también estaban elevados (Figura 6J). Como era de esperar, la patología muscular caracterizada por una CK sérica elevada y miofibras más pequeñas con núcleos centrales aumentados también se observó en mutantes más antiguos con depleción selectiva de SMN en miotubos fusionados, por medio de un controlador HSA-Cre (24), en lugar de progenitores musculares (Figura complementaria 9, A – D). Para determinar la relevancia de estos hallazgos en nuestro modelo de ratones para la patología muscular potencial en la AME humana, examinamos los valores séricos de CK en una muestra de conveniencia de 6 pacientes, todos los cuales habían sido tratados durante al menos un año con Spinraza. En cada caso, los valores de CK se elevaron y excedieron los valores normales máximos entre un 15% y un 500% (Tabla 1). En conjunto, estos resultados refuerzan las observaciones de enfermedad manifiesta en personas mayores. MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes, proporcionan una base celular para la disfunción motora y la mortalidad temprana, y refuerzan la noción de que el músculo esquelético es un sitio celular crítico de acción de la proteína SMN. Deficiencia de la proteína, incluso en presencia de 2 SMN2 copias, es perjudicial para los músculos a medida que el organismo envejece.

Aumento de los valores de creatina quinasa muscular en suero (CK-MM) en pacientes tratados con AME

Los defectos funcionales y estructurales de los NMJ son consecuencias autónomas de células de un SMN bajo en el músculo esquelético. A continuación, examinamos los NMJ en el bebé de 7 meses. MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - ratones. El resultado más sorprendente de nuestros análisis morfológicos fue la medida en que los grupos de AChR mutantes se desmontaron y fragmentaron (Figura 7, A y B). Se observaron defectos similares en niños de 6 meses. HSA-Cre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes (Figura suplementaria 9, E y F). Además, a diferencia de los jóvenes MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes en los que las placas terminales no eran diferentes en tamaño y estructura a las de los controles, las placas terminales en los ratones más viejos no solo eran significativamente más pequeñas (Figura 7C), sino también menos elaboradas, según se evaluó al cuantificar la proporción de grupos de AChR en los gastrocnemios que poseían la estructura típica en forma de pretzel con 4 o más perforaciones (controles - 86,33% ± 3,1%, mutantes - 3,33% ± 1,85%, PAG & lt 0,001, norte ≥ 100 NMJ en norte = 3 ratones de cada cohorte, t prueba).

Patología NMJ y disfunción neuromuscular en MyoD-iCre Smn F7 / - mutantes que llevan 2 SMN2 copias. (A) Las NMJ de los músculos EDL de ratones de 7 meses muestran una profunda fragmentación de las placas terminales en mutantes. Barra de escala: 10 μm. (B) Representación cuantificada de NMJ fragmentados en ratones mutantes y de control de 7 meses de edad t prueba, norte ≥ 500 placas terminales de norte ≥ 3 ratones de cada genotipo. (C) El gráfico muestra el tamaño de NMJ en los músculos gastrocnemios de mutantes y controles de 7 meses de edad. t prueba, norte ≥ 420 placas terminales de norte = 3 ratones de cada genotipo. Representaciones cuantificadas de (D) Amplitud de MEPP, (mi) Frecuencia MEPP, (F) Amplitud de EPP y (GRAMO) contenido cuántico en músculos EDL de ratones mutantes y de control de 7 meses de edad. NS: PAG & gt 0,05, t prueba, norte ≥ 10 placas terminales por animal de norte ≥ 4 ratones de cada genotipo. Los gráficos representan (H) números de miofibra y (I) la proporción de fibras con núcleos centrales en los músculos EDL de los ratones analizados t prueba, norte ≥ 4 ratones de cada genotipo. Representaciones cuantificadas de (J) fuerza específica máxima, (K) caída de fuerza relativa, y (L) tasa de producción de fuerza máxima en el músculo sóleo de ratones de 5 a 7 meses ANOVA de 2 vías para resultados en J y t pruebas para resultados en K y L, norte ≥ 5 ratones de cada cohorte. *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001.

Para determinar si las anomalías morfológicas se correlacionaban con la alteración de la neurotransmisión, también evaluamos la función de NMJ por medios electrofisiológicos. Aunque no hubo diferencias en las amplitudes de EPP y frecuencias de MEPP en los músculos EDL de mutantes y controles, las amplitudes de MEPP fueron significativamente más bajas en los MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - ratones, consistente con una escasez de AChR postsinápticos (Figura 7, D – F). Esto condujo a un marcado aumento en el contenido cuántico medio en las placas terminales mutantes (Figura 7G), lo que sugiere un aumento compensatorio en la liberación de neurotransmisores presinápticos en respuesta a concentraciones de AChR postsinápticas más bajas. Además, el músculo EDL mutante se redujo de tamaño (área de la sección transversal del músculo en μm 2: controles - 584,300 ± 33,470, mutantes - 406,900 ± 36,780, PAG & lt 0.05, t prueba de norte ≥ 4 animales de cada cohorte) y constaba de menos fibras, muchas con núcleos ubicados en el centro en lugar de en la zona periférica (Figura 7, H e I). Los defectos musculares señalados anteriormente no afectaron el número de neuronas motoras espinales en los mutantes (número medio por sección: mutantes - 14,5 ± 0,25, controles - 12,8 ± 1,08, PAG & gt 0,05, norte = 3 ratones, t prueba). Estos resultados refuerzan la observación de que la disfunción morfológica y motora resulta de un SMN bajo en el músculo esquelético, y sugieren además que los defectos que se originan en el compartimento postsináptico pueden tener un efecto retrógrado en la función de la neurona motora.

En un conjunto final de experimentos funcionales, realizamos mediciones de contractilidad ex vivo en los músculos sóleo de 5 a 7 meses de edad. MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes. Encontramos que la fuerza específica máxima generada durante las estimulaciones de una sola contracción y de baja frecuencia (10-20 Hz) no difirió entre las muestras de mutante y de control. Sin embargo, se detectó una reducción significativa en la fuerza específica máxima cuando los músculos mutantes se estimularon con frecuencias que resultaron en una contracción sumatoria (40-200 Hz) (Figura 7J). No se observó ningún cambio en la relación fuerza-frecuencia entre los músculos de control y mutantes. También sometimos los músculos a una estimulación repetitiva de frecuencia moderada para evaluar la susceptibilidad a la fatiga. Curiosamente, el músculo mutante exhibió una disminución modesta, pero significativa, en la fatiga durante los aproximadamente 25 trenes de estímulos finales (Figura 7K). Para investigar la base celular de esta observación, se analizaron las miofibrillas extraídas de todo el músculo sóleo para determinar los niveles relativos de las isoformas de la cadena pesada de la miosina. De acuerdo con una mayor resistencia a la fatiga, encontramos que los músculos sóleo de MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - los ratones expresaron considerablemente más miosina de tipo I (MyHc7) que se encuentra característicamente en las miofibras resistentes a la fatiga de contracción lenta (Figura complementaria 10, A y B). Finalmente, considerando estos cambios observados en la fuerza tetánica específica máxima y el contenido lento de miosina tipo I, analizamos la cinética del desarrollo de la fuerza (dF / dt) en los músculos sóleo de ratones de control y mutantes. Congruente con el aumento observado en el contenido de MyHc7, y a pesar de tener un tamaño normal (peso en mg: controles - 6,15 ± 0,22, mutantes - 6,15 ± 0,38 PAG = 1, norte ≥ 4 ratones, t prueba), el dF / dt máximo se redujo en el músculo sóleo que expresaba un SMN bajo (Figura 7L). En conjunto, estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de déficits morfológicos y funcionales significativos del músculo que surgen de un efecto autónomo de células de la escasez de SMN en este tejido.

La mitigación de la patología neuromuscular se observa después de la repleción postsintomática de la proteína SMN. La repleción posnatal temprana de SMN previene eficazmente el inicio de la AME (53, 54). Para determinar si la restauración de SMN también beneficia a los ratones postsintomáticos con agotamiento selectivo de la proteína en el músculo, administramos sistémicamente un SMN2 morfolino de cambio de empalme (MO) o uno con una secuencia codificada para un niño de 7 meses MyoD-iCre SMN2 + / + Smn F7 / - mutantes. Nueve semanas después, se evaluaron los niveles de SMN muscular. De acuerdo con informes anteriores, encontramos que las transcripciones de FL-SMN y los niveles totales de proteína SMN eran significativamente más altos en los mutantes tratados con SMN MO que en la cohorte tratada con la molécula revuelta (Figura 8, A – C). Para determinar si el aumento de SMN muscular había mitigado la patología muscular típicamente observada en los mutantes, disecamos los gastrocnemios de las diversas cohortes, al mismo tiempo que se examinaron los niveles de SMN, para evaluar los músculos. Las mediciones del peso húmedo del músculo demostraron que mientras que los músculos de mutantes tratados con MO revueltos permanecieron significativamente más pequeños que los de los controles, los músculos de los mutantes restaurados para SMN eran más grandes y no diferentes en peso que el músculo de control (Figura 8D). Esto fue acompañado por menos defectos celulares en las miofibras mutantes tratadas con SMN MO en estos animales exhibieron áreas de fibra más grandes en comparación con las de los mutantes a los que se les administró el MO revuelto. Además, menos miofibras tratadas con MO SMN contenían núcleos centralizados en comparación con las de los mutantes tratados con MO codificados (Figura 8, E – G). Finalmente, las mediciones del tamaño y la complejidad de la placa terminal en las 3 cohortes de ratones demostraron que ambos parámetros estaban parcialmente normalizados en mutantes tratados con SMN MO (Figura 8, H – J). Específicamente, los NMJ en mutantes restaurados para SMN no solo eran más grandes (Figura 8I), sino también menos fragmentados (Figura 8, H y J). Además, las placas terminales intactas en mutantes restaurados para SMN fueron más elaboradas, según lo evaluado por una cuantificación de estructuras similares a pretzel con 3 o más perforaciones distintas (Figura 8J). Concluimos que la restauración del SMN incluso después de que la patología muscular se vuelve evidente detiene y / o revierte la miopatía atribuida al bajo contenido de proteínas en el tejido. Por consiguiente, se espera que la repleción de SMN al músculo de los sujetos con AME tenga un efecto mitigante importante sobre el fenotipo general de la enfermedad.

La repleción de SMN mitiga los defectos musculares en mutantes sintomáticos. Niveles del (A) SMN2-transcripciones FL-SMN derivadas y (B) Proteína SMN en los músculos gastrocnemios de controles y mutantes administrados SMN2 MO de conmutación de empalmes o un MO inespecífico a los 7 meses de edad ANOVA de 1 vía, norte = 3 ratones de cada genotipo. (C) Western blot sondado para proteína SMN en músculo esquelético después del tratamiento con SMN-MO o MO revuelto. (D) Pesos musculares en ratones tratados como se describe en los paneles anteriores ANOVA de 1 vía, norte ≥ 3 ratones en cada grupo. (mi) Secciones transversales de músculos gastrocnemio de mutantes tratados y controles. Menos patología en forma de núcleos centrales (puntas de flecha), fibras hipotróficas (flechas abiertas) y fibras degenerativas (flechas sólidas) observadas en el músculo tratado con SMN-MO. Barra de escala: 100 μm. Resultados cuantificados de (F) núcleos centrales y (GRAMO) áreas de miofibras en los músculos de los ratones ANOVA de 1 vía, norte ≥ 300 fibras de norte ≥ 3 ratones de cada cohorte. (H) En las placas terminales de los 3 conjuntos de ratones se ven menos NMJ fragmentados en el mutante tratado con SMN-MO que en su homólogo de MO revuelto administrado. Barra de escala: 25 μm. (I) Mediciones de área NMJ y (J) Análisis de complejidad NMJ en músculos gastrocnemios de mutantes tratados o controles de la camada ANOVA de 1 vía, norte ≥ 400 placas terminales de norte ≥ 3 ratones de cada genotipo para resultados en I y J. *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001.

La AME es un trastorno paralítico de inicio infantil causado por un nivel bajo de proteína SMN. Sin tratamiento, la mayoría de los pacientes con AME mueren antes de los 2 años de edad. Restaurar SMN en ratones modelo previene y / o revierte el inicio de SMA (54, 55) y, por lo tanto, se adoptó rápidamente como un medio para un tratamiento viable. Sin embargo, los estudios de repleción también dejaron en claro que el éxito de la estrategia depende fundamentalmente de cuándo y en qué tejidos se restaura el SMN. Se acepta ampliamente que las células del SNC y, en particular, las neuronas motoras espinales son especialmente vulnerables a un SMN bajo y, por lo tanto, deben expresar niveles adecuados de SMN para frustrar la aparición de la enfermedad. Estas células se dirigen eficazmente mediante la administración intratecal de agentes restauradores de SMN como Spinraza. De hecho, el resultado inicial de tratar a los pacientes de esta manera no ha dejado ninguna duda sobre la eficacia clínica de dirigirse al SNC. Sin embargo, persisten las preguntas sobre la administración intratecal restringida del fármaco y los efectos a largo plazo de privar a la periferia de un SMN adecuado. Aquí usamos lo que creemos que es una línea novedosa de ratones modelo para demostrar el resultado de privar a un órgano periférico importante, el músculo esquelético, del SMN adecuado. Este tejido es especialmente relevante dada la vulnerabilidad de la unidad motora en SMA. De nuestros estudios surgieron cuatro hallazgos principales. Lo más importante es revelar cuán perjudicial es la deficiencia de SMN para el músculo esquelético. Encontramos defectos en miofibras individuales y NMJ, anomalías y disfunción de músculos enteros y, finalmente, un fenotipo manifiesto que comprometía la supervivencia. Esta patología surgió a pesar de los niveles normales de SMN en otros tejidos. En segundo lugar, demostramos que la extensión de la enfermedad se correlaciona con el número de SMN2 copias y, por tanto, niveles absolutos de proteína SMN funcional en el tejido. Mientras que los mutantes que expresan solo una copia del SMN2 gen que desarrolló rápidamente la enfermedad, aquellos con 2 copias exhibieron un fenotipo de inicio mucho más tardío. No obstante, la patología celular subyacente incluso a la enfermedad de inicio tardío podría desenmascararse en etapas tempranas en condiciones de lesión muscular aguda. En tercer lugar, nuestros resultados demostraron de manera inequívoca que al menos algún aspecto del fenotipo general de la AME se debe a un efecto de autonomía muscular. El agotamiento del SMN en este tejido es suficiente para desencadenar una patología. Además, aunque las anomalías resultantes fueron más evidentes en el propio músculo, los defectos también se detectaron finalmente en la presinapsis en forma de varicosidades axonales que contienen NF y un intento de neurotransmisión compensadora.Finalmente, demostramos que restaurar el SMN al músculo incluso después del inicio de la patología puede tener un efecto atenuante. Esto es particularmente tranquilizador desde un punto de vista clínico. Concluimos que la proteína SMN es intrínsecamente importante para la función muscular. Es poco probable que las terapias restauradoras de SMN que privan a este tejido de la proteína adecuada logren el máximo beneficio. Más bien, nuestros resultados han planteado la posibilidad de que los sujetos tratados intratecalmente puedan desarrollar miopatías graves y potencialmente mortales con el tiempo. Zolgensma, un agente potenciador de SMN mediado por AAV9, que fue aprobado recientemente para el tratamiento de la AME, aborda esta preocupación porque se administra de forma sistémica y, por lo tanto, probablemente se dirige al músculo. Sin embargo, dicho tratamiento actualmente solo está aprobado para pacientes menores de 2 años, los pacientes mayores están limitados a la terapia intratecal.

La repleción de SMN para tratar la AME debe considerar los requisitos espaciales y temporales de la proteína. En este contexto, se ha debatido mucho sobre un posible efecto causante de enfermedad, autónomo de células, de un SMN bajo en el músculo esquelético. La ambivalencia se debe en gran parte a la naturaleza de la AME, que implica niveles bajos ubicuos de la proteína SMN, la vulnerabilidad principal de las neuronas motoras espinales a la escasez de SMN y la forma en que la denervación afecta al músculo. Por lo tanto, cualquier efecto de la AME sobre el músculo podría interpretarse como emergente secundario a la pérdida de neuronas motoras. Aún así, muchos estudios han inferido un papel independiente del músculo en la AME. Estos estudios abarcaron desde análisis de células en cultivo que demostraron un efecto dañino del músculo SMA en cocultivos de nervio-músculo (23, 56) hasta evaluaciones de músculo intacto y marcadores de miogénesis en tejido de autopsia y ratones modelo (26, 57, 58). Sin embargo, dado que los experimentos se basaron en células de pacientes o ratones con agotamiento ubicuo de SMN, fue imposible separar verdaderamente los efectos en las neuronas motoras de los intrínsecos al músculo. Los intentos más directos para determinar los posibles efectos autónomos de las células de la SMN muscular baja en el fenotipo de la AME concluyeron que la proteína baja en este tejido contribuye poco a la enfermedad (25, 28).

Nuestros resultados contrastan fuertemente con los de Iyer et al. (28). Una explicación de la diferencia en los resultados proviene de nuestra elección de controladores Cre. La solidez y la especificidad de dichos impulsores son clave para permitir que uno pueda predecir con precisión los resultados en el contexto de una enfermedad. En este sentido, no solo encontramos que la línea MyoD-iCre agota el SMN de manera más eficiente que el controlador Myf5-Cre, sino que también lo hace con una mayor especificidad de tejido. Particularmente reveladores fueron nuestros resultados que demostraron que casi la mitad de todos Myf5-Cre Smn F7 / - los mutantes no solo vivieron hasta la edad adulta, sino que también fueron lo suficientemente robustos para reproducirse. Esto sugiere fuertemente que la línea Myf5-Cre no logró impulsar eficientemente la recombinación en el Smn F7 alelo, y por lo tanto no es de extrañar que la adición de SMN2 para Myf5-Cre Smn F7 / - los ratones enmascararían aún más cualquier síntoma de enfermedad, similar a lo observado por Iyer et al. Una explicación relacionada para los hallazgos contrastantes es el trasfondo alélico adoptado en los 2 estudios. Mientras que el modelo de ratones utilizado por Iyer et al. albergaron y expresaron un transgén artificial SMNΔ7, el nuestro no lo hizo. A pesar de los datos confiables que demuestran que la proteína SMNΔ7 no es funcional por sí misma, no obstante, en concierto con FL-SMN, puede otorgar una función parcial al complejo SMN y, por lo tanto, mitigar significativamente la enfermedad (41, 59). Una explicación final de la incapacidad para detectar disfunción en los ratones generada por Iyer et al. probablemente radica en el hecho de que la preponderancia de los análisis se realizó en relativamente jóvenes (8 semanas), 2 copias SMN2 mutantes. De hecho, tampoco pudimos detectar evidencia de patología celular o enfermedad manifiesta en nuestros mutantes MyoD-iCre adultos jóvenes que albergan 2 SMN2 copias. Un fenotipo de la enfermedad solo surgió entre los 6 y los 7 meses de edad. Sospechamos que este también habría sido el caso si Iyer y sus colegas hubieran analizado mutantes más antiguos. La diferencia en nuestros respectivos hallazgos no niega la afirmación de Iyer et al. que el tratamiento exclusivo del tejido muscular en la AME no producirá un beneficio clínico. Es probable que este siga siendo el caso, con un beneficio clínico óptimo que se acumula solo cuando la periferia y el SNC se restauran para la SMN.

Nuestros resultados no son del todo inesperados considerando el fenotipo de AME predominantemente neuromuscular y las inferencias de un papel independiente del músculo en la contribución a la enfermedad. Aún así, hasta donde sabemos, los nuestros son los primeros resultados que utilizan un modelo de mamíferos que expresa SMN2 para mostrar directamente que un SMN bajo en el músculo esquelético produce enfermedad de forma autónoma. Esto es especialmente pertinente desde un punto de vista clínico, dada la promesa terapéutica de los agentes restauradores del SMN. Dos de ellos, Spinraza y Zolgensma, han recibido ahora la aprobación regulatoria para el tratamiento de la AME. Sin embargo, su uso está sujeto a las advertencias ya mencionadas. A la luz de nuestros resultados, esta combinación de factores justifica la preocupación de los muchos cientos de pacientes que actualmente reciben tratamiento, en particular si se limita al SNC. Si, como predicen nuestros resultados preclínicos, la patología muscular es una consecuencia de aparición tardía de un SMN bajo en el tejido, existe toda la posibilidad de que los beneficios iniciales del tratamiento intratecal eventualmente se traduzcan en un trastorno muscular crónico e insidioso de aparición tardía. Los valores de CK en suero generalmente elevados en nuestros pacientes con AME tratados con Spinraza y los niveles particularmente altos de este biomarcador en la muestra de pacientes ambulatorios versus no ambulatorios apoyaron esta afirmación del uso dependiente de la actividad del músculo privado de SMN en los pacientes ambulatorios que probablemente aceleró el daño al tejido . La disfunción puede detenerse y / o revertirse, como se demuestra en nuestro modelo, aumentando el SMN en el músculo, pero una vez más es probable que dependa del momento de la intervención. El músculo una vez perdido en su totalidad será difícil de reemplazar.

Aunque los defectos musculares en nuestro modelo de ratones y las implicaciones terapéuticas de tal daño son obvios, queda por explorar exactamente qué tan bajo SMN desencadena la patología. Algunos han sugerido alteraciones en el proceso de miogénesis (29, 57, 60, 61). Aunque esto puede ser cierto en la forma más severa de AME, parece no ser el caso en nuestros mutantes, particularmente aquellos que expresan 2 SMN2 copias. En tales mutantes examinados en P7, encontramos pocos defectos musculares. Más bien, nuestros datos sugirieron defectos en el mantenimiento muscular. Hasta ahora, los defectos del mantenimiento muscular en la AME no se han informado ni enfatizado, una consecuencia probable de la gravedad del fenotipo y la corta esperanza de vida de los ratones modelo examinados hasta ahora. Sin embargo, los defectos de mantenimiento siguen siendo una posibilidad clara y pueden originarse en miofibras dañadas y / o células satélite. Las células satélite son particularmente activas durante el desarrollo muscular postnatal temprano cuando sirven como fuentes de nuevos mionúcleos (62). Después de la vida prepúber en ratones (4-6 semanas de edad), un período en el que los niveles de SMN también disminuyen considerablemente (63), el número de estas células desciende drásticamente a medida que las miofibras alcanzan sus dimensiones adultas. Especulamos que es durante las semanas siguientes cuando las miofibras que expresan un SMN bajo degeneran en cantidades sustanciales. Las células satélite pueden satisfacer inicialmente la demanda de reponer las fibras en degeneración. Sin embargo, un proceso acelerado de degeneración acompañado de una disfunción intrínseca en las células satélite agotadas de SMN eventualmente abruma la capacidad de estas células madre para repoblar el músculo. La disfunción de las células satélite podría inferirse de la discrepancia entre el número mucho mayor de fibras que exhiben núcleos centrales en relación con las que se degeneran activamente, según lo evaluado por la captación de IgG en suero (Figura 6I). Una explicación intrigante de tal disparidad podría residir en la capacidad normal de las células satélite agotadas de SMN para responder al daño de la fibra, pero una falla posterior de las células para volver a la inactividad. El estado constitutivamente activo resultante de estas células podría acelerar su agotamiento y, por lo tanto, la pérdida general de fibras musculares. Nuestros experimentos CTX sugirieron además que los niveles de SMN afectaron gravemente la regeneración muscular después de una lesión. Si esto es cierto en humanos, los pacientes tratados con fármacos que restauran el SMN exclusivamente en el SNC deberán tener cuidado. Un enigma aparente que surge de nuestras observaciones es por qué la patología muscular similar a la que hemos observado no se ha informado ampliamente en la AME clásica. Creemos que la respuesta radica principalmente en los efectos de enmascaramiento de la pérdida temprana de neuronas motoras. Una segunda hipótesis intrigante se centra en la conversación cruzada entre músculo y nervio. En la AME clásica, es probable que la salud de los compartimentos presinápticos y postsinápticos se vea comprometida. Rescatar selectivamente la neurona motora, como podría esperarse en pacientes tratados intratecalmente, puede resultar en que el compartimiento presináptico rescatado imponga una carga indebida sobre el músculo. Los determinantes moleculares que subyacen a tales alteraciones en la señalización en el NMJ quedan por explorar en el contexto de SMA. Nuestros ratones modelo servirán como una herramienta útil para investigar esto y preguntas más amplias centradas en la señalización requerida entre las neuronas motoras y el músculo para garantizar la salud y la viabilidad de ambos tipos de células.

Ratones. Los ratones ROSA26-flox-STOP-flox-YFP (The Jackson Laboratory, stock no. 006148) fueron genotipados de acuerdo con los protocolos en https://www.jax.org/ Ratones MyoD-iCre o Myf5-Cre SMA sin SMN2 (MyoD-Cre Smn F7 / - o Myf5-Cre Smn F7 / - ) y controles (Smn F7 / - ) se generaron criando ratones MyoD-iCre (The Jackson Laboratory, n. ° 014140) o Myf5-Cre (The Jackson Laboratory, n. ° 007893) heterocigotos para ratones murinos Smn (Smn +/– El Laboratorio Jackson, stock no. 006214) con Smn F7 / F7 los animalesSmn F7 , The Jackson Laboratory, stock no. 006138). Mutantes MyoD-Cre SMA con 1 o 2 copias de SMN2 y controlesSMN2 +/– Smn F7 / -, SMN2 + / + Smn F7 / - , o MyoD-Cre SMN2 + / + Smn F7 / + ) se generaron mediante la introducción de SMN2 transgén (The Jackson Laboratory, código RS 005024) en animales con el impulsor Cre y el alelo floxed. Todos los análisis en 2 copias SMN2 Se llevaron a cabo ratones con el investigador cegado al fenotipo. Se siguió un protocolo similar para la copia de 1 copia. SMN2 ratones, a excepción de los estudios de comportamiento en los que un fenotipo manifiesto en los mutantes impidió el cegamiento. Consulte los Métodos complementarios para obtener detalles sobre los cebadores de genotipado.

Ensayos de comportamiento motor. Las pruebas de la barra giratoria y la fuerza de agarre se realizaron utilizando la barra giratoria LE8200 (Harvard Apparatus / Panlab Inc.) y el probador de fuerza de agarre BIOSEB BIO-GS3 (Bioseb Inc.), respectivamente, según las instrucciones del fabricante. Los detalles de estos métodos se describen en los métodos complementarios.

Ensayo de CK en suero. Los ratones fueron sacrificados con CO2 gas y 500 μL de sangre extraídos del ventrículo derecho con una aguja de calibre 21. El nivel sérico de CK fue medido por el Instituto de Medicina Comparativa de la Universidad de Columbia utilizando un analizador químico veterinario Element DC (Heska).

Neurona motora, NMJ e histología muscular. La histología de neuronas motoras, NMJ y músculos se llevó a cabo esencialmente como se describió anteriormente (42, 45). Los detalles adicionales se presentan en los métodos complementarios.

Análisis de PCR, Western blots y gel teñido con plata. Los tejidos se lisaron usando TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la síntesis de ADNc, se realizó una PCR cuantitativa por triplicado en un MasterCycler Real Plex4 (Eppendorf). Las secuencias de cebadores utilizadas para la qRT-PCR se indican en los Métodos suplementarios. La transferencia Western se realizó como se describe (13) El análisis de isoformas de la cadena pesada de miosina se llevó a cabo de acuerdo con un informe anterior (64), ver también Métodos suplementarios.

Experimentos CTX y MO. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano al 1-2% y se indujo mionecrosis con CTX. Se utilizó una aguja de calibre 30 para inyectar 20 μL de una solución 10 μM de CTX, en PBS, en el vientre del gastrocnemio. La cardiotoxina se administró uniformemente a los músculos de la pata trasera derecha. La extremidad trasera izquierda se inyectó con volúmenes idénticos de PBS. Los ratones se evaluaron en el punto de referencia (sin inyecciones) y en varios puntos de tiempo después de las inyecciones de CTX y PBS, y los músculos de las patas traseras se extrajeron, se pesaron y se usaron inmediatamente para preparar lisados ​​de tejido o criosecciones. Los SMN y los MO codificados utilizados fueron idénticos a los de un informe anterior (16). Cada MO se resuspendió en agua estéril y se dividió en alícuotas hasta una concentración final de 0,5 mM. A los ratones se les administraron los MO por vía i.p. inyección (12,5 mg / kg) a P210.

Electrofisiología. Electrofisiología de NMJ: La electrofisiología de NMJ se realizó esencialmente como se describió previamente (46). Los experimentos de contractilidad muscular ex vivo se llevaron a cabo con base en métodos optimizados y utilizados previamente (64). Las modificaciones a los métodos respectivos para este estudio se detallan en los Métodos Suplementarios.

Estadísticas. Se evaluaron las diferencias en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier utilizando la prueba de rango logarítmico equivalente a la prueba de Mantel-Haenszel. El estudiante de dos colas no emparejado t La prueba o el ANOVA de 1 vía seguidos de la comparación post hoc de Tukey, cuando se indica, se utilizaron para comparar las medias de las diferencias estadísticas. En los casos en que debían analizarse variables binomiales categóricas, se utilizó la prueba exacta de Fisher. Los datos se representan como media ± SEM a menos que se indique lo contrario. PAG los valores inferiores a 0,05 se consideraron significativos. Los análisis estadísticos se realizaron con Prism versión 6.0 (GraphPad Software).

Aprobación del estudio. Todos los procedimientos con animales se adhirieron a los protocolos descritos en el Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (National Academies Press, 2011) y fueron aprobados por la IACUC de la Universidad de Columbia. Los sujetos de este estudio fueron seleccionados al azar, con antecedentes mixtos, ratones machos y hembras alojados en un ambiente controlado en un ciclo de 12 horas de luz / 12 horas de oscuridad con comida y agua.

JKK, NNJ y MRF realizaron la mayoría de los experimentos descritos aquí. ZF evaluó el estado funcional de los NMJ mientras que CPK supervisó estos experimentos y proporcionó información intelectual. CAC contribuyó a los datos de los pacientes descritos en este estudio. LWL llevó a cabo los estudios de contractilidad muscular ex vivo y RTD dirigió este aspecto del proyecto. URM conceptualizó los experimentos, dirigió el proyecto general y analizó e interpretó los datos. JKK y URM escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores.

Agradecemos a P. Faust ya los miembros de Columbia MNC por sus consejos y sugerencias. También agradecemos a D.C. De Vivo por su apoyo durante el transcurso de este estudio. Este proyecto fue financiado por subvenciones de AFM-France, Cure SMA y NIH (R21 NS099921, R01 NS057482 y R56 NS104218) a URM, NIH R01 AR059646-08 a RTD y la Fundación SMA a CPK.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existe ningún conflicto de intereses.


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RESULTADOS

Efectos de la adición de PBO y MTX a la dieta sobre la secreción de MTX en los túbulos

Primero examinamos los efectos del PBO agregado a la dieta, solo o en combinación con metotrexato. No hubo efecto de ninguna de las dietas experimentales sobre las tasas de secreción de líquido por los túbulos de Malpighian aislados bañados en solución salina que contenía 400 μmol l –1 de MTX en relación con los túbulos aislados de moscas criadas con la dieta de control (Fig. 1A).

Por el contrario, la concentración de MTX en el líquido secretado por los túbulos de moscas criadas con dietas que contienen PBO o tanto PBO como MTX fue más del doble que la de los controles correspondientes (Fig. 1B). Como resultado, la secreción de MTX por los túbulos de moscas criadas con dietas que contienen PBO o tanto PBO como MTX aumentó en un 73 y 136%, respectivamente, en relación con los controles (Fig. 1C).

Efectos de la exposición dietética al fenol durante varias generaciones sobre la secreción de MTX en los túbulos

Las actividades de GST aumentan en Drosophila criado durante más de siete generaciones con una dieta que contiene 0,3% de fenol (Shen et al., 2003). Por lo tanto, evaluamos si los aumentos en la actividad de GST se correlacionaron con un aumento en la secreción del sustrato de MRP metotrexato.

Las tasas de secreción de líquido, la concentración de metotrexato líquido secretado y las tasas de secreción de metotrexato de los túbulos aislados de moscas criadas con la dieta enriquecida con fenol fueron similares a las de los grupos de control en las generaciones F0, F1 y F4 (Fig. 2). Sin embargo, hubo un aumento en la tasa de secreción de líquido de 46 y 65% ​​para los túbulos de las generaciones F7 y F10, respectivamente, de moscas criadas con la dieta enriquecida con fenol en relación con los controles (Fig. 2A). También hubo un aumento del 43 y 50% en la concentración de metotrexato en el líquido secretado por los túbulos de las moscas de las generaciones F7 y F10, respectivamente, en la dieta enriquecida con fenol (Fig. 2B). Como consecuencia de los aumentos tanto en la tasa de secreción de líquido como en la concentración de metotrexato en líquido secretado, los túbulos de las moscas de las generaciones F7 y F10 en la dieta enriquecida con fenol secretaron MTX a más del doble de la tasa de los controles correspondientes (Figura 2C).

Los efectos de la exposición crónica al butóxido de piperonilo en la dieta (PBO 1 mmol l -1) solo o en combinación con metotrexato (MTX 0,1 mmol l -1) sobre (A) la tasa de secreción de líquidos, (B) la concentración de MTX en el líquido secretado ([MTX]sf) y (C) flujo transepitelial de MTX. Los túbulos de Malpighian aislados se establecieron en un ensayo de Ramsay que contenía 400 μmol l –1 [3 H] MTX en la solución salina de baño y las gotitas secretadas se recolectaron a los 60 min. Las diferencias significativas entre las medias de las moscas criadas con una dieta estándar (barras abiertas de control) y con dietas experimentales (barras sólidas) se indican con asteriscos (*PAG& lt0.05, prueba t pareada, norte= 8-12). Las barras de error son + s.e.m.

Los efectos de la exposición crónica al butóxido de piperonilo en la dieta (PBO 1 mmol l -1) solo o en combinación con metotrexato (MTX 0,1 mmol l -1) sobre (A) la tasa de secreción de líquidos, (B) la concentración de MTX en el líquido secretado ([MTX]sf) y (C) flujo transepitelial de MTX. Los túbulos de Malpighian aislados se establecieron en un ensayo de Ramsay que contenía 400 μmol l –1 [3 H] MTX en la solución salina de baño y las gotitas secretadas se recolectaron a los 60 min. Las diferencias significativas entre las medias de las moscas criadas con una dieta estándar (barras abiertas de control) y con dietas experimentales (barras sólidas) se indican con asteriscos (*PAG& lt0.05, prueba t pareada, norte= 8-12). Las barras de error son + s.e.m.

Efectos de la PBO sobre el metabolismo de MTX por los túbulos de Malpighi

El análisis del líquido secretado por TLC indicó que hay un único metabolito de MTX Rfs para MTX y el metabolito fueron 0,41 y 0,79, respectivamente. los Rf Los valores de las muestras de líquido secretado por los túbulos de moscas criadas con dietas de control y enriquecidas con PBO fueron los mismos, lo que indica que la PBO en la dieta no altera el número de metabolitos. Sin embargo, la densitometría puntual indicó que, mientras que el 24,5% del MTX se metabolizó al compuesto con un Rf de 0,79 en los túbulos de control (Tabla 2), el 38,2% de MTX se metabolizó a este compuesto en los túbulos de moscas criadas con la dieta enriquecida con PBO.

Cromatografía en capa fina de muestras de líquido secretado por los túbulos de Malpighi de Drosophila moscas criadas con diferentes dietas

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Efectos de PBO y MTX sobre la expresión de genes P450

La exposición dietética al MTX se asoció con una reducción significativa en la expresión relativa de ARNm para cinco genes P450 en los túbulos de Malpighi en comparación con los túbulos de moscas criadas con la dieta de control (Fig. 3A). La exposición dietética a PBO se asoció con una reducción en la expresión de Cyp4e2 y Cyp4p1, sin cambios significativos en la expresión de Cyp6a2 y Cyp6a8 y un aumento de cuatro veces en la expresión de Cyp12d1 en comparación con los controles (Fig. 3B). La exposición tanto a MTX como a PBO se asoció con ningún cambio en Cyp4e2 y Cyp6a2, una reducción en la expresión de Cyp4p1 y un aumento de 10 a 18 veces en la expresión de Cyp6a8 y Cyp12d1 (Fig. 3C).

Efectos de MTX, PBO y fenol sobre la expresión de genes GST

La exposición crónica a MTX en la dieta se asoció con una reducción en la expresión relativa de GstD1 y GstE1 (Fig. 4A). La exposición crónica a PBO o tanto a PBO como a MTX en la dieta se asoció con una reducción en la expresión de GstD1 y una reducción (PBO) o ningún cambio (PBO + MTX) para GstD5 (Fig. 4B, C). La expresión de GstE1 aumentó 1,5 veces en respuesta a la PBO en la dieta (Fig. 4B) y no hubo cambios significativos (PAG& gt0.1), en relación con los controles, en la expresión de GstE1 en respuesta tanto a PBO como a MTX (Fig. 4C).

Efectos de la exposición alimentaria al fenol (0,3%) durante varias generaciones (F0-F10) sobre (A) la tasa de secreción de líquidos, (B) la concentración de MTX en el líquido secretado ([MTX]sf) y (C) flujo transepitelial de MTX. Los túbulos de Malpighian aislados se establecieron en un ensayo de Ramsay que contenía 400 μmol l –1 [3 H] MTX en la solución salina de baño y las gotitas secretadas se recolectaron a los 60 min. Las diferencias significativas entre las medias para el control (barras abiertas) y los grupos experimentales (barras sólidas) se indican con asteriscos (*PAG& lt0.05, emparejado t-prueba, norte= 8-12). Las barras de error son + s.e.m.

Efectos de la exposición alimentaria al fenol (0,3%) durante varias generaciones (F0-F10) sobre (A) la tasa de secreción de líquidos, (B) la concentración de MTX en el líquido secretado ([MTX]sf) y (C) flujo transepitelial de MTX. Los túbulos de Malpighian aislados se establecieron en un ensayo de Ramsay que contenía 400 μmol l –1 [3 H] MTX en la solución salina de baño y las gotitas secretadas se recolectaron a los 60 min. Las diferencias significativas entre las medias para el control (barras abiertas) y los grupos experimentales (barras sólidas) se indican con asteriscos (*PAG& lt0.05, emparejado t-prueba, norte= 8-12). Las barras de error son + s.e.m.

Cuando se añadió a la dieta solo o en combinación con MTX durante 10 generaciones, el fenol se asoció con reducciones en la expresión de GstD1 en los túbulos de Malpighi (Fig. 5A, B). El fenol se asoció con una reducción de GstD5 y ningún cambio en la expresión de GstE1 (Fig. 5A). Por el contrario, la exposición dietética a MTX y fenol durante 10 generaciones no produjo ningún cambio en la expresión de GstD5, pero sí un aumento de cuatro veces en la expresión de GstE1 (Fig. 5B).

Expresión de ARNm de cinco genes del citocromo P450 en relación con la expresión de GAPDH1 en túbulos de Malpighi adultos aislados de moscas criadas con dieta estándar (barras abiertas) o con dietas experimentales (barras sólidas) que contienen (A) 0,1 mmol l -1 MTX, (B) 1 mmol l –1 PBO o (C) tanto PBO como MTX. Las diferencias significativas entre las medias de los grupos de control y experimentales se indican con asteriscos (PAG& lt0.05, norte= 6-12). Las barras de error son + s.e.m.

Expresión de ARNm de cinco genes del citocromo P450 en relación con la expresión de GAPDH1 en túbulos de Malpighi adultos aislados de moscas criadas con dieta estándar (barras abiertas) o con dietas experimentales (barras sólidas) que contienen (A) 0,1 mmol l -1 MTX, (B) 1 mmol l –1 PBO o (C) tanto PBO como MTX. Las diferencias significativas entre las medias de los grupos de control y experimentales se indican con asteriscos (PAG& lt0.05, norte= 6-12). Las barras de error son + s.e.m.

Efectos de PBO y MTX sobre la expresión del gen transportador

La exposición crónica a PBO se asoció con un aumento de 123 veces en la expresión de MET y un aumento de 27 veces en la expresión de dMRP, pero ningún cambio en la expresión de OATP (Fig. 6A). La exposición crónica tanto a PBO como a MTX en la dieta dio como resultado aumentos en la expresión de los tres genes en los túbulos de Malpighi: 93 veces para MET, 267 veces para dMRP y 50 veces para OATP (Fig. 6B).


F7. Enlaces y referencias - Biología

El gen F7 codifica el factor de coagulación VII, que es el zimógeno del factor VIIa de proteasa sérica, una glicoproteína dependiente de la vitamina K que participa en la vía extrínseca de la coagulación sanguínea. Tras la lesión vascular, el factor VII entra en contacto con el factor tisular, también conocido como factor III o TFA (TF 134390), y se escinde a su forma activa: esta reacción es el evento principal en la coagulación sanguínea. El complejo de factor tisular y factor VII activado sirve para activar los factores IX (F9 300746), X (F10 613872) y (autocatalíticamente) factor VII (resumen de O'Hara et al., 1987 y Millar et al., 2000) .

▼ Clonación y expresión

Hagen y col. (1986) aislaron clones correspondientes al gen F7 de una biblioteca de ADNc de hígado humano. La proteína se sintetiza con una secuencia líder y la proteína circulante madura es un polipéptido monocatenario que contiene 406 aminoácidos. La conversión del factor VII en factor VIIa activado se debe a la escisión de la serina proteasa del enlace entre arg152 e ile153. La forma activada del factor VII consiste en una cadena ligera de 152 residuos de 20 kD con residuos de ácido gamma-carboxiglutámico y una cadena pesada de 254 residuos de 30 kD, que contiene el dominio catalítico; las 2 cadenas se mantienen unidas por un enlace disulfuro . El factor VII humano es muy homólogo a otras proteínas dependientes de la vitamina K, como el factor IX (F9 300746), el factor X (F10 613872), el factor II (F2 176930) y la proteína C (PROC 612283).

O'Hara y col. (1987) determinaron la secuencia de nucleótidos del gen F7. El ARNm del factor VII está poliadenilado en múltiples sitios y puede someterse a un corte y empalme alternativo.

▼ Estructura genética

O'Hara y col. (1987) determinaron que el gen F7 contiene 9 exones y abarca aproximadamente 12,8 kb.

▼ Cartografía

El gen F7 se asigna al cromosoma 13q34 (Millar et al., 2000).

Por efectos de dosificación en 7 casos de cromosoma 13 anormal, Gilgenkrantz et al. (1986) mapearon los genes F7 y F10 (613872) en 13q34. Los factores de coagulación aumentaron en la trisomía de este segmento y disminuyeron en la monosomía.

Tariverdian y col. (1986) encontraron una deficiencia de los factores VII y X en un caso de anillo 13. El sitio de la ruptura fue consistente con la ubicación de los genes en el segmento 13q34-qter.

▼ Función genética

La síntesis de los factores VII y X (613872), así como de los factores II (176930) y IX (264900), tiene lugar en el hígado y requiere vitamina K. Se han demostrado homologías estructurales de estos factores, que son precursores de las serina proteasas. (Zur y Nemerson, 1981). Ratnoff y Bennett (1973) afirmaron: "Aunque se puede argumentar de manera convincente que (ellos) se derivan de una sola molécula, la mayoría de la evidencia sugiere que son proteínas distintivas".

En una discusión de la biología molecular y celular de la coagulación sanguínea, Furie y Furie (1992) presentaron una figura que comparaba la estructura de los genes para 5 proenzimas, 3 procofactores y 2 proteínas reguladoras. Existían interesantes similitudes y diferencias para los miembros de cada categoría. Las 5 proenzimas fueron los factores VII, XI (264900), IX y X y la protrombina los 3 procofactores fueron el factor tisular y los factores VIII (F8 300841) y V (F5 612309) las proteínas reguladoras fueron la proteína C (PROC 612283) y la proteína S (PROS1 176880).

Pike y col. (1999) describieron sutiles diferencias estructurales que ocurren en el complejo factor VIIa / factor tisular, arrojando así luz sobre el mecanismo de la espectacular mejora inducida por el factor tisular de la actividad del factor VIIa.

Di Bitondo y col. (2002) utilizaron análisis de genes informadores para mostrar que la inclusión de regiones promotoras (residuos -658 a -1 y -348 a -1) de F7 reducía la actividad de transcripción en presencia de factores estrogénicos. El efecto fue independiente del haplotipo polimórfico del promotor. Los autores localizaron la secuencia a la que se unía el receptor de estrógeno a los residuos -225 a -212 del promotor F7. El elemento de respuesta de estrógeno F7 representa un tipo alternativo, en el que los 2 medios sitios están separados por solo 2 nucleótidos espaciadores. Los autores presentaron un mecanismo para la relación inversa entre F7 y los niveles de estradiol observados durante el ciclo menstrual.

▼ Genética molecular

Girolami y col. (1977) observaron un factor VII cualitativamente anormal, denominado Verona, asociado con la deficiencia del factor VII.

Deficiencia de factor VII

En una mujer italiana con diátesis hemorrágica por deficiencia grave de factor VII (227500), Arbini et al. (1996) identificaron heterocigosidad compuesta para 2 mutaciones en el gen F7 (613878.0005 y 613878.0008).

Cooper y col. (1997) revisaron los estudios de estructura-función del factor VII basados ​​en el análisis de variantes naturales, incluidos los polimorfismos y las mutaciones subyacentes a la deficiencia del factor VII. Tabularon 30 sustituciones de pares de bases individuales diferentes y 4 deleciones cortas. La mayoría de las lesiones notificadas responsables de la deficiencia de factor VII se habían observado solo una vez. Las excepciones notables incluyeron la mutación ala244-a-val (A244V 613878.0006) encontrada en 23 individuos homocigotos y 10 heterocigotos de origen judío marroquí / iraní por Tamary et al. (1996).

En 2 hermanos bebés, nacidos de padres consanguíneos, con deficiencia severa de factor VII que resultó en muerte prematura debido a hemorragia intracraneal, McVey et al. (1998) identificaron una mutación del sitio de empalme homocigoto en el gen F7 (613878.0008).

Wulff y Herrmann (2000) realizaron un cribado de mutaciones en 87 probandos no relacionados con actividades de factor VII reducidas o bajas. Entre los 101 alelos F7 de 77 probandos, se encontraron 34 lesiones diferentes, 22 de las cuales eran nuevas. Las 34 lesiones diferentes comprendían 31 mutaciones puntuales y 3 pequeñas deleciones. Una transición en el doblete CpG representó 12 de los 34 mutantes diferentes. Se observaron dieciséis mutaciones solo una vez. Con mucho, las mutaciones más comunes encontradas en este estudio en Alemania fueron la mutación sin sentido A294V (613878.0010) y la doble mutación A294V / 11128delC (613878.0012). Estas mutaciones están ubicadas en el exón 8 en el extremo carboxi-terminal del gen, donde se concentra el mayor número de mutaciones que causan la deficiencia del factor VII. Ambas mutaciones también son prevalentes en pacientes polacos e italianos (Arbini et al., 1994 Bernardi et al., 1994), lo que indica que representan las mutaciones F7 más frecuentes en las poblaciones europeas. Los estudios familiares mostraron el mismo haplotipo para ambas mutaciones.

Millar y col. (2000) secuenciaron el gen F7 en 48 individuos no emparentados con deficiencia de factor VII, produciendo un total de 23 lesiones nuevas, incluidas 15 mutaciones de sentido erróneo, 2 microdeleciones, 5 mutaciones de unión de empalme y una sustitución de un solo par de bases en la región no traducida de 5 primos.

McVey y col. (2001) describieron una base de datos de mutaciones en la que se registran mutaciones en el gen F7 de 238 individuos descritos en la literatura mundial. Se han identificado varios polimorfismos en el gen F7 y se ha demostrado que algunos influyen en los niveles de antígeno del factor VII en plasma.

Usando una combinación de DGGE y secuenciación directa de los 9 exones del gen F7, Giansily-Blaizot et al. (2001) investigaron 37 pacientes no emparentados, principalmente de origen francés y norteafricano, con una actividad coagulante del factor VII inferior al 5% de lo normal. Esta estrategia permitió la detección de 68 de los 74 alelos mutados predichos (92%). Se detectaron un total de 40 mutaciones diferentes en todo el gen, 18 de las cuales no se habían informado previamente. Los genotipos de los pacientes con diátesis hemorrágica grave comprendían mutaciones en ambos alelos, lo que impedía la producción de una molécula funcional de FVII. Los autores sugirieron que en los grupos leves y asintomáticos, una mutación no perjudicial en un alelo puede permitir la liberación de una cantidad mínima de proteína FVII que puede ser suficiente para desencadenar la cascada hemostática.

Disminución de la susceptibilidad al infarto de miocardio

Girelli y col. (2000) estudiaron 3 polimorfismos en el gen F7 y encontraron que 2 de ellos, el polimorfismo F7 de 5 primos (613878.0013) y R353Q (613878.0014), afectan el nivel de actividad del factor VII y dan como resultado un menor riesgo de infarto de miocardio (MI 608446) en pacientes con enfermedad de las arterias coronarias. Estudiaron a 444 pacientes, 311 de los cuales tenían aterosclerosis coronaria grave documentada mediante angiografía. De estos 311 pacientes, 175 tenían documentación de infarto de miocardio previo. También se incluyó en el estudio un grupo de control, 133 pacientes con arteriografías coronarias normales. El polimorfismo de 5 primos F7 implica una inserción de 10 pb en la posición -323 en la región promotora de 5 primos del gen F7, el alelo A1 corresponde a la ausencia del decámero, y el alelo A2 se refiere a su inserción. Los pacientes con el genotipo A2A2 tuvieron una reducción del 66% de la actividad del factor VII activado. El polimorfismo R353Q implica una mutación sin sentido en el codón 353 del gen F7, lo que da como resultado una sustitución de arg-a-glu. Los pacientes homocigotos para el alelo Q tuvieron una reducción del 72% de la actividad del factor VII activado. Se encontró que los alelos A2 y Q estaban en desequilibrio de ligamiento. Hubo significativamente más heterocigotos que homocigotos para los alelos A2 y Q entre los que no habían tenido un IM que entre los que sí. La razón de posibilidades ajustada para MI entre los pacientes con genotipo A1A2 o RQ fue de 0,47.

▼ Historia

La posibilidad de que un gen en el cromosoma 8 regule el nivel del factor de coagulación VII (F7R, F7E) fue sugerida por la observación de la deficiencia de este factor en 3 sujetos trisómicos para ese cromosoma (de Grouchy et al., 1974). Fineman y col. (1975, 1979) podría corroborar los hallazgos de de Grouchy et al. (1974) pero Stenbjerg et al. (1975) no pudo. De Grouchy y col. (1984) concluyeron nuevamente que un gen regulador está en el cromosoma 8 y también presentaron resultados compatibles con la asignación del gen estructural para el factor VII (y el del factor X) a 13q34. En una nota agregada como prueba, de Grouchy et al. (1984) describieron el factor VII normal en un bebé con trisomía 8p debido a la duplicación en tándem, lo que sugiere que F7R puede estar en 8q. Sin embargo, Fagan et al. (1988), a partir de estudios citogenéticos y de coagulación en 2 pacientes con diferentes anomalías del cromosoma 8, concluyeron que la ubicación es 8p23.2-p23.1.

▼ Modelo animal

Los experimentos de eliminación de genes de ratón indican que el factor tisular es esencial para el desarrollo embrionario más allá del día 9, y que los embriones homocigóticos con deficiencia de factor tisular no desarrollan una circulación en el saco vitelino (Toomey et al., 1996). Dado que el factor VII es el único ligando conocido de factor tisular, es probable que una desactivación del factor VII también sea letal.

El complejo F7a / TF cataliza la activación de los factores IX y X, lo que permite la generación posterior de trombina y, en última instancia, la formación de un coágulo de trombina. Si bien existen varias proteínas anticoagulantes para regular a la baja diferentes reacciones del sistema de coagulación, por ejemplo, proteína C activada, proteína S, cofactor II de heparina y antitrombina III, se sabe que solo el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI 152310) inhibe el complejo F7a / TF. Chan y col. (1999) generaron ratones doblemente heterocigotos para un alelo TFPI modificado que carece de su dominio 1 de tipo Kunitz y para una deficiencia del gen F7. Los experimentos de apareamiento indicaron que la progenie homocigótica individual para la modificación de TFPI pero con el alelo F7 de tipo salvaje y los ratones homocigotos individualmente para la deficiencia de F7 con el alelo de tipo salvaje TFPI mostraron fenotipos previamente detallados (es decir, un alto porcentaje de letalidad embrionaria temprana en el día embrionario 9.5 y normal desarrollo con hemorragia perinatal grave, respectivamente). Sorprendentemente, los ratones del genotipo combinado (doblemente homocigoto) nacieron con la frecuencia mendeliana esperada, pero sufrieron la hemorragia perinatal fatal asociada con el genotipo F7 - / -. Los ratones que portaban el genotipo F7 heterocigoto y el TFPI mutante homocigoto también se rescataron de la letalidad asociada con el genotipo F7 de tipo salvaje y el genotipo TFPI mutante homocigoto, pero sucumbieron a la coagulopatía de consumo perinatal. Por tanto, el rescate de embriones mutantes homocigotos de TFPI, ya sea por una deficiencia de F7 homocigótica o heterocigótica acompañante, sugirió que la disminución de la actividad de F7 excluye la necesidad de inhibición mediada por TFPI de la vía de coagulación de F7a / factor tisular durante la embriogénesis. Además, los fenotipos de estos estados de deficiencia combinados sugirieron que el F7 embrionario se produce en ratones tan pronto como el día embrionario 9.5 y que cualquier nivel de F7 materno en embriones en etapa temprana es insuficiente para causar una coagulopatía en ratones mutantes TFPI homocigotos.

Para determinar si una pérdida adicional del gen del factor VII influyó en la coagulopatía observada en embriones y neonatos con deficiencia del gen de proteína C (PC - / -), Chan et al. (2000) cruzaron ratones doblemente heterocigotos para los 2 factores para producir descendencia que poseyera las 9 combinaciones genotípicas predichas. Los embriones doblemente nulos, aunque presentes en su frecuencia mendeliana esperada, mostraron un fenotipo que no se había observado en los embriones con deficiencia simple de factor VII o proteína C. A los 12,5 días después del coito, los embriones doblemente nulos demostraron una coagulopatía intra y extravascular que progresó con hemorragia concomitante sustancial y edema periférico hacia el día E17,5, lo que provocó la muerte inmediatamente después del nacimiento. Los embriones de FVII (+/-) / PC (- / -) mostraron un fenotipo menos severo, lo que sugiere un efecto de dosificación genética. Se pensó que la falta de rescate de embriones y neonatos PC - / - y el aumento de la coagulopatía resultante de una deficiencia adicional de FVII heterocigoto u homocigoto se debían al aumento del factor Xa (613872) y la generación de trombina, como resultado de la pérdida de la vía del factor tisular dependiente de FVIIa función inhibidora y ausencia de control a los niveles de los factores Va y VIIIa. La presencia de fibrina en embriones en ausencia de factor VII fetal sugirió que existe un potencial significativo de generación de coágulos fuera de la vía dependiente del factor VII embrionario.

▼ VARIANTES ALÉLICAS ( 24 ejemplos seleccionados):

.0001 FACTOR VII PADUA

En un hombre de 47 años sin tendencia clínica al sangrado pero con actividad del factor VII plasmático indetectable cuando se probó en un ensayo de una etapa con factor de tejido cerebral de conejo, O'Brien et al. (1991) identificaron una transición heterocigótica de G a A en el gen F7, lo que resultó en una sustitución de arg304 a gln (R304Q). El plasma del paciente mostró niveles normales de antígeno del factor VII. El residuo arg304 es homólogo a arg333 del factor IX, y se ha identificado una mutación de arg333 a gln en F9 (300746.0056) en pacientes con hemofilia B grave (306900) en los que hay síntesis y expresión de la proteína del factor IX.

Marchetti y col. (1992) identificaron una sustitución heterocigótica R304Q en el gen F7 como la base del factor VII Padua anormal, descrito por Girolami et al. (1982) en personas originarias del valle del río Piave en el noreste de Italia. Los individuos descritos por Girolami et al. (1982) fueron asintomáticos, pero presentaron una leve prolongación del tiempo de protrombina. La actividad del factor VII varió entre el 45% y el 61% de lo normal, pero el material de reacción cruzada del factor VII fue normal. Se encontró una buena correlación negativa entre el nivel de factor VII y los tiempos de protrombina.

.0002 FACTOR VII DEFICIENCIA

En 2 pacientes de diferentes regiones de Italia con deficiencia de factor VII (227500), Marchetti et al. (1992) encontraron una transversión de G-a-T en el gen F7, lo que resultó en una sustitución de cys310-a-phe (C310F), que suprimió un enlace disulfuro conservado en el dominio catalítico de todas las serina proteasas.En la forma homocigótica, la mutación provocó una reducción severa de la actividad de la proteasa (4%).

.0003 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un paciente con antígeno F7 y actividad F7 al nivel del 30% y 37%, respectivamente, compatible con deficiencia parcial de factor VII (227500), Marchetti et al. (1993) identificaron una transición heterocigótica de G a A en el exón 7 del gen F7, lo que resultó en una sustitución de cys178 a tyr (C178Y) en el dominio catalítico. La anomalía se detectó en una prueba de detección preoperatoria. También se encontraron dimorfismos neutros: uno en el codón 115 para histidina y otro en el codón 353 para arginina (R353Q 613878.0014).

.0004 FACTOR VII DEFICIENCIA

Ohiwa y col. (1994) encontraron una deficiencia asintomática homocigótica de factor VII (227500) en una familia comprobada a través de una proposita de 45 años que se observó que tenía un tiempo de protrombina prolongado. El nivel de antígeno del factor VII en el caso índice fue del 25,9% de lo normal y el nivel de actividad del factor VII fue del 28% y el 24%, según la prueba utilizada. Se encontraron casi los mismos niveles reducidos de antígeno y actividad del factor VII en 2 de sus hermanas, y sus padres, que eran primos hermanos, un hijo, una hija y una sobrina, tenían niveles moderadamente reducidos de actividad y antígeno del factor VII. Los estudios moleculares identificaron una transición de G a A en el exón 8, lo que resultó en una sustitución de arg247 a his (R247H). Los ensayos de expresión transitoria sugirieron que la sustitución conduce a una deficiencia de factor VII al alterar la secreción de la proteína mutada. Esta mutación se denominó factor VII Mie.

.0005 FACTOR VII DEFICIENCIA

En una mujer italiana de 36 años con deficiencia grave de factor VII (227500), Arbini et al. (1996) identificaron heterocigosidad compuesta para 2 mutaciones en el gen F7: una transición 1994C-T, que resulta en una sustitución de thr359-a-met (T359M), y una transición de G-a-A en el intrón 4 (613878.0008), lo que resulta en un defecto de empalme y procesamiento anormal del ARNm. Los estudios de expresión celular mostraron que la proteína mutante T359M se acumulaba intracelularmente y no se detectaba factor VII en el medio después de 3 horas de persecución. Las cadenas laterales de carbohidratos asociadas con la proteína T359M mutante eran sensibles a la digestión con endo-beta-N-acetilglucosaminidasa H (endo H), lo que indicaba que la proteína estaba retenida en el retículo endoplásmico. Arbini y col. (1996) concluyeron que la mutación T359M en F9 da como resultado un defecto de secreción severo que probablemente es consecuencia de un plegamiento anormal de la molécula. El paciente presentaba epistaxis recurrente, fácil hematoma, menorragia, hemartrosis de rodilla derecha y hemorragia mayor tras la extracción dentaria. Un hermano del paciente falleció a los 7 años con epistaxis incontrolada.

.0006 FACTOR VII DEFICIENCIA

En 13 pacientes israelíes con deficiencia de factor VII (225700), Tamary et al. (1996) identificaron una transición homocigótica de 10648C-T en el gen F7, lo que resultó en una sustitución de ala244 a val (A244V). La mutación se asoció con una disminución de la actividad del factor VII y los niveles de antígeno. Diez pacientes adicionales eran heterocigotos para la mutación. De los 36 alelos A244V, 20 se observaron en pacientes de origen marroquí, 10 en pacientes judíos iraníes y 6 en pacientes de otros orígenes étnicos. Un modelo informático del dominio de serina proteasa del factor VII sugirió a Tamary et al. (1996) que la sustitución de A244V puede provocar la distorsión de toda la estructura de la proteína. Los análisis de sitios polimórficos intragénicos (análisis de haplotipos) revelaron un efecto fundador para los pacientes marroquíes e iraníes-judíos. Se encontró que la mutación A244V tiene una frecuencia alélica de 1: 42,5 en judíos marroquíes y 1:40 en judíos iraníes. Como los judíos marroquíes han estado separados de los judíos iraníes durante más de 2.000 años, los datos sugieren que la mutación A244V ocurrió en la antigüedad.

.0007 FACTOR VII DEFICIENCIA

En miembros afectados de una familia con deficiencia de factor VII (613878), Leonard et al. (1998) identificaron una transición heterocigótica 5989G-A en el exón 5 del gen F7, lo que resultó en un cambio de aminoácido asn75 a asp (N57D) en el dominio EGF1 de la proteína del factor VII. Los individuos mostraron una actividad procoagulante reducida en relación con el antígeno del factor VII. Los ensayos de expresión funcional in vitro mostraron que la mutación N57D afecta al plegamiento del primer dominio EGF1, lo que da como resultado una secreción celular disminuida de un F7 mutante que no puede unirse al factor tisular y, por lo tanto, es biológicamente inactivo.

.0008 FACTOR VII DEFICIENCIA

En 2 hermanos, nacidos de padres consanguíneos, con deficiencia severa de factor VII (227500), McVey et al. (1998) identificaron una transición homocigótica de G a A en el intrón 4 del gen F7, lo que resultó en una mutación del sitio de corte y empalme, la omisión del exón 4 y un ARNm que codifica el factor VII con una deleción en el marco del primer crecimiento epidérmico. dominio similar al factor. La mutación ocurrió en un dinucleótido GT invariante en el sitio de empalme 5-primo del intrón 4. Un hermanito y una hermana murieron a los 10 días y 1 mes de edad, respectivamente, de hemorragia intracraneal relacionada con una deficiencia grave del factor VII, los padres no se vieron afectados. En esta familia, la deficiencia completa de factor VII se asoció con una diátesis hemorrágica grave pero sin anomalías del desarrollo, lo que sugiere que el factor VII fetal no es necesario para las funciones angiogénicas putativas del factor tisular (F3 134390) en humanos.

.0009 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un varón japonés de 82 años con pólipos en el colon en el que se descubrió una deficiencia del factor VII (227500) en el curso de estudios preoperatorios, Ozawa et al. (1998) identificaron una transición 38T-C homocigótica en el gen F7, lo que resultó en una sustitución de leu a pro en el codón -26 (L-26P) en el núcleo hidrófobo del péptido señal. Se predijo que esta sustitución afectaría la translocación de la proteína al retículo endoplásmico y provocaría una reducción de los niveles plasmáticos de factor VII. El paciente no tuvo episodios hemorrágicos, la variante se denominó factor VII Morioka.

.0010 FACTOR VII DEFICIENCIA

En 2 hermanos con deficiencia parcial de factor VII (227500), Bernardi et al. (1994) identificaron heterocigosidad compuesta para 2 mutaciones en el gen F7: una transición 10798C-T en el exón 8, que da como resultado una sustitución de ala294 a val (A294V), y una deleción de 17 pb que conduce a un cambio de marco y una terminación prematura en el codón 255 (613878.0011). Los niveles de antígeno del factor VII fueron 38% y 25% de lo normal, y los niveles de actividad fueron 18% y 7% de lo normal, respectivamente.

En un estudio en Alemania, Wulff y Herrmann (2000) encontraron que la mutación sin sentido A294V y la doble mutación A294V / 11128delC (613878.0012) eran, con mucho, las más prevalentes.

.0011 FACTOR VII DEFICIENCIA

Para la discusión de la deleción de 17 pb en el gen F7 que se encontró en el estado heterocigótico compuesto en pacientes con deficiencia parcial del factor VII (227500) por Bernardi et al. (1994), véase 613878.0010.

.0012 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un paciente polaco con deficiencia de factor VII (227500), Arbini et al. (1994) identificaron una deleción homocigótica de 1 pb (11128delC) en el gen F7, cambio de marco. Los niveles de actividad y antígeno del factor VII fueron inferiores al 4% de lo normal.

.0013 INFARTO DE MIOCARDIO, DISMINUCIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A

Girelli y col. (2000) encontraron que una inserción de 10 pb en la posición -323 en el promotor F7, conocida como polimorfismo de 5 primos F7, se asoció con una reducción sustancial en el riesgo de infarto de miocardio (608446) en pacientes con enfermedad grave documentada angiográficamente. arterioesclerosis coronaria. El alelo A2, como se denomina la inserción de 10 pb, se encontró en homocigosidad en aproximadamente el 4% de los pacientes y controles. Se encontró que el alelo A2 estaba en desequilibrio de ligamiento con el polimorfismo R353Q (613878.0014), que se asocia independientemente con una menor incidencia de MI entre los pacientes con aterosclerosis coronaria documentada. Los pacientes con el genotipo A2A2 tenían un nivel de factor VII activado que era un 66% más bajo que los niveles de aquellos con el genotipo de tipo salvaje.

.0014 INFARTO DE MIOCARDIO, DISMINUCIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A

Girelli y col. (2000) encontraron que los individuos portadores de un polimorfismo arg353-a-gln (R353Q) en el gen F7 tenían una incidencia notablemente menor de infarto de miocardio (608446) a pesar de la aterosclerosis coronaria severa documentada angiográficamente. El genotipo QQ se asoció con una reducción del 72% de la actividad del factor VII activado en comparación con el genotipo salvaje. Los portadores heterocigotos del alelo Q tenían un riesgo de infarto de miocardio de 0,47 en comparación con los pacientes con el genotipo salvaje (IC del 95%, 0,27-0,81). Se encontró que el alelo Q estaba en desequilibrio de ligamiento con el alelo A2 del polimorfismo F7 de 5 primos (613878.0013). Cada uno se asoció de forma independiente con una disminución del riesgo de infarto de miocardio entre los pacientes con aterosclerosis coronaria grave.

.0015 FACTOR VII DEFICIENCIA

Arbini y col. (1997) identificaron una sustitución homocigótica de T a G en la posición -61 dentro de la región reguladora de 5 primos del gen F7 en un paciente con deficiencia severa de factor VII (227500). La mutación eliminó por completo la interacción con el receptor nuclear huérfano HNF4 (600281). En los ensayos del gen indicador de la hormona del crecimiento, la actividad de un plásmido que contiene el promotor mutante fue del 6,7% del tipo salvaje. Los hallazgos indicaron que HNF4 ejerce un efecto regulador positivo importante sobre la expresión de F7 y proporcionaron evidencia in vivo de que la unión de este factor de transcripción es crítica para la expresión normal del factor VII.

.0016 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un paciente francocanadiense de una familia consanguínea con deficiencia grave de factor VII (227500), Carew et al. (1998) identificaron una transversión homocigótica de C a G en la posición -94 en la región reguladora de 5 primos del gen F7. La mutación impidió la unión y transactivación de Sp1 (189906) y otras proteínas nucleares. El paciente tenía niveles plasmáticos residuales de menos del 1% de antígeno del factor VII y actividad coagulante del factor VII, y mostraba hemartrosis y artropatía crónica. Los datos subrayaron la importancia de esta región del promotor F7 para la expresión in vivo del gen F7.

.0017 FACTOR VII DEFICIENCIA

Carew y col. (2000) describieron a un hombre polaco de 25 años con deficiencia severa de factor VII (227500) que era heterocigoto compuesto para 2 mutaciones en el gen F7. El alelo paterno contenía 3 anomalías genéticas estructurales, y el alelo materno llevaba una transición de C a T en la posición -55 con respecto al sitio de inicio de la traducción. Esta mutación impidió parcialmente la unión del activador transcripcional HNF4 (600281) al promotor F7 al tiempo que redujo en gran medida la expresión del gen indicador en las células hepáticas.

.0018 FACTOR VII DEFICIENCIA

En una mujer china de 55 años con deficiencia de factor VII (225700), Au et al. (2000) identificaron heterocigosidad compuesta para 2 mutaciones en el gen F7: una transversión 6003C-A en el exón 4, que da como resultado una sustitución de cys61 a ter (C61X), y una transversión 10902T-G en el exón 8, que da como resultado una cys329 -to-gly (C329G 613878.0019) sustitución. Presentó hemoptisis y dolor en el hombro derecho, y se encontró que tenía artritis en el hombro derecho compatible con artropatía hemofílica crónica. Había tenido 3 partos vaginales sin complicaciones y no informó antecedentes de sangrado anormal. Sin embargo, sus 2 hermanos menores supuestamente murieron de hemorragia, uno al nacer y el otro a los 9 meses de edad. Dos hijas eran heterocigotas para la primera de estas mutaciones y mostraban un fenotipo compatible con una mutación sin sentido. Una hija era heterocigótica para la mutación C329G y mostraba niveles de antígeno normales, compatibles con una mutación sin sentido. Au et al. (2000) afirmaron que estas fueron las primeras mutaciones de F7 que se informaron en chino.

.0019 FACTOR VII DEFICIENCIA

Para la discusión de la mutación cys329-to-gly (C329G) en el gen F7 que se encontró en estado heterocigoto compuesto en un paciente con deficiencia de factor VII (225700) por Au et al. (2000), ver 613878.0018.

.0020 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un varón japonés de 10 meses con hemorragia intratorácica recurrente, hemorragias cerebrales y hemorragia gastrointestinal secundaria a una deficiencia grave del factor VII (227500), Takamiya y Okimoto (2001) encontraron heterocigosidad compuesta para 2 mutaciones en el gen F7: una 11099C- Transición de T en el exón 8, que da como resultado una mutación de gln211 a ter (Q211X) y un cambio de G a A en el nucleótido 6071 (indicado como 6070 en otro lugar), en el dinucleótido GT invariante en el sitio de empalme de 5 primos de intrón 4 (613878.0008).

.0021 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un hombre japonés asintomático de 46 años con actividad del factor VII y niveles de antígeno 1,2% y 21% de lo normal, respectivamente, Nagaizumi et al. (2002) encontraron 2 mutaciones nuevas en el gen F7: una transición 3895G-A en el exón 2, que da como resultado una mutación glu25-a-lys (E25K), y una transversión 10961T-G en el exón 8, que da como resultado una his348-a- mutación -gln (H348Q 613878.0022). Los hallazgos fueron consistentes con una deficiencia parcial del factor VII (227500). Los autores declararon que ambas mutaciones estaban "en el estado doblemente heterocigoto", pero deberían haber dicho "en el estado heterocigoto compuesto", ya que la heterocigosidad doble es heterocigosidad en cada uno de los 2 loci separados.

.0022 FACTOR VII DEFICIENCIA

Para la discusión de la mutación his348-a-gln (H348Q) en el gen F7 que se encontró en estado heterocigótico compuesto en un paciente con deficiencia parcial de factor VII (227500) por Nagaizumi et al. (2002), véase 613878.0021.

.0023 FACTOR VII DEFICIENCIA

En una mujer japonesa con epistaxis ocasional, Takamiya y Hino (2004) encontraron niveles bajos de actividad coagulante del factor VII y antígeno (227500). Ella era homocigótica para una mutación gly354-to-cys (G354C) en el dominio catalítico de la proteína. El análisis de haplotipos mostró que esta mutación fue heredada de sus padres consanguíneos. Aunque se estimó que el factor VII intracelular cys354 era el 67% de la proteína normal, en el medio durante los experimentos de expresión transitoria, tanto la actividad antígeno como la actividad coagulante se redujeron al 5% y 4%, respectivamente, de los niveles secretados por el factor VII de tipo salvaje. Takamiya y Hino (2004) propusieron que la introducción de un residuo de cisteína libre adicional en la molécula de factor VII resultó en la formación de enlaces disulfuro ilegítimos y un dominio mal plegado, lo que condujo a una secreción defectuosa.

.0024 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un hombre de 24 años con deficiencia grave de factor VII (227500), Bharadwaj et al. (1996) identificaron una transición homocigótica de 10907T-C en el exón 8 del gen F7, lo que resultó en una sustitución de phe328 a ser (F328S) en el dominio catalítico de la proteína. El antígeno del factor VII en plasma del paciente era un 38% de lo normal, pero la actividad del factor VII era menos del 1% de lo normal. Los estudios de expresión funcional mostraron que la proteína mutante tenía una afinidad 2 veces menor por el factor tisular y no pudo activar el factor X (ver 227600) o IX (300746) en presencia de factor tisular después de la activación por el factor Xa. La tasa de activación del factor VII F328S mutante por el factor Xa disminuyó notablemente en comparación con el tipo salvaje. El modelado por computadora y las simulaciones de dinámica molecular sugirieron que la incapacidad del factor VIIa F328S para escindir los sustratos resultó de la formación aparente de un enlace de hidrógeno entre tyr377 y asp338, un residuo en la parte inferior del bolsillo de unión al sustrato importante para la interacción del lado de la arginina del sustrato. cadenas con la enzima. Bharadwaj y col. (1996) concluyeron que phe328, que se conserva en protrombina (176930), factor IX, factor X, factor VII y tripsina (276000), es importante para la catálisis del factor VIIa.

▼ Ver también:

▼ REFERENCIAS

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* 613878

FACTOR DE COAGULACIÓN VII F7

Símbolos de títulos alternativos

FACTOR VII

Símbolo genético aprobado por HGNC: F7

Ubicación citogenética: 13q34 Coordenadas genómicas (GRCh38): 13: 113,105,772-113,120,684 (de NCBI)

Relaciones gen-fenotipo

Localización Fenotipo Fenotipo
Número MIM
Herencia Fenotipo
clave de mapeo
13q34 608446 3
Deficiencia de factor VII 227500 Autosómica recesiva 3

TEXTO

Descripción

El gen F7 codifica el factor de coagulación VII, que es el zimógeno del factor VIIa de proteasa sérica, una glicoproteína dependiente de la vitamina K que participa en la vía extrínseca de la coagulación sanguínea. Tras la lesión vascular, el factor VII entra en contacto con el factor tisular, también conocido como factor III o TFA (TF 134390), y se escinde a su forma activa: esta reacción es el evento principal en la coagulación sanguínea. El complejo de factor tisular y factor VII activado sirve para activar los factores IX (F9 300746), X (F10 613872) y (autocatalíticamente) factor VII (resumen de O'Hara et al., 1987 y Millar et al., 2000) .

Clonación y expresión

Hagen y col. (1986) aislaron clones correspondientes al gen F7 de una biblioteca de ADNc de hígado humano. La proteína se sintetiza con una secuencia líder y la proteína circulante madura es un polipéptido monocatenario que contiene 406 aminoácidos. La conversión del factor VII en factor VIIa activado se debe a la escisión de la serina proteasa del enlace entre arg152 e ile153. La forma activada del factor VII consiste en una cadena ligera de 152 residuos de 20 kD con residuos de ácido gamma-carboxiglutámico y una cadena pesada de 254 residuos de 30 kD, que contiene el dominio catalítico; las 2 cadenas se mantienen unidas por un enlace disulfuro . El factor VII humano es muy homólogo a otras proteínas dependientes de la vitamina K, como el factor IX (F9 300746), el factor X (F10 613872), el factor II (F2 176930) y la proteína C (PROC 612283).

O'Hara y col. (1987) determinaron la secuencia de nucleótidos del gen F7. El ARNm del factor VII está poliadenilado en múltiples sitios y puede someterse a un corte y empalme alternativo.

Estructura genética

O'Hara y col. (1987) determinaron que el gen F7 contiene 9 exones y abarca aproximadamente 12,8 kb.

Cartografía

El gen F7 se asigna al cromosoma 13q34 (Millar et al., 2000).

Por efectos de dosificación en 7 casos de cromosoma 13 anormal, Gilgenkrantz et al. (1986) mapearon los genes F7 y F10 (613872) en 13q34. Los factores de coagulación aumentaron en la trisomía de este segmento y disminuyeron en la monosomía.

Tariverdian y col. (1986) encontraron una deficiencia de los factores VII y X en un caso de anillo 13. El sitio de la ruptura fue consistente con la ubicación de los genes en el segmento 13q34-qter.

Función genética

La síntesis de los factores VII y X (613872), así como de los factores II (176930) y IX (264900), tiene lugar en el hígado y requiere vitamina K. Se han demostrado homologías estructurales de estos factores, que son precursores de las serina proteasas. (Zur y Nemerson, 1981). Ratnoff y Bennett (1973) afirmaron: "Aunque se puede argumentar de manera convincente que (ellos) se derivan de una sola molécula, la mayoría de la evidencia sugiere que son proteínas distintivas".

En una discusión de la biología molecular y celular de la coagulación sanguínea, Furie y Furie (1992) presentaron una figura que comparaba la estructura de los genes para 5 proenzimas, 3 procofactores y 2 proteínas reguladoras. Existían interesantes similitudes y diferencias para los miembros de cada categoría. Las 5 proenzimas fueron los factores VII, XI (264900), IX y X y la protrombina los 3 procofactores fueron el factor tisular y los factores VIII (F8 300841) y V (F5 612309) las proteínas reguladoras fueron la proteína C (PROC 612283) y la proteína S (PROS1 176880).

Pike y col. (1999) describieron sutiles diferencias estructurales que ocurren en el complejo factor VIIa / factor tisular, arrojando así luz sobre el mecanismo de la espectacular mejora inducida por el factor tisular de la actividad del factor VIIa.

Di Bitondo y col. (2002) utilizaron análisis de genes informadores para mostrar que la inclusión de regiones promotoras (residuos -658 a -1 y -348 a -1) de F7 reducía la actividad de transcripción en presencia de factores estrogénicos. El efecto fue independiente del haplotipo polimórfico del promotor. Los autores localizaron la secuencia a la que se unía el receptor de estrógeno a los residuos -225 a -212 del promotor F7. El elemento de respuesta de estrógeno F7 representa un tipo alternativo, en el que los 2 medios sitios están separados por solo 2 nucleótidos espaciadores. Los autores presentaron un mecanismo para la relación inversa entre F7 y los niveles de estradiol observados durante el ciclo menstrual.

Genética molecular

Girolami y col. (1977) observaron un factor VII cualitativamente anormal, denominado Verona, asociado con la deficiencia del factor VII.

Deficiencia de factor VII

En una mujer italiana con diátesis hemorrágica por deficiencia grave de factor VII (227500), Arbini et al. (1996) identificaron heterocigosidad compuesta para 2 mutaciones en el gen F7 (613878.0005 y 613878.0008).

Cooper y col. (1997) revisaron los estudios de estructura-función del factor VII basados ​​en el análisis de variantes naturales, incluidos los polimorfismos y las mutaciones subyacentes a la deficiencia del factor VII. Tabularon 30 sustituciones de pares de bases individuales diferentes y 4 deleciones cortas. La mayoría de las lesiones notificadas responsables de la deficiencia de factor VII se habían observado solo una vez. Las excepciones notables incluyeron la mutación ala244-a-val (A244V 613878.0006) encontrada en 23 individuos homocigotos y 10 heterocigotos de origen judío marroquí / iraní por Tamary et al. (1996).

En 2 hermanos bebés, nacidos de padres consanguíneos, con deficiencia severa de factor VII que resultó en muerte prematura debido a hemorragia intracraneal, McVey et al. (1998) identificaron una mutación del sitio de empalme homocigoto en el gen F7 (613878.0008).

Wulff y Herrmann (2000) realizaron un cribado de mutaciones en 87 probandos no relacionados con actividades de factor VII reducidas o bajas. Entre los 101 alelos F7 de 77 probandos, se encontraron 34 lesiones diferentes, 22 de las cuales eran nuevas. Las 34 lesiones diferentes comprendían 31 mutaciones puntuales y 3 pequeñas deleciones. Una transición en el doblete CpG representó 12 de los 34 mutantes diferentes. Se observaron dieciséis mutaciones solo una vez. Con mucho, las mutaciones más comunes encontradas en este estudio en Alemania fueron la mutación sin sentido A294V (613878.0010) y la doble mutación A294V / 11128delC (613878.0012). Estas mutaciones están ubicadas en el exón 8 en el extremo carboxi-terminal del gen, donde se concentra el mayor número de mutaciones que causan la deficiencia del factor VII. Ambas mutaciones también son prevalentes en pacientes polacos e italianos (Arbini et al., 1994 Bernardi et al., 1994), lo que indica que representan las mutaciones F7 más frecuentes en las poblaciones europeas. Los estudios familiares mostraron el mismo haplotipo para ambas mutaciones.

Millar y col. (2000) secuenciaron el gen F7 en 48 individuos no emparentados con deficiencia de factor VII, produciendo un total de 23 lesiones nuevas, incluidas 15 mutaciones de sentido erróneo, 2 microdeleciones, 5 mutaciones de unión de empalme y una sustitución de un solo par de bases en la región no traducida de 5 primos.

McVey y col. (2001) describieron una base de datos de mutaciones en la que se registran mutaciones en el gen F7 de 238 individuos descritos en la literatura mundial. Se han identificado varios polimorfismos en el gen F7 y se ha demostrado que algunos influyen en los niveles de antígeno del factor VII en plasma.

Usando una combinación de DGGE y secuenciación directa de los 9 exones del gen F7, Giansily-Blaizot et al. (2001) investigaron 37 pacientes no emparentados, principalmente de origen francés y norteafricano, con una actividad coagulante del factor VII inferior al 5% de lo normal. Esta estrategia permitió la detección de 68 de los 74 alelos mutados predichos (92%). Se detectaron un total de 40 mutaciones diferentes en todo el gen, 18 de las cuales no se habían informado previamente. Los genotipos de los pacientes con diátesis hemorrágica grave comprendían mutaciones en ambos alelos, lo que impedía la producción de una molécula funcional de FVII. Los autores sugirieron que en los grupos leves y asintomáticos, una mutación no perjudicial en un alelo puede permitir la liberación de una cantidad mínima de proteína FVII que puede ser suficiente para desencadenar la cascada hemostática.

Disminución de la susceptibilidad al infarto de miocardio

Girelli y col. (2000) estudiaron 3 polimorfismos en el gen F7 y encontraron que 2 de ellos, el polimorfismo F7 de 5 primos (613878.0013) y R353Q (613878.0014), afectan el nivel de actividad del factor VII y dan como resultado un menor riesgo de infarto de miocardio (MI 608446) en pacientes con enfermedad de las arterias coronarias.Estudiaron a 444 pacientes, 311 de los cuales tenían aterosclerosis coronaria grave documentada mediante angiografía. De estos 311 pacientes, 175 tenían documentación de infarto de miocardio previo. También se incluyó en el estudio un grupo de control, 133 pacientes con arteriografías coronarias normales. El polimorfismo de 5 primos F7 implica una inserción de 10 pb en la posición -323 en la región promotora de 5 primos del gen F7, el alelo A1 corresponde a la ausencia del decámero, y el alelo A2 se refiere a su inserción. Los pacientes con el genotipo A2A2 tuvieron una reducción del 66% de la actividad del factor VII activado. El polimorfismo R353Q implica una mutación sin sentido en el codón 353 del gen F7, lo que da como resultado una sustitución de arg-a-glu. Los pacientes homocigotos para el alelo Q tuvieron una reducción del 72% de la actividad del factor VII activado. Se encontró que los alelos A2 y Q estaban en desequilibrio de ligamiento. Hubo significativamente más heterocigotos que homocigotos para los alelos A2 y Q entre los que no habían tenido un IM que entre los que sí. La razón de posibilidades ajustada para MI entre los pacientes con genotipo A1A2 o RQ fue de 0,47.

Historia

La posibilidad de que un gen en el cromosoma 8 regule el nivel del factor de coagulación VII (F7R, F7E) fue sugerida por la observación de la deficiencia de este factor en 3 sujetos trisómicos para ese cromosoma (de Grouchy et al., 1974). Fineman y col. (1975, 1979) podría corroborar los hallazgos de de Grouchy et al. (1974) pero Stenbjerg et al. (1975) no pudo. De Grouchy y col. (1984) concluyeron nuevamente que un gen regulador está en el cromosoma 8 y también presentaron resultados compatibles con la asignación del gen estructural para el factor VII (y el del factor X) a 13q34. En una nota agregada como prueba, de Grouchy et al. (1984) describieron el factor VII normal en un bebé con trisomía 8p debido a la duplicación en tándem, lo que sugiere que F7R puede estar en 8q. Sin embargo, Fagan et al. (1988), a partir de estudios citogenéticos y de coagulación en 2 pacientes con diferentes anomalías del cromosoma 8, concluyeron que la ubicación es 8p23.2-p23.1.

Modelo animal

Los experimentos de eliminación de genes de ratón indican que el factor tisular es esencial para el desarrollo embrionario más allá del día 9, y que los embriones homocigóticos con deficiencia de factor tisular no desarrollan una circulación en el saco vitelino (Toomey et al., 1996). Dado que el factor VII es el único ligando conocido de factor tisular, es probable que una desactivación del factor VII también sea letal.

El complejo F7a / TF cataliza la activación de los factores IX y X, lo que permite la generación posterior de trombina y, en última instancia, la formación de un coágulo de trombina. Si bien existen varias proteínas anticoagulantes para regular a la baja diferentes reacciones del sistema de coagulación, por ejemplo, proteína C activada, proteína S, cofactor II de heparina y antitrombina III, se sabe que solo el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI 152310) inhibe el complejo F7a / TF. Chan y col. (1999) generaron ratones doblemente heterocigotos para un alelo TFPI modificado que carece de su dominio 1 de tipo Kunitz y para una deficiencia del gen F7. Los experimentos de apareamiento indicaron que la progenie homocigótica individual para la modificación de TFPI pero con el alelo F7 de tipo salvaje y los ratones homocigotos individualmente para la deficiencia de F7 con el alelo de tipo salvaje TFPI mostraron fenotipos previamente detallados (es decir, un alto porcentaje de letalidad embrionaria temprana en el día embrionario 9.5 y normal desarrollo con hemorragia perinatal grave, respectivamente). Sorprendentemente, los ratones del genotipo combinado (doblemente homocigoto) nacieron con la frecuencia mendeliana esperada, pero sufrieron la hemorragia perinatal fatal asociada con el genotipo F7 - / -. Los ratones que portaban el genotipo F7 heterocigoto y el TFPI mutante homocigoto también se rescataron de la letalidad asociada con el genotipo F7 de tipo salvaje y el genotipo TFPI mutante homocigoto, pero sucumbieron a la coagulopatía de consumo perinatal. Por tanto, el rescate de embriones mutantes homocigotos de TFPI, ya sea por una deficiencia de F7 homocigótica o heterocigótica acompañante, sugirió que la disminución de la actividad de F7 excluye la necesidad de inhibición mediada por TFPI de la vía de coagulación de F7a / factor tisular durante la embriogénesis. Además, los fenotipos de estos estados de deficiencia combinados sugirieron que el F7 embrionario se produce en ratones tan pronto como el día embrionario 9.5 y que cualquier nivel de F7 materno en embriones en etapa temprana es insuficiente para causar una coagulopatía en ratones mutantes TFPI homocigotos.

Para determinar si una pérdida adicional del gen del factor VII influyó en la coagulopatía observada en embriones y neonatos con deficiencia del gen de proteína C (PC - / -), Chan et al. (2000) cruzaron ratones doblemente heterocigotos para los 2 factores para producir descendencia que poseyera las 9 combinaciones genotípicas predichas. Los embriones doblemente nulos, aunque presentes en su frecuencia mendeliana esperada, mostraron un fenotipo que no se había observado en los embriones con deficiencia simple de factor VII o proteína C. A los 12,5 días después del coito, los embriones doblemente nulos demostraron una coagulopatía intra y extravascular que progresó con hemorragia concomitante sustancial y edema periférico hacia el día E17,5, lo que provocó la muerte inmediatamente después del nacimiento. Los embriones de FVII (+/-) / PC (- / -) mostraron un fenotipo menos severo, lo que sugiere un efecto de dosificación genética. Se pensó que la falta de rescate de embriones y neonatos PC - / - y el aumento de la coagulopatía resultante de una deficiencia adicional de FVII heterocigoto u homocigoto se debían al aumento del factor Xa (613872) y la generación de trombina, como resultado de la pérdida de la vía del factor tisular dependiente de FVIIa función inhibidora y ausencia de control a los niveles de los factores Va y VIIIa. La presencia de fibrina en embriones en ausencia de factor VII fetal sugirió que existe un potencial significativo de generación de coágulos fuera de la vía dependiente del factor VII embrionario.

VARIANTES ALÉLICAS 24 ejemplos seleccionados):

.0001 FACTOR VII PADUA

En un hombre de 47 años sin tendencia clínica al sangrado pero con actividad del factor VII plasmático indetectable cuando se probó en un ensayo de una etapa con factor de tejido cerebral de conejo, O'Brien et al. (1991) identificaron una transición heterocigótica de G a A en el gen F7, lo que resultó en una sustitución de arg304 a gln (R304Q). El plasma del paciente mostró niveles normales de antígeno del factor VII. El residuo arg304 es homólogo a arg333 del factor IX, y se ha identificado una mutación de arg333 a gln en F9 (300746.0056) en pacientes con hemofilia B grave (306900) en los que hay síntesis y expresión de la proteína del factor IX.

Marchetti y col. (1992) identificaron una sustitución heterocigótica R304Q en el gen F7 como la base del factor VII Padua anormal, descrito por Girolami et al. (1982) en personas originarias del valle del río Piave en el noreste de Italia. Los individuos descritos por Girolami et al. (1982) fueron asintomáticos, pero presentaron una leve prolongación del tiempo de protrombina. La actividad del factor VII varió entre el 45% y el 61% de lo normal, pero el material de reacción cruzada del factor VII fue normal. Se encontró una buena correlación negativa entre el nivel de factor VII y los tiempos de protrombina.

.0002 FACTOR VII DEFICIENCIA

En 2 pacientes de diferentes regiones de Italia con deficiencia de factor VII (227500), Marchetti et al. (1992) encontraron una transversión de G-a-T en el gen F7, lo que resultó en una sustitución de cys310-a-phe (C310F), que suprimió un enlace disulfuro conservado en el dominio catalítico de todas las serina proteasas. En la forma homocigótica, la mutación provocó una reducción severa de la actividad de la proteasa (4%).

.0003 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un paciente con antígeno F7 y actividad F7 al nivel del 30% y 37%, respectivamente, compatible con deficiencia parcial de factor VII (227500), Marchetti et al. (1993) identificaron una transición heterocigótica de G a A en el exón 7 del gen F7, lo que resultó en una sustitución de cys178 a tyr (C178Y) en el dominio catalítico. La anomalía se detectó en una prueba de detección preoperatoria. También se encontraron dimorfismos neutros: uno en el codón 115 para histidina y otro en el codón 353 para arginina (R353Q 613878.0014).

.0004 FACTOR VII DEFICIENCIA

Ohiwa y col. (1994) encontraron una deficiencia asintomática homocigótica de factor VII (227500) en una familia comprobada a través de una proposita de 45 años que se observó que tenía un tiempo de protrombina prolongado. El nivel de antígeno del factor VII en el caso índice fue del 25,9% de lo normal y el nivel de actividad del factor VII fue del 28% y el 24%, según la prueba utilizada. Se encontraron casi los mismos niveles reducidos de antígeno y actividad del factor VII en 2 de sus hermanas, y sus padres, que eran primos hermanos, un hijo, una hija y una sobrina, tenían niveles moderadamente reducidos de actividad y antígeno del factor VII. Los estudios moleculares identificaron una transición de G a A en el exón 8, lo que resultó en una sustitución de arg247 a his (R247H). Los ensayos de expresión transitoria sugirieron que la sustitución conduce a una deficiencia de factor VII al alterar la secreción de la proteína mutada. Esta mutación se denominó factor VII Mie.

.0005 FACTOR VII DEFICIENCIA

En una mujer italiana de 36 años con deficiencia grave de factor VII (227500), Arbini et al. (1996) identificaron heterocigosidad compuesta para 2 mutaciones en el gen F7: una transición 1994C-T, que resulta en una sustitución de thr359-a-met (T359M), y una transición de G-a-A en el intrón 4 (613878.0008), lo que resulta en un defecto de empalme y procesamiento anormal del ARNm. Los estudios de expresión celular mostraron que la proteína mutante T359M se acumulaba intracelularmente y no se detectaba factor VII en el medio después de 3 horas de persecución. Las cadenas laterales de carbohidratos asociadas con la proteína T359M mutante eran sensibles a la digestión con endo-beta-N-acetilglucosaminidasa H (endo H), lo que indicaba que la proteína estaba retenida en el retículo endoplásmico. Arbini y col. (1996) concluyeron que la mutación T359M en F9 da como resultado un defecto de secreción severo que probablemente es consecuencia de un plegamiento anormal de la molécula. El paciente presentaba epistaxis recurrente, fácil hematoma, menorragia, hemartrosis de rodilla derecha y hemorragia mayor tras la extracción dentaria. Un hermano del paciente falleció a los 7 años con epistaxis incontrolada.

.0006 FACTOR VII DEFICIENCIA

En 13 pacientes israelíes con deficiencia de factor VII (225700), Tamary et al. (1996) identificaron una transición homocigótica de 10648C-T en el gen F7, lo que resultó en una sustitución de ala244 a val (A244V). La mutación se asoció con una disminución de la actividad del factor VII y los niveles de antígeno. Diez pacientes adicionales eran heterocigotos para la mutación. De los 36 alelos A244V, 20 se observaron en pacientes de origen marroquí, 10 en pacientes judíos iraníes y 6 en pacientes de otros orígenes étnicos. Un modelo informático del dominio de serina proteasa del factor VII sugirió a Tamary et al. (1996) que la sustitución de A244V puede provocar la distorsión de toda la estructura de la proteína. Los análisis de sitios polimórficos intragénicos (análisis de haplotipos) revelaron un efecto fundador para los pacientes marroquíes e iraníes-judíos. Se encontró que la mutación A244V tiene una frecuencia alélica de 1: 42,5 en judíos marroquíes y 1:40 en judíos iraníes. Como los judíos marroquíes han estado separados de los judíos iraníes durante más de 2.000 años, los datos sugieren que la mutación A244V ocurrió en la antigüedad.

.0007 FACTOR VII DEFICIENCIA

En miembros afectados de una familia con deficiencia de factor VII (613878), Leonard et al. (1998) identificaron una transición heterocigótica 5989G-A en el exón 5 del gen F7, lo que resultó en un cambio de aminoácido asn75 a asp (N57D) en el dominio EGF1 de la proteína del factor VII. Los individuos mostraron una actividad procoagulante reducida en relación con el antígeno del factor VII. Los ensayos de expresión funcional in vitro mostraron que la mutación N57D afecta al plegamiento del primer dominio EGF1, lo que da como resultado una secreción celular disminuida de un F7 mutante que no puede unirse al factor tisular y, por lo tanto, es biológicamente inactivo.

.0008 FACTOR VII DEFICIENCIA

En 2 hermanos, nacidos de padres consanguíneos, con deficiencia severa de factor VII (227500), McVey et al. (1998) identificaron una transición homocigótica de G a A en el intrón 4 del gen F7, lo que resultó en una mutación del sitio de corte y empalme, la omisión del exón 4 y un ARNm que codifica el factor VII con una deleción en el marco del primer crecimiento epidérmico. dominio similar al factor. La mutación ocurrió en un dinucleótido GT invariante en el sitio de empalme 5-primo del intrón 4. Un hermanito y una hermana murieron a los 10 días y 1 mes de edad, respectivamente, de hemorragia intracraneal relacionada con una deficiencia grave del factor VII, los padres no se vieron afectados. En esta familia, la deficiencia completa de factor VII se asoció con una diátesis hemorrágica grave pero sin anomalías del desarrollo, lo que sugiere que el factor VII fetal no es necesario para las funciones angiogénicas putativas del factor tisular (F3 134390) en humanos.

Ver también 613878.0005 y Arbini et al. (1996).

.0009 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un varón japonés de 82 años con pólipos en el colon en el que se descubrió una deficiencia del factor VII (227500) en el curso de estudios preoperatorios, Ozawa et al. (1998) identificaron una transición 38T-C homocigótica en el gen F7, lo que resultó en una sustitución de leu a pro en el codón -26 (L-26P) en el núcleo hidrófobo del péptido señal. Se predijo que esta sustitución afectaría la translocación de la proteína al retículo endoplásmico y provocaría una reducción de los niveles plasmáticos de factor VII. El paciente no tuvo episodios hemorrágicos, la variante se denominó factor VII Morioka.

.0010 FACTOR VII DEFICIENCIA

En 2 hermanos con deficiencia parcial de factor VII (227500), Bernardi et al. (1994) identificaron heterocigosidad compuesta para 2 mutaciones en el gen F7: una transición 10798C-T en el exón 8, que da como resultado una sustitución de ala294 a val (A294V), y una deleción de 17 pb que conduce a un cambio de marco y una terminación prematura en el codón 255 (613878.0011). Los niveles de antígeno del factor VII fueron 38% y 25% de lo normal, y los niveles de actividad fueron 18% y 7% de lo normal, respectivamente.

En un estudio en Alemania, Wulff y Herrmann (2000) encontraron que la mutación sin sentido A294V y la doble mutación A294V / 11128delC (613878.0012) eran, con mucho, las más prevalentes.

.0011 FACTOR VII DEFICIENCIA

Para la discusión de la deleción de 17 pb en el gen F7 que se encontró en el estado heterocigótico compuesto en pacientes con deficiencia parcial del factor VII (227500) por Bernardi et al. (1994), véase 613878.0010.

.0012 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un paciente polaco con deficiencia de factor VII (227500), Arbini et al. (1994) identificaron una deleción homocigótica de 1 pb (11128delC) en el gen F7, cambio de marco. Los niveles de actividad y antígeno del factor VII fueron inferiores al 4% de lo normal.

.0013 INFARTO DE MIOCARDIO, DISMINUCIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A

Girelli y col. (2000) encontraron que una inserción de 10 pb en la posición -323 en el promotor F7, conocida como polimorfismo de 5 primos F7, se asoció con una reducción sustancial en el riesgo de infarto de miocardio (608446) en pacientes con enfermedad grave documentada angiográficamente. arterioesclerosis coronaria. El alelo A2, como se denomina la inserción de 10 pb, se encontró en homocigosidad en aproximadamente el 4% de los pacientes y controles. Se encontró que el alelo A2 estaba en desequilibrio de ligamiento con el polimorfismo R353Q (613878.0014), que se asocia independientemente con una menor incidencia de MI entre los pacientes con aterosclerosis coronaria documentada. Los pacientes con el genotipo A2A2 tenían un nivel de factor VII activado que era un 66% más bajo que los niveles de aquellos con el genotipo de tipo salvaje.

.0014 INFARTO DE MIOCARDIO, DISMINUCIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A

Girelli y col. (2000) encontraron que los individuos portadores de un polimorfismo arg353-a-gln (R353Q) en el gen F7 tenían una incidencia notablemente menor de infarto de miocardio (608446) a pesar de la aterosclerosis coronaria severa documentada angiográficamente. El genotipo QQ se asoció con una reducción del 72% de la actividad del factor VII activado en comparación con el genotipo salvaje. Los portadores heterocigotos del alelo Q tenían un riesgo de infarto de miocardio de 0,47 en comparación con los pacientes con el genotipo salvaje (IC del 95%, 0,27-0,81). Se encontró que el alelo Q estaba en desequilibrio de ligamiento con el alelo A2 del polimorfismo F7 de 5 primos (613878.0013). Cada uno se asoció de forma independiente con una disminución del riesgo de infarto de miocardio entre los pacientes con aterosclerosis coronaria grave.

.0015 FACTOR VII DEFICIENCIA

Arbini y col. (1997) identificaron una sustitución homocigótica de T a G en la posición -61 dentro de la región reguladora de 5 primos del gen F7 en un paciente con deficiencia severa de factor VII (227500). La mutación eliminó por completo la interacción con el receptor nuclear huérfano HNF4 (600281). En los ensayos del gen indicador de la hormona del crecimiento, la actividad de un plásmido que contiene el promotor mutante fue del 6,7% del tipo salvaje. Los hallazgos indicaron que HNF4 ejerce un efecto regulador positivo importante sobre la expresión de F7 y proporcionaron evidencia in vivo de que la unión de este factor de transcripción es crítica para la expresión normal del factor VII.

.0016 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un paciente francocanadiense de una familia consanguínea con deficiencia grave de factor VII (227500), Carew et al. (1998) identificaron una transversión homocigótica de C a G en la posición -94 en la región reguladora de 5 primos del gen F7. La mutación impidió la unión y transactivación de Sp1 (189906) y otras proteínas nucleares. El paciente tenía niveles plasmáticos residuales de menos del 1% de antígeno del factor VII y actividad coagulante del factor VII, y mostraba hemartrosis y artropatía crónica. Los datos subrayaron la importancia de esta región del promotor F7 para la expresión in vivo del gen F7.

.0017 FACTOR VII DEFICIENCIA

Carew y col. (2000) describieron a un hombre polaco de 25 años con deficiencia severa de factor VII (227500) que era heterocigoto compuesto para 2 mutaciones en el gen F7. El alelo paterno contenía 3 anomalías genéticas estructurales, y el alelo materno llevaba una transición de C a T en la posición -55 con respecto al sitio de inicio de la traducción. Esta mutación impidió parcialmente la unión del activador transcripcional HNF4 (600281) al promotor F7 al tiempo que redujo en gran medida la expresión del gen indicador en las células hepáticas.

.0018 FACTOR VII DEFICIENCIA

En una mujer china de 55 años con deficiencia de factor VII (225700), Au et al. (2000) identificaron heterocigosidad compuesta para 2 mutaciones en el gen F7: una transversión 6003C-A en el exón 4, que da como resultado una sustitución de cys61 a ter (C61X), y una transversión 10902T-G en el exón 8, que da como resultado una cys329 -to-gly (C329G 613878.0019) sustitución. Presentó hemoptisis y dolor en el hombro derecho, y se encontró que tenía artritis en el hombro derecho compatible con artropatía hemofílica crónica. Había tenido 3 partos vaginales sin complicaciones y no informó antecedentes de sangrado anormal. Sin embargo, sus 2 hermanos menores supuestamente murieron de hemorragia, uno al nacer y el otro a los 9 meses de edad. Dos hijas eran heterocigotas para la primera de estas mutaciones y mostraban un fenotipo compatible con una mutación sin sentido. Una hija era heterocigótica para la mutación C329G y mostraba niveles de antígeno normales, compatibles con una mutación sin sentido. Au et al. (2000) afirmaron que estas fueron las primeras mutaciones de F7 que se informaron en chino.

.0019 FACTOR VII DEFICIENCIA

Para la discusión de la mutación cys329-to-gly (C329G) en el gen F7 que se encontró en estado heterocigoto compuesto en un paciente con deficiencia de factor VII (225700) por Au et al. (2000), ver 613878.0018.

.0020 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un varón japonés de 10 meses con hemorragia intratorácica recurrente, hemorragias cerebrales y hemorragia gastrointestinal secundaria a una deficiencia grave del factor VII (227500), Takamiya y Okimoto (2001) encontraron heterocigosidad compuesta para 2 mutaciones en el gen F7: una 11099C- Transición de T en el exón 8, que da como resultado una mutación de gln211 a ter (Q211X) y un cambio de G a A en el nucleótido 6071 (indicado como 6070 en otro lugar), en el dinucleótido GT invariante en el sitio de empalme de 5 primos de intrón 4 (613878.0008).

.0021 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un hombre japonés asintomático de 46 años con actividad del factor VII y niveles de antígeno 1,2% y 21% de lo normal, respectivamente, Nagaizumi et al. (2002) encontraron 2 mutaciones nuevas en el gen F7: una transición 3895G-A en el exón 2, que da como resultado una mutación glu25-a-lys (E25K), y una transversión 10961T-G en el exón 8, que da como resultado una his348-a- mutación -gln (H348Q 613878.0022). Los hallazgos fueron consistentes con una deficiencia parcial del factor VII (227500).Los autores declararon que ambas mutaciones estaban "en el estado doblemente heterocigoto", pero deberían haber dicho "en el estado heterocigoto compuesto", ya que la heterocigosidad doble es heterocigosidad en cada uno de los 2 loci separados.

.0022 FACTOR VII DEFICIENCIA

Para la discusión de la mutación his348-a-gln (H348Q) en el gen F7 que se encontró en estado heterocigótico compuesto en un paciente con deficiencia parcial de factor VII (227500) por Nagaizumi et al. (2002), véase 613878.0021.

.0023 FACTOR VII DEFICIENCIA

En una mujer japonesa con epistaxis ocasional, Takamiya y Hino (2004) encontraron niveles bajos de actividad coagulante del factor VII y antígeno (227500). Ella era homocigótica para una mutación gly354-to-cys (G354C) en el dominio catalítico de la proteína. El análisis de haplotipos mostró que esta mutación fue heredada de sus padres consanguíneos. Aunque se estimó que el factor VII intracelular cys354 era el 67% de la proteína normal, en el medio durante los experimentos de expresión transitoria, tanto la actividad antígeno como la actividad coagulante se redujeron al 5% y 4%, respectivamente, de los niveles secretados por el factor VII de tipo salvaje. Takamiya y Hino (2004) propusieron que la introducción de un residuo de cisteína libre adicional en la molécula de factor VII resultó en la formación de enlaces disulfuro ilegítimos y un dominio mal plegado, lo que condujo a una secreción defectuosa.

.0024 FACTOR VII DEFICIENCIA

En un hombre de 24 años con deficiencia grave de factor VII (227500), Bharadwaj et al. (1996) identificaron una transición homocigótica de 10907T-C en el exón 8 del gen F7, lo que resultó en una sustitución de phe328 a ser (F328S) en el dominio catalítico de la proteína. El antígeno del factor VII en plasma del paciente era un 38% de lo normal, pero la actividad del factor VII era menos del 1% de lo normal. Los estudios de expresión funcional mostraron que la proteína mutante tenía una afinidad 2 veces menor por el factor tisular y no pudo activar el factor X (ver 227600) o IX (300746) en presencia de factor tisular después de la activación por el factor Xa. La tasa de activación del factor VII F328S mutante por el factor Xa disminuyó notablemente en comparación con el tipo salvaje. El modelado por computadora y las simulaciones de dinámica molecular sugirieron que la incapacidad del factor VIIa F328S para escindir los sustratos resultó de la formación aparente de un enlace de hidrógeno entre tyr377 y asp338, un residuo en la parte inferior del bolsillo de unión al sustrato importante para la interacción del lado de la arginina del sustrato. cadenas con la enzima. Bharadwaj y col. (1996) concluyeron que phe328, que se conserva en protrombina (176930), factor IX, factor X, factor VII y tripsina (276000), es importante para la catálisis del factor VIIa.

Ver también:

REFERENCIAS

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Typhonium flagelliforme induce la apoptosis en las células CEMss mediante la activación de la caspasa-9, la escisión de PARP y el citocromo C liberación: Su activación junto con la detención del ciclo celular de la fase G0 / G1

La planta Typhonium flagelliforme (TF), comúnmente conocido como "tubérculo de roedor" en Malasia, se utiliza a menudo como remedio tradicional para el cáncer, incluida la leucemia.

Objetivo del estudio

Anteriormente habíamos identificado morfológicamente que la fracción rica en ácido linoleico (DCM / F7) de los tubérculos de esta planta induce efectos antiproliferativos selectivos y apoptosis en células CEMss. En el presente estudio, sometimos la misma fracción de DCM / F7 a análisis de actividad basados ​​en células para determinar el posible mecanismo de muerte celular en células CEMss leucémicas. in vitro.

Materiales y métodos

Extracción de Typhonium flagelliforme tubérculo y el fraccionamiento mediante cromatografía en columna líquida al vacío. La actividad antiproliferativa se evaluó usando MTT y la detección de apoptosis se realizó mediante anexina V y ensayo de escalera de ADN. Se empleó un ensayo colorimétrico de caspasa y un análisis de inmunotransferencia para detectar la expresión de proteína asociada con la muerte celular. El análisis del ciclo celular se realizó mediante citometría de flujo.

Resultados

Encontramos que el efecto inhibidor del cáncer de la fracción DCM / F7 en las células CEMss fue de 3 ± 0,08 μg / ml (IC50). Se observó una inducción apoptótica temprana en las células CEMss mediante el ensayo de Anexina V, que mostró una clara fragmentación del ADN dependiente de la dosis que se observaba en la electroforesis en gel a 10 y 20 μg / ml. La fracción DCM / F7 a 3 μg / ml detuvo significativamente las células CEMss en la fase G0 / G1 (pag & lt 0,05). Se observó un índice Sub-G0 / G1 constante pero creciente relacionado con el patrón entre las 12 y las 72 h de tratamiento. En relación con esto, investigamos más a fondo los eventos bioquímicos que conducen a la muerte celular y descubrimos que la fracción DCM / F7 aumentaba los niveles celulares de caspasa-3 y -9 en las células tratadas. Nuestros resultados indicaron que el citocromo c de las mitocondrias al citosol aumentaba gradualmente a medida que aumentaba la concentración de DCM / F7, lo que más tarde conducía a la posterior escisión de PARP en fragmentos de 85 kDa. Por el contrario, se encontró que la proteína Bcl-2 disminuía concomitantemente durante el tratamiento.

Conclusiones

En conjunto, los resultados presentados en este estudio demostraron que la fracción DCM / F7 inhibió la proliferación de células leucémicas, lo que condujo a la muerte celular programada, que se confirmó a través de la vía mitocondrial.


INTRODUCCIÓN

La gran región cis-reguladora del BX-C se divide en nueve dominios de cromatina específicos de parasegmento que controlan la expresión de los tres genes homeóticos BX-C a lo largo del eje anteroposterior (AP) (Ubx, abd-A y Abd-B) (para revisiones, ver Duncan, 1987 Maeda y Karch, 2006). El patrón de expresión específico del parasegmento preciso de estos genes determina la identidad segmentaria de cada uno de los segmentos de los dos tercios posteriores de la mosca. Cada dominio se mantiene separado y autónomo por elementos especializados conocidos como límites de dominio (Barges et al., 2000 Gyurkovics et al., 1990 Karch et al., 1994 Mihaly et al., 1997). En las construcciones transgénicas, estos elementos límite se comportan como aislantes, bloqueando la actividad potenciadora cuando se colocan entre el potenciador y su promotor objetivo (Barges et al., 2000 Gruzdeva et al., 2005 Hagstrom et al., 1996 Zhou et al., 1996). Sin embargo, dentro de su contexto nativo, a menudo se encuentran entre un potenciador y su promotor objetivo. La forma en que los potenciadores BX-C eluden los límites intermedios sigue siendo un tema de controversia.

Las supresiones de límites indican que estos elementos son necesarios para proporcionar autonomía funcional a los potenciadores y silenciadores dentro de la gran región reguladora cis. los Fab-7 El elemento límite, por ejemplo, se encuentra normalmente separando el iab-6 y iab-7 dominios cis-reguladores (ver Fig. 1A). los iab-6 La región potenciadora controla el nivel de Abd-B expresión en el parasegmento 11 (PS11) y determina la identidad del segmento A6. los iab-7 región, sin embargo, controla el nivel de Abd-Bexpresión en PS12 y determina la identidad del segmento A7 (Celniker et al., 1990 Galloni et al., 1993 Mihaly et al., 2006 Sanchez-Herrero, 1991). Cuando Fab-7 se elimina, el iab-6 y iab-7 Los dominios se fusionan en un solo dominio, lo que permite tanto la iab-6 y iab-7 potenciadores o silenciadores para que se activen en PS11 y PS12. En la mayoría de las celdas de PS11, el iab-7 los potenciadores son activados por iab-6 elementos de iniciación, lo que resulta en una transformación homeótica de PS11 / A6 en PS12 / A7. Sin embargo, en otras celdas de PS11, el iab-6los iniciadores no activan el dominio fusionado antes iab-7 Los elementos de respuesta de Polycomb (PRE) silencian el dominio, haciendo que estas células adquieran una identidad PS10 / A5 (Galloni et al., 1993 Gyurkovics et al., 1990 Mihaly et al., 1997).

Anteriormente, hemos demostrado que aisladores como gitano(Geyer y Corces, 1992) o scs (Kellum y Schedl, 1992) no puede sustituir a Fab-7 dentro de BX-C (Hogga et al., 2001). Ambos aisladores bloquean las interacciones entre el distal Abd-B potenciadores y el Abd-B promotor. Para probar si los límites del BX-C pueden reemplazarse funcionalmente entre sí, utilizamos la conversión de genes para intercambiar el Fab-7 y Fab-8 límites dentro del BX-C. Aunque estos dos límites realizan funciones similares, comparten poca identidad de secuencia. Sorprendentemente, encontramos que el Fab-7 límite es casi completamente capaz de reemplazar el Fab-8 límite, lo que indica que existe una similitud en el mecanismo de la función de límite que no se puede predecir mediante el análisis de secuencia moderno.


La plasticidad epigenética impulsa la diferenciación adipogénica y osteogénica de las células madre mesenquimatosas derivadas de la médula ósea *

La diferenciación terminal de las células madre multipotentes se logra a través de una cascada coordinada de factores de transcripción activados y modificaciones epigenéticas que impulsan la transcripción genética responsable del destino celular único. Dentro del linaje mesenquimatoso, factores como RUNX2 y PPARγ son indispensables para la osteogénesis y la adipogénesis, respectivamente. Por lo tanto, investigamos la unión genómica de los factores de transcripción y las modificaciones epigenéticas acompañantes que ocurren durante la diferenciación osteogénica y adipogénica de las células madre mesenquimales (MSC) derivadas de la médula ósea de ratón. Según la evaluación de los análisis de secuenciación de ChIP y de secuenciación de ARN, encontramos que los genes vitales para la identidad osteogénica estaban vinculados a los sitios de unión de RUNX2, C / EBPβ, receptor de retinoide X y receptor de vitamina D, mientras que la diferenciación de adipocitos favoreció a PPARγ, receptor de retinoide X, Sitios de unión de C / EBPα y C / EBPβ. Las marcas epigenéticas fueron claros predictores de los loci de diferenciación activa, así como de las actividades potenciadoras y la expresión génica selectiva. Estas CMM derivadas de la médula ósea mostraron un patrón epigenético que sugería una preferencia predeterminada por la vía osteogénica; sin embargo, estos patrones se alteraron rápidamente cerca de la Adipoq, Cidec, Fabp4, Lipe, Plin1, Pparg, y Cebpa genes durante la diferenciación adipogénica. Sorprendentemente, encontramos que estas células también exhibieron una plasticidad epigenética que les permitió trans-diferenciarse de adipocitos a osteoblastos (y viceversa) después del compromiso, según lo evaluado por tinción, expresión génica y análisis de PCR cuantitativo de ChIP. La vía predeterminada osteogénica puede alterarse durante las condiciones patológicas, lo que conduce a la fragilidad esquelética y al aumento de la adiposidad medular durante el envejecimiento, la deficiencia de estrógenos y la descarga esquelética. Tomados en conjunto, nuestros datos proporcionan una mayor comprensión mecanicista de los programas epigenéticos necesarios para la diferenciación multipotente de las CMM que pueden resultar beneficiosas en el desarrollo de estrategias terapéuticas.

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones DK-072281 (para J. W. P.) y AR-066616 (para J. R.). Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses con el contenido de este artículo. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no necesariamente representa las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Todos los conjuntos de datos de ChIP-seq y RNA-seq (incluidos archivos de secuenciación sin procesar, picos, bedGraphs y RPKM) se publican bajo SuperSeries GSE79815 en NCBI Gene Expression Omnibus (GEO). Los concentradores de pistas ChIP-seq están disponibles públicamente para este estudio en el repositorio del concentrador UCSC Genome Browser.


¿Cómo reparo un horno GE con un código de error F7?

Para reparar un horno GE con un código de error F7, determine la causa exacta del problema. Por lo general, la placa de control o el panel de teclas deben reemplazarse para solucionar el problema. Las reparaciones pueden requerir varias horas.

    Aislar el problema

Para determinar la causa exacta del código de error F7, presione el botón Apagado o Borrar en el panel de control y desenchufe el horno. Desconecte el conector de cinta en el tablero de control y enchufe el horno. Si el código F7 aparece después de 30 segundos, puede ser necesario reemplazar el tablero de control. La ausencia del código indica la necesidad de reemplazar el panel de teclas. Se puede usar un ohmímetro para probar el panel de teclas antes de reemplazarlo si hay dudas sobre qué parte debe reemplazarse.

Desenchufe el horno y consulte el manual del propietario para localizar la posición exacta del panel de teclas o del tablero de control. El panel de teclas y el tablero de control generalmente se encuentran detrás de la pantalla del reloj en los hornos GE. Desconecte la pieza apropiada y reemplácela. Vuelva a conectar el cableado apropiado.

Vuelva a colocar el panel de acceso y encienda el horno para determinar si se ha resuelto el problema.


Información del autor

Estos autores contribuyeron igualmente: Fatma-Elzahraa Eid, Haitham A. Elmarakeby, Yujia Alina Chan.

Afiliaciones

Broad Institute of MIT y Harvard, Cambridge, MA, EE. UU.

Fatma-Elzahraa Eid, Haitham A. Elmarakeby, Yujia Alina Chan, Nadine Fornelos, Eliezer M. Van Allen y Kasper Lage

Departamento de Ingeniería de Sistemas e Informática, Universidad Al-Azhar, El Cairo, Egipto

Fatma-Elzahraa Eid y haitham A. Elmarakeby

Instituto del Cáncer Dana-Farber, Boston, MA, EE. UU.

Haitham A. Elmarakeby y Eliezer M. Van Allen

Departamento de Informática y Sistemas, División de Investigación en Ingeniería, Centro Nacional de Investigación, Giza, Egipto

Instituto Politécnico y Universidad Estatal de Virginia, Blacksburg, VA, EE. UU.

Departamento de Cirugía, Hospital General de Massachusetts, Boston, MA, EE. UU.

Escuela de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

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Contribuciones

TARIFA. y K.L. concibió y diseñó el estudio. TARIFA. desarrolló el enfoque de auditoría, analizó los datos e implementó el estudio con el aporte de H.E. y K.L. F.E.E., Y.A.C., N.F. y K.L. escribió el artículo con aportes de todos los autores. Y.A.C. y N.F. editó y revisó sustancialmente el documento. M.E., E.V.A., L.S.H. y K.L. supervisó el estudio. Todos los autores leyeron y aprobaron el artículo.

Autores correspondientes


¿Qué son las teclas F1 a F12?

los teclas de función o Teclas F en un teclado de computadora, etiquetado F1 mediante F12, son teclas con una función especial definida por el sistema operativo o el programa activo. En ciertos casos, se pueden combinar con las teclas Alt o Ctrl.

En algunos teclados y computadoras portátiles más pequeños, las teclas F pueden tener un propósito específico, como cambiar el brillo de la pantalla, el volumen u otras funciones específicas del dispositivo. En estos teclados, hay una Fn que puede mantener presionada para alternar lo que hace la tecla F. Consulte nuestra página Fn para obtener más información y ayuda con el uso de esta clave.

A continuación se muestra una descripción general de las funciones más comunes de las teclas F (F1 - F12) para Windows y macOS.

  • Se utiliza como tecla de ayuda en casi todos los programas. Cuando se presiona, se abre una pantalla de ayuda o se lo dirige a una página web.
  • Ingrese a la configuración del BIOS mientras la computadora se está iniciando. + F1 abriría el centro de ayuda y soporte técnico de Microsoft Windows.
  • En Excel, presione Alt + Mayús + F1 para crear una nueva pestaña en la hoja de trabajo.
  • Abra el Panel de tareas.
  • Al presionar Ctrl + F1 se ejecuta un corrector ortográfico en Corel WordPerfect.

Consulte nuestra página F1 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

  • En Microsoft Windows, cambia el nombre de un icono, archivo o carpeta resaltado en todas las versiones de Windows.
  • En Microsoft Excel, edita la celda activa.
  • Alt + Ctrl + F2 abre la ventana del documento abierto en Microsoft Word y le permite seleccionar un documento para abrirlo en Word.
  • Ctrl + F2 muestra la ventana de vista previa de impresión en Microsoft Word.
  • Ingrese a la configuración del BIOS mientras la computadora se está iniciando.

Consulte nuestra página F2 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

  • A menudo abre una función de búsqueda para muchos programas, incluido Microsoft Windows, cuando se encuentra en el escritorio de Windows en Windows 7 y versiones anteriores.
  • En algunos programas, después de realizar una búsqueda inicial, F3 encuentra el siguiente valor de búsqueda.
  • En la línea de comandos de MS-DOS o Windows, F3 repite el último comando ingresado.
  • En Microsoft Word, Ctrl + F3 pone en minúscula cualquier texto resaltado.
  • Shift + F3 cambia el texto en Microsoft Word de mayúsculas a minúsculas o una letra mayúscula al principio de cada palabra. + F3 abre la ventana Búsqueda avanzada en Microsoft Outlook.
  • En el Explorador de Windows, inicie la función de búsqueda.
  • Abra Mission Control en una computadora Apple que ejecute el sistema operativo macOS X.

Consulte nuestra página F3 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

  • Abra la ventana de búsqueda en Windows 95 a XP.
  • Abra la barra de direcciones en el Explorador de Windows e Internet Explorer.
  • Repita la última acción realizada (Word 2000+). cierra la ventana del programa actualmente activa en Microsoft Windows.
  • Ctrl + F4 cierra la ventana o pestaña abierta en la ventana activa en Microsoft Windows.
  • Mientras está en el cuadro de fórmula de Excel, al presionar F4 se cambia entre una referencia de celda absoluta y relativa.

Consulte nuestra página F4 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

  • En todos los navegadores de Internet modernos, presionar F5 actualiza o vuelve a cargar la página o la ventana del documento.
  • Ctrl + F5 fuerza una actualización completa de la página web, borrando el caché y descargando todo el contenido de la página nuevamente.
  • Actualiza la lista de contenidos en una carpeta.
  • Abra la ventana Buscar, reemplazar e ir a en Microsoft Word.
  • Al presionar F5 se inicia una presentación de diapositivas en PowerPoint desde la primera diapositiva. Al presionar Shift + F5 se inicia la presentación de diapositivas desde la diapositiva activa actualmente.
  • Al presionar F5 cuando la computadora está cargando MS-DOS por primera vez, se carga la configuración predeterminada.

Consulte nuestra página F5 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

  • Mueva el cursor a la barra de direcciones en Internet Explorer, Mozilla Firefox y la mayoría de los demás navegadores de Internet.
  • Ctrl + Shift + F6 se abre en otro documento de Microsoft Word abierto.

Consulte nuestra página F6 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

  • Se usa comúnmente para revisar la ortografía y la gramática de un documento en programas de Microsoft como Microsoft Word, Outlook, etc.
  • Shift + F7 ejecuta una verificación de Tesauro en la palabra resaltada.
  • Activa Caret Browsing en Google Chrome y Mozilla Firefox.
  • Abre el Capas panel en Adobe Photoshop.
  • Mientras está en la línea de comandos de Windows, presione F7 para ver un historial de todos los comandos ingresados ​​en esa ventana.

Consulte nuestra página F7 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

  • Tecla de función utilizada para ingresar al menú de inicio de Windows, comúnmente utilizada para acceder al Modo seguro de Windows.
  • Usado por algunas computadoras para acceder al sistema de recuperación de Windows, pero puede requerir un CD de instalación de Windows.
  • Muestra una imagen en miniatura para todos los espacios de trabajo en macOS.
  • Al presionar la tecla F8 se abre la ventana Reemplazar en TextPad.

Consulte nuestra página F8 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

    documento en Microsoft Word.
  • Envíe y reciba correo electrónico en Microsoft Outlook.
  • Abre el Mediciones barra de herramientas en Quark 5.0.
  • El uso de la tecla Fn y F9 al mismo tiempo abre Mission Control en una computadora Apple que ejecuta el sistema operativo macOS X.

Consulte nuestra página F9 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

  • En la mayoría de los programas de Microsoft Windows, de forma predeterminada, F10 activa la barra de menú o la cinta de opciones de una aplicación abierta.
  • Shift + F10 es lo mismo que hacer clic con el botón derecho en un icono, archivo o enlace de Internet resaltado.
  • Acceda a la partición de recuperación oculta en equipos Compaq, HP y Sony.
  • Ingrese a la configuración del BIOS mientras la computadora se está iniciando.
  • Con macOS 10.3 o posterior, muestra todas las ventanas abiertas para el programa activo.

Consulte nuestra página F10 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

  • Ingrese y salga del modo de pantalla completa en todos los navegadores de Internet modernos.
  • Ctrl + F11 cuando la computadora comienza a acceder a la partición de recuperación oculta en muchas computadoras Dell.
  • Al presionar F11 solo se accede a la partición de recuperación oculta en computadoras eMachines, Gateway y Lenovo.
  • Con macOS 10.4 o posterior, oculta todas las ventanas abiertas y muestra el escritorio.

Consulte nuestra página F11 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.

  • Abra la ventana Guardar como en Microsoft Word.
  • Ctrl + F12 abre un documento en Word.
  • Shift + F12 guarda el documento de Microsoft Word (como Ctrl + S).
  • Ctrl + Shift + F12 imprime un documento en Microsoft Word.
  • Abra Firebug, Chrome Developer Tools u otra herramienta de depuración de navegadores.
  • Con un Apple que ejecuta macOS 10.4 o posterior, F12 muestra u oculta el Tablero.
  • Obtenga una vista previa de una página en Microsoft Expression Web.
  • Acceda a la lista de dispositivos de arranque en una computadora al inicio, lo que le permite seleccionar un dispositivo diferente desde donde arrancar (por ejemplo, disco duro, unidad de CD o DVD, unidad de disquete, unidad USB y red).

Consulte nuestra página F12 para obtener más información sobre esta tecla y sus posibles funciones secundarias.


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