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¿Qué es este líquido rojo producido por una colonia de hongos?

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En un frasco, donde tenía unas plantas de orquídeas, hace unos días empezó a crecer un hongo. Quité las plantas y dejé que los hongos se expandieran y crecieran más. Después de algunos días, comenzaron a aparecer gotas rojas en la superficie del cuerpo del hongo (imágenes a continuación).

¿Alguien sabe lo que probablemente puede ser esto o reconoce los hongos? ¿Es un antibiótico o algo más?


Práctica de laboratorio de microbiología

La prueba de Kirby-Bauer se utiliza para determinar la potencia de los antibióticos sobre un patógeno midiendo el diámetro de la zona de inhibición alrededor del disco (zona clara) y comparándolo con una tabla estándar de antibióticos para determinar si el patógeno es resistente, sensible / susceptible o intermedio al antibiótico.

Los desinfectantes matan las formas vegetativas de bacterias, pero no las formas de endosporas. Tóxico para los humanos.

Inocular microorganismos en placas TSA con S. epidermidis (Gram +), B. cereus (endosporas), E. coli (Gram -) y P. aeruginosa (Gram -). Después de la incubación, mida el diámetro de la zona clara (zona de inhibición) y registre los resultados.

Las bacterias Gram (+) fueron más susceptibles a los antisépticos y desinfectantes.

1. La placa de infusión de cerebro y corazón se divide en 4 secciones:
a) solo ADN
b) Células Str S
c) Células Str R (control positivo)
d) Células Str S + ADN = Aquí se produce la transformación

2. Observe la placa BHI. Ningún crecimiento en la sección un crecimiento en todas las demás secciones. Obtenga una nueva placa de TSY inoculada con estreptomicina (antibiótico) y divídala en 3 secciones:
b) Células Str S
c) Células Str R (control positivo)
d) Células Str S + ADN = Aquí se produce la transformación

2. Staphylococcus auerus: racimos de cocos Gram (+). El color de la colonia es amarillo. Anaerobio facultativo. Fermentador de glucosa positivo. Prueba de coagulasa positiva.

3. Proprionibacterium acné: barras de Gram (+). El color de la colonia es muy pequeño, blanco / rosa. Anaerobio obligado. Fermentador de glucosa positivo. No se necesita prueba de coagulasa.

1) Colonias amarillas y agar amarillo es (+) fermentador
-S. aureus
2) Las colonias rosadas y el agar rojo son (-) fermentadores
-S. epidermidis

2) observe la placa de agar sangre para detectar hemólisis beta y alfa. Prepare la tinción de Gram de las colonias anteriores y busque diplococos o cadenas de cocos. Estos indican Streptococcus.

3) para cada colonia que parezca ser Streptococcus, realice las siguientes pruebas inoculando:
-Placa de agar sangre con discos antibióticos de bacitracina (Beta) y optoquina (Alfa / Gamma)
-Bilis esculina inclinada
-Tubo de sal NaCl

4) observe la placa de agar sangre con disco de antibiótico de bacitracina para Beta y disco de antibiótico de optoquina para Alpha / Gamma. Mida el diámetro de la zona de inhibición. Si supera los 14 mm, la bacteria es susceptible.


Artículo de revisión

  • 1 División de Agricultura Sostenible, Centro de Nanobiotecnología TERI-Deakin, Instituto de Energía y Recursos, Gurugram, India
  • 2 Facultad de Ciencias de la Vida y del Medio Ambiente, Deakin University, Geelong, VIC, Australia

La creciente preocupación por los efectos nocivos de los colorantes sintéticos tanto en el consumidor como en el medio ambiente ha despertado un gran interés en las alternativas de colorantes naturales. Como resultado, la demanda mundial de colorantes de origen natural está aumentando rápidamente en los sectores alimentario, cosmético y textil. Los colorantes naturales tienen la capacidad de usarse para una variedad de aplicaciones industriales, por ejemplo, como colorantes para sustratos textiles y no textiles como cuero, papel, pinturas y revestimientos, cosméticos y aditivos alimentarios. Actualmente, los pigmentos y colorantes producidos a través de plantas y microbios son la fuente principal explotada por las industrias modernas. Entre las otras fuentes no convencionales, se sabe que los hongos filamentosos, particularmente los hongos ascomicetos y basidiomicetos (hongos), y los líquenes (asociación simbiótica de un hongo con un alga verde o cianobacteria) producen una extraordinaria gama de colores que incluyen varias clases químicas de pigmentos tales como como melaninas, azafilonas, flavinas, fenazinas y quininas. Esta revisión busca enfatizar la oportunidad que brindan los pigmentos que se encuentran naturalmente en los hongos como una alternativa verde viable a las fuentes actuales. Esta revisión presenta una discusión exhaustiva sobre la capacidad de los recursos fúngicos como endófitos, halófitos y hongos obtenidos de una variedad o fuentes como suelo, sedimentos, manglares y ambientes marinos. Un impulsor clave del interés en los hongos como fuente de pigmentos proviene de factores ambientales y la discusión aquí se extenderá sobre el avance de técnicas de extracción más ecológicas utilizadas para la extracción de pigmentos intracelulares y extracelulares. La búsqueda de compuestos de interés requiere un enfoque multidisciplinario y técnicas como la metabolómica, la ingeniería metabólica y los enfoques biotecnológicos que tienen potencial para hacer frente a los diversos desafíos que enfrenta la industria de los pigmentos.


5 tipos principales de clonación (con diagrama)

Desde tiempos muy antiguos, se sabe que una variedad de microbios como bacterias y levaduras (hongos) son útiles en la fabricación de una gran cantidad de productos, por ejemplo, ácido láctico, etanol, vinagre, queso, etc., como también de utilidad industrial. sustancias como amilasa, proteasa y antibióticos que salvan vidas como penicilina y tetraciclina.

Las proteínas celulares también pueden ser producidas por microbios (bacterias y hongos). Se desarrollaron varias cepas mejoradas de estos microbios utilizando mutantes y otras técnicas convencionales.

Hoy en día, las técnicas de clonación de genes e ingeniería genética se utilizan generalmente para mejorar las cepas microbianas útiles para muchos propósitos:

(a) Producir compuestos útiles como enzimas y vitaminas a gran escala.

(b) Pueden diseñarse para producir varios productos farmacéuticamente útiles como insulina humana (por ejemplo, en Escherichia coli), interferón, hormona de crecimiento humana y vacunas virales.

(c) Varias cepas microbianas se utilizan en las diversas industrias para realizar muchas funciones importantes, como la eliminación de lignina no deseada (por ejemplo, Trametes).

(d) Los microbios (por ejemplo, bacterias que acumulan metales pesados ​​como Pseudomonas) se pueden usar para purificar el ambiente contaminado (llamado biorremediación).

(e) Ciertos microbios como Trichoderma (hongo) y Rhizobium (bacteria) se utilizan para el biocontrol (contra enfermedades y plagas de las plantas) y como biofertilizantes, respectivamente.

En el proceso de clonación de ADN, se introducen fragmentos de ADN eucariota en células bacterianas, que luego se cultivan en colonias individuales en una placa de cultivo.

A medida que una célula prolifera para formar una colonia, la única molécula de ADN absorbida por el fundador de la colonia es repetidamente replicada por las enzimas presentes en las células bacterianas, de modo que al final del período de crecimiento, el número de copias de la secuencia extraña se ha amplificado enormemente.

La clonación, por lo tanto, puede usarse como una técnica para producir grandes cantidades de una secuencia de ADN particular, pero lo que es más importante, puede usarse como una técnica para aislar, en una forma absolutamente pura, cualquier fragmento de ADN específico entre una población grande y heterogénea. de moléculas de ADN.

Tipo 2. Clonación de genes:

El objeto de la técnica de clonación es introducir una copia de un fragmento de ADN eucariota en una célula bacteriana receptora en condiciones en las que se replicará de forma autónoma a la del cromosoma huésped. Para lograr este objetivo, el ADN eucariota debe estar ligado al ADN de un vector que normalmente se replica en un entorno bacteriano.

El vector más común empleado en los procedimientos de clonación es el plásmido bacteriano. El uso de plásmidos es el siguiente: Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico no esenciales presentes en muchas bacterias.

Al igual que el cromosoma bacteriano principal, son círculos de doble hebra, pero son mucho más pequeños y de constitución genética variable. Dado que los plásmidos y los ADN cromosómicos tienen propiedades físicas muy diferentes, se pueden separar fácilmente entre sí.

El ADN extraño que se va a clonar se inserta en el plásmido para formar la molécula de ADN recombinante. Este plásmido modificado luego se agrega a un cultivo bacteriano como ADN desnudo y en presencia de CaCl2, un pequeño porcentaje de las bacterias recogerá una de estas moléculas del medio. Una vez que se absorbe un plásmido, se replicará de forma autónoma dentro del receptor y se transmitirá a su progenie durante la división celular.

Se ha aislado una amplia variedad de plásmidos, muchos de los cuales portan genes de resistencia a los antibióticos. Si estos plásmidos se agregan a un cultivo bacteriano y luego las células se tratan con antibióticos específicos, solo estas bacterias que han absorbido el plásmido podrán sobrevivir.

¿Cómo se combina el ADN del vector con el que forma el genoma eucariota? Las moléculas de ADN recombinante se pueden formar de varias formas.

Pueden construirse ADN recombinantes entre fragmentos de ADN que tienen extremos romos. Esto se puede hacer agregando enzimáticamente una cadena de nucleótidos que llevan A o C a una cadena del fragmento y una cadena complementaria de nucleótidos que llevan T o G a la cadena opuesta del vector, mezclando las dos poblaciones y sellando las moléculas con la ligasa.

Clonación de fragmentos genómicos:

Cuando se trabaja con ADN genómico, uno tiene que aislar un gen o genes en particular, como los que codifican las histonas, de entre los miles de secuencias no relacionadas. El primer paso en este tipo de experimento es fragmentar el ADN con endonucleasas de restricción.

Estas enzimas reconocen secuencias de 4 a 6 nucleótidos de longitud. Una vez que se fragmenta el ADN, los fragmentos se combinan con el ADN del vector y la población diversa de moléculas de ADN recombinante se somete al procedimiento de clonación de ADN. Dado que una célula bacteriana determinada toma solo un plásmido, todas las células de una colonia determinada contendrán copias de la misma molécula de ADN recombinante.

Escriba # 3. Clonación celular:

La célula bacteriana es a la vez la somática y la germinal. Habiendo seleccionado una sola bacteria, se pueden desarrollar grandes poblaciones de células, todas idénticas en morfología y bioquímica. En tiempos modernos, mediante técnicas de cultivo refinadas, la clonación de células se ha hecho posible y las poblaciones puras de células se han cultivado a partir de una única célula aislada.

Las unidades viables más pequeñas de la planta que se pueden imaginar en la actualidad que se reproducen, crecen y se desarrollan en cultivo son una sola célula. Varios investigadores establecieron un método que permitiría el crecimiento de órganos y tejidos vegetales aislados in vitro, en cultivo.

Prácticamente todas las plantas son totipotentes, pero en los animales solo los óvulos fertilizados y las células madre del blastocisto embrionario son totipotentes.

Escriba # 4. Clonación de plantas:

La totipotencia celular es la capacidad de las células maduras que muestra que cuando se liberan del cuerpo de la planta, tienen la capacidad de reorganizarse en los nuevos individuos. Steward y sus compañeros de trabajo mostraron este fenómeno en los cultivos de zanahoria. Aquí los pequeños trozos de raíz de zanahoria madura se cultivaron en un medio líquido complementado con leche de coco en recipientes especiales.

Estos cultivos se agitaron generalmente, lo que liberó todos los grupos de células en el medio. Algunos de ellos se convirtieron en grupos de raíces. Cuando estos se transfirieron a los tubos que contenían un medio semisólido, dieron lugar a una planta entera que floreció y formó semillas.

Escriba # 5. Clonación de organismos:

Es característico de la reproducción vegetativa que una parte vegetativa, cuando se retira de la planta y se coloca en condiciones adecuadas, reemplazará las partes faltantes y producirá un individuo completo. Ha sido posible cultivar varios tipos de órganos de plantas en cultivo estéril, incluidas raíces, ápices de brotes, hojas, partes florales y frutos.

Los requisitos de nutrientes para dicho cultivo de órganos varían considerablemente de una especie a otra y según el tipo de órgano en cuestión, pero se pueden reconocer ciertos requisitos generales.

Las plantas superiores intactas son autótrofas, es decir, son capaces de sintetizar todas las sustancias orgánicas necesarias para su propia vida a partir de agua, dióxido de carbono, oxígeno y nutrientes minerales. Pero dado que la mayoría de los cultivos estériles no pueden realizar la fotosíntesis, está claro que requerirán al menos una fuente de carbono, generalmente suministrada en forma de azúcar como sacarosa o glucosa.

Además, los cultivos estériles requieren los mismos nutrientes minerales que la planta intacta, incluidos macronutrientes (p. Ej., Nitrógeno, fósforo, potasio y calcio) y micronutrientes o oligoelementos (p. Ej., Mg, Fe, Mn, Zn, etc.).

Además de los requisitos de una fuente de carbono y nutrientes minerales, se encuentra que la mayoría de los órganos aislados también tienen un requisito de determinadas sustancias orgánicas especiales, como vitaminas, ácido nicotínico, etc.

Este tipo de reproducción se aplica ampliamente a plantas de importancia hortícola. Los horticultores suelen referirse a ella como propagación vegetativa. Su ventaja práctica es que un solo individuo puede dar lugar a una gran cantidad de plantas que serán uniformes porque todas tienen la misma constitución genética, o genotipo.

Este grupo de plantas derivadas de una sola por propagación vegetativa se denomina clon. Hoy en día, la clonación de organismos es una práctica común para el desarrollo de clones y # 8217 de plantas hortícolas y forestales.

Muchas orquídeas producen hermosas flores en plantas clonadas. Los científicos han modificado genéticamente plantas de cultivo de importancia agronómica. La producción rápida de tales plantas se puede lograr utilizando células meristemáticas en división activa, que se encuentran en los ápices de la raíz y el brote de la planta.

Para la agricultura, las enfermedades, la sequía, los cultivos resistentes a las plagas de insectos y los tolerantes a los herbicidas se han producido con éxito mediante la manipulación genética.

Los alimentos genéticamente modificados (GMF), como el arroz rico en vitamina A y las semillas de legumbres ricas en lisina, se están convirtiendo en componentes populares de los alimentos básicos para humanos.


Producción de celulasa alcalina por hongos aislados de una selva tropical intacta del Perú

Se aislaron hongos productores de celulasa alcalina de suelos de una selva tropical no perturbada de Perú. El método de la placa de dilución del suelo se utilizó para el recuento y aislamiento de hongos celulolíticos de crecimiento rápido en un medio selectivo enriquecido. Finalmente, se seleccionaron once de 50 colonias morfológicas diferentes utilizando el ensayo de aclaramiento de placa con CMC como sustrato a diferentes valores de pH. Las 11 cepas produjeron celulasas en cultivo líquido con actividades a valores de pH alcalino sin una aparente disminución de las mismas, lo que indica que son verdaderas productoras de celulasa alcalina. Aspergilo sp. LM-HP32, Penicillium sp. LM-HP33 y Penicillium sp. LM-HP37 fueron los mejores productores de celulasa FP (& gt3 U mL -1) con productividades específicas más altas (& gt30 U g -1 h -1). Se han encontrado tres cepas adecuadas para desarrollar procesos para la producción de celulasa alcalina. Los suelos de las selvas tropicales amazónicas son buenas fuentes de hongos industriales con características particulares. Los resultados del presente estudio son de interés comercial y biológico. Las celulasas alcalinas pueden usarse en el pulido y lavado del procesamiento de mezclilla de la industria textil.

1. Introducción

La biomasa vegetal es uno de los recursos renovables más abundantes para muchos propósitos, y se compone principalmente de tres tipos de polímeros: celulosa, hemicelulosa y lignina que están fuertemente entrelazados y unidos químicamente por fuerzas no covalentes y por enlaces cruzados covalentes. La estructura polimérica molecular rígida y compleja de la biomasa celulósica hace que la lignocelulosa sea altamente resistente al ataque químico, la solubilización y la bioconversión. Se requieren procedimientos de pretratamiento físico o químico que rompan las estructuras lignocelulósicas y, por lo tanto, mejoren la accesibilidad enzimática para la conversión de biomasa en varios bioproductos posibles [1, 2]. La hidrólisis enzimática de los materiales de celulosa implica acciones sinérgicas de las celulasas, así como de las xilanasas y otras enzimas [3, 4]. Las celulasas son enzimas relativamente costosas y una reducción significativa en el costo será importante para su uso comercial. La mayoría de las celulasas industriales son producidas por hongos en fermentación sumergida. Trichoderma reesei es la especie fúngica más importante utilizada para la producción de celulasa, aunque produce bajos niveles de β-glucosidasa [5]. Algunos Aspergilo Las especies también son importantes productoras de celulasa con niveles más altos de β-glucosidasa que T. reesei [6].

El uso de enzimas para procesar la fibra de algodón en sustitución de métodos químicos y físicos como el uso de álcalis y el lavado con piedras es relativamente reciente y ha demostrado ser más efectivo porque produce menos desgaste en la tela es más barato y tiene un menor impacto medioambiental [7]. En la limpieza enzimática se ha evaluado el uso de pectinasas, celulasas y proteasas y se ha encontrado un efecto sinérgico entre ellas. La mezcla de celulasas y pectinasas es la más eficaz [8]. La limpieza enzimática se realiza a pH neutro [7] y, aunque hay pectinasas que funcionan de forma óptima a este pH, la mayoría de las celulasas comerciales tienen una actividad óptima a pH ácido. Por lo tanto, el tratamiento secuencial se realizó ajustando el pH de la fibra en cada etapa [8]. Recientemente se han encontrado celulasas con una actividad óptima a pH neutro o alcalino, y estas se están incorporando gradualmente a los procesos de tratamiento de fibras, especialmente en el pulido y lavado del procesamiento de mezclilla porque el pH alcalino o neutro reduce la tinción posterior de los textiles [9-11]. Además, se observó que las celulasas neutras son fibras de algodón de desgaste menos agresivas y se prefieren frente a las celulasas ácidas [10]. Se han identificado y aislado celulasas neutras y alcalinas de bacterias [9, 12, 13] y hongos [10, 14], y la prospección de nuevos microorganismos es constante.

Como se indicó anteriormente, la demanda de nuevas enzimas para desarrollar procesos ambientalmente seguros en la industria textil aumentará debido a los requisitos reglamentarios adoptados en la mayoría de los países. La bioprospección de nuevos microorganismos productores de celulasa alcalina de entornos menos estudiados puede ayudar a este fin. El Perú es un país diverso y tiene una riqueza de diversidad microbiana muy amplia, pero poco estudiada y explotada. Por lo tanto, en este trabajo, los hongos del suelo amazónico de una selva tropical peruana intacta han sido aislados y probados para determinar su capacidad para producir celulasas alcalinas que pueden usarse en el pulido y lavado del procesamiento de mezclilla de la industria textil.

2. Materiales y métodos

2.1. Sitio de muestreo

Se recolectaron muestras de suelo en cinco puntos de muestreo del bosque de Macuya no perturbado, cerca de Pucallpa, Perú, ubicado en la latitud 8 ° 27′28.55′′S y la longitud 74 ° 53′44.33′′W. La temperatura promedio del suelo fue de 24,8 ° C y el pH de las muestras de suelo varió entre 6,5 y 7,0.

2.2. Muestras de terreno

En cada punto de muestreo de 1 m 2 se eliminó la hojarasca y se cortó aproximadamente 1 kg de tierra de los 20 cm superiores con una pala pequeña y un cuchillo y se dividió en cinco muestras de 200 g. Las muestras sin restos de plantas y piedras se colocaron en botellas de plástico y se enfriaron para su transporte. El suelo se homogeneizó manualmente mediante una mezcla completa. Luego, las muestras de suelo se congelaron a -20 ° C. Todas las herramientas y materiales utilizados se lavaron y esterilizaron [15].

2.3. Cribado primario

Se utilizaron diluciones en serie de las muestras de suelo experimental utilizando agua destilada estéril para el aislamiento de hongos en medio de cribado de agar. Este medio contenía, por litro, 1 g de carboximetilcelulosa (CMC), 0,5 g de xilosa, 1 g de peptona, 1 g de extracto de levadura, 0,5 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4

7H2O, 5 mg de FeSO4 7H2O, 1,6 mg MnSO4 2H2O, 1,4 mg de ZnSO4 7H2O, 2 mg de CoCl2 6H2O y 15 g de agar. El pH del medio se ajustó a 5,5 con una solución de NaOH 1 N o HCl 1 N. Después de esterilizar en autoclave, se añadió oxitetraciclina a una concentración final de 100 μg mL −1. Las placas inoculadas se incubaron a 28 ° C durante cinco días. Las colonias seleccionadas se aislaron y purificaron en placas de agar dextrosa de patata (PDA) y se conservaron en PDA inclinadas a 4ºC.

2.4. Cribado secundario

Se desarrolló un ensayo de limpieza de placa semicuantitativa basado en el método anterior de Teather y Wood [16]. Para ello, se dispensó el mismo medio de cribado de agar sin xilosa y oxitetraciclina en microplacas ELISA de fondo plano Labsystem estériles de 96 pocillos (LabSource, Arbor, IL, EE. UU.), Cada pocillo conteniendo 150 μMedio de cribado en agar L. Se sembraron pequeñas cantidades de esporas de hongos en la parte superior de cada pocillo y se incubaron a 28 ° C durante 72 h. Se utilizaron cuatro réplicas para cada aislado fúngico. El contenido de cada pocillo (después de comprobar el crecimiento del microorganismo) se eliminó asépticamente con un punzón y se colocó en placas de vidrio especialmente diseñadas (300 cm 2) que contenían el medio sólido del sustrato enzimático [17].

El medio sólido del sustrato enzimático contenía, por litro de tampón, 5 g de CMC y 15 g de agar. Para pH 4,8, 7,4, 8,4 y 9,4, se utilizaron 0,05 mol L-1 de citrato, solución salina tampón fosfato, barbital-HCl y tampón glicina-NaOH, respectivamente. La actividad enzimática se evaluó después de 4 h de incubación a 50 ° C en una cámara húmeda inundando las placas con una solución acuosa de 1 mg mL -1 de rojo Congo durante 15 min. A continuación, se vertió la solución de rojo Congo y las placas se trataron adicionalmente mediante inundación con 1 mol L-1 de NaCl durante 15 min. Se midió el diámetro de las zonas claras y se tomó como una indicación de la actividad celulasa.

2.5. Producción de celulasa en cultivo líquido

Las esporas de las cepas seleccionadas se lavaron de placas PDA de 5 días con 10 ml de solución de Tween 80 al 0,1% (v / v), y esta suspensión (1 x 106 esporas por ml) se utilizó como inóculo. El medio de producción de celulasa para el crecimiento y la producción de celulasa tenía la siguiente composición: KH2correos4 2 g L −1 (NH4)2ASI QUE4 1,4 g L -1 de urea 0,3 g L -1 de CaCl2 2H2O 0,3 g L −1 MgSO4 7H2O 0,3 g L-1 peptona 1 g L-1 Tween 80 0,2% (v / v) FeSO4 7H2O 5 mg L -1 MnSO4 2H2O 1.6 mg L −1 ZnSO4 7H2O 1.4 mg L −1 CoCl2 6H2O 2 mg L -1 y lactosa 10 g L -1 o celulosa microcristalina de 20 micrones 10 g L -1. El pH del medio se ajustó a 5,5 con una solución de NaOH 1 N o HCl 1 N. Cada matraz de 250 ml que contenía 70 ml de medio de producción se inoculó con un 3% (v / v) de la suspensión de esporas anterior. Todos los matraces inoculados se incubaron a 28 ° C en un baño de agitación a 175 rev / min -1 durante 72 h. Se tomaron tres réplicas en todos los casos. Los cultivos se centrifugaron a 3000 rev min-1 durante 20 min, se utilizaron sólidos para la determinación de la biomasa y los sobrenadantes se utilizaron para la actividad enzimática y las determinaciones de proteínas solubles.

2.6. Determinación de biomasa

Para los cultivos de lactosa, la biomasa se determinó midiendo el peso de las células secas. Para los cultivos de celulosa, la biomasa se determinó indirectamente midiendo la proteína intracelular contenida de la siguiente manera: los sólidos del cultivo se molieron en un mortero con nitrógeno líquido. La biomasa en polvo se suspendió suavemente en 5 ml de tampón de extracción (0,01 mol L -1 Tris HCL pH 8 0,001 mol L -1 EDTA, polivinilpolipirrolidona al 2% (p / v), se agitó en vórtex y se centrifugó a 8000 rpm durante 30 min a 4 ° C luego, se recogió el sobrenadante [18]. Los sobrenadantes se precipitaron con metanol-cloroformo siguiendo el procedimiento de Wessel y Fluegge [19]. Las muestras de proteínas se mezclaron sucesivamente con metanol (4 volúmenes), cloroformo (1 volumen) y agua destilada (3 volúmenes) y se centrifugó a 14.000 rev min -1 a 4 ° C durante 2 min. La fase superior se retiró cuidadosamente y se añadieron 3 volúmenes de metanol seguido de centrifugación a 14.000 rev min -1 durante 2 min. El sobrenadante se descartó El sedimento se secó al aire a temperatura ambiente y luego se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato. La concentración de proteínas se estimó mediante el procedimiento de Lowry et al. [20].

2.7. Actividad de celulasa

La celulasa, como actividad del papel de filtro (FPA), se determinó de acuerdo con 96 μMétodo basado en microplacas L (MPB) descrito por Xiao et al. [21] con algunas modificaciones. Anteriormente, se ensayó el método estándar FPA [22] para evaluar la sensibilidad y reproducibilidad del método MPB. Los análisis estadísticos mostraron que las actividades de celulasa determinadas con el método MPB no fueron significativamente diferentes de las actividades medidas con el estándar FPA (resultados no mostrados).

El ensayo de MPB se realizó de la siguiente manera: un 32 μSe añadió una alícuota de L de muestra de enzima de cultivo diluida a los pocillos de las placas UltraFlux PCR (LabSource, Arbor, IL, EE. UU.) Que contenían un disco de papel de filtro doblado de 7 mm de diámetro (Whatman N ° 1) y 64 μL de 0,05 mol L -1 de tampón correspondiente (pH 4,8, 7,4, 8,4 o 9,4). Después de la incubación a 50 ° C durante 60 min, 100 μSe añadió L de reactivo DNS en cada pocillo de la placa y se incubó a 95 ° C durante 5 min. Después del desarrollo del color, un 160 μL alícuota de cada muestra se transfirió a los pocillos de una microplaca ELISA de fondo plano Labsystem de 96 pocillos (LabSource, Arbor, IL, EE. UU.) Que contenía 85 μL de H destilado2Se midió O y la absorbancia a 540 nm en un lector de placas Rayto RT-2100C (Rayto Life and Analytical Sciences, Nanshan, Shenzhen, China). De acuerdo con las recomendaciones de la IUPAC [22], un blanco de enzima (32 μL alícuota de enzima diluida y 64 μTampón L) y el sustrato en blanco (96 μEn cada ensayo se incluyeron tampón L y disco de papel de filtro doblado de 7 mm). Una unidad de enzima (U) se define como la cantidad de enzima que libera 1 μmol de producto por minuto de equivalentes de glucosa.

2.8. Determinación de proteínas solubles

Los sobrenadantes del cultivo se precipitaron con dos volúmenes de ácido tricloroacético al 10% (p / v), se agitaron en vórtex, se mantuvieron durante la noche a 4ºC y se centrifugaron a 6.000 rev / min -1 a 4ºC durante 25 min. Los gránulos se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato y Lowry et al. [20] procedimiento.

2.9. Estadísticas

Los datos fueron analizados por Statgraphics Centurion XVI (Statpoint Technologies, Inc., Warrenton, VA, EE. UU.). En la mayoría de los casos se realizó un análisis de varianza (ANOVA) mediante el diseño estadístico categórico multifactorial. Otros análisis estadísticos se indican en el texto y también fueron procesados ​​con el mismo software.

3. Resultados

3.1. Aislamiento de hongos de muestras de suelo

Se utilizaron cinco muestras de suelo de Macuya, una selva tropical no perturbada (Pucallpa, Perú), para aislar hongos productores de celulasa alcalina mediante el uso de un medio de detección que contiene CMC y xilosa como fuentes de carbono y como inductores de celulasa. Todas las muestras de suelo muestran valores similares de propágulos de hongos capaces de utilizar las fuentes de carbono (4.5–7 × 10 4 UFC g −1 suelo seco Tabla 1). Basándose en las diferencias en la morfología de las colonias, se aislaron 50 colonias, se purificaron y se sometieron a un cribado secundario para detectar la actividad de celulasa a diferentes valores de pH. Posiblemente debido al diseño de medio de aislamiento y tiempo de incubación corto, predominio de los géneros Aspergilo y Penicillium entre los 50 aislados de hongos se encontró.

3.2. Detección de la actividad de la celulasa

La actividad celulolítica de los 50 aislados de hongos se ensayó semicuantitativamente usando el ensayo de aclarado de placa con CMC como sustrato a diferentes valores de pH (ver Sección 2). Muchos aislados de hongos mostraron actividad celulolítica incluso a pH 9,4. Sin embargo, solo aquellos aislados que dieron zonas claras con diámetros superiores a 1 mm en todos los valores de pH alcalino se seleccionaron para análisis adicionales. Por lo tanto, 11 cepas pertenecientes a Aspergilli y Penicilli pasaron la pantalla y fueron seleccionadas para la producción de celulasa en cultivo líquido (Tabla 2). Son Aspergilo sp. LM-HP32, Aspergilo sp. LM-HP34, Penicillium sp. LM-HP37 y Penicillium sp. LM-HP14 dio las zonas de limpieza más altas en todos los valores de pH.


OBJETIVOS DE DESEMPEÑO PARA LAB 3

Después de completar esta práctica de laboratorio, el estudiante podrá completar los siguientes objetivos:

1. Dada una mezcla de una bacteria Gram-positiva y una Gram-negativa y placas de agar Columbia CNA, MacConkey y Trypticase Soy, describa los pasos que tomaría para obtener finalmente cultivos puros de cada organismo.

2. Definir: medio selectivo, medio diferencial, medio de enriquecimiento y combinación medio selectivo-diferencial.

3. Indique la utilidad del agar Columbia CNA y el agar MacConkey.

4. Describa cómo aparecería cada uno de los siguientes elementos cuando se cultiva en agar MacConkey:

1. Utilizando el método de aislamiento de placas de rayas, obtenga colonias aisladas a partir de una mezcla de microorganismos.

2. Recoger las colonias aisladas de microorganismos que crecen en una placa y transferirlas asépticamente a un medio estéril para obtener cultivos puros.

1. Cuando se le dé una placa de agar Columbia CNA o agar MacConkey que muestre colonias discretas, interprete correctamente los resultados.


Agradecemos el apoyo experimental de Hiroko Kato y Takamitsu Soma en la Universidad de Tsukuba. Este trabajo cuenta con el apoyo de las subvenciones KAKENHI 18K05545 y 18K15143 de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS), una subvención del Instituto de Fermentación de Osaka (IFO), la Subvención del Instituto Noda para la Investigación Científica y la Agencia de Ciencia y Tecnología de Japón (JST) Número de concesión ERATO JPMJER1502.

Contribuciones de los autores

G Abeysinghe: análisis formal, validación, investigación y visualización.

M Kuchira: análisis formal, validación, investigación y visualización.

G Kudo: análisis formal, validación, investigación y visualización.

S Masuo: análisis formal, validación, investigación y metodología.

A Ninomiya: investigación y metodología.

K Takahashi: software y análisis formal.

AS Utada: curación de datos, software y análisis formal.

D Hagiwara: conservación de datos y análisis formal.

N Nomura: conceptualización, recursos, adquisición de fondos y administración de proyectos.

N Takaya: conceptualización, recursos, administración de proyectos y redacción: revisión y edición.

N Obana: conceptualización, recursos, conservación de datos, análisis formal, adquisición de fondos, validación, investigación, visualización, metodología, administración de proyectos y redacción: borrador original, revisión y edición.

N Takeshita: conceptualización, recursos, conservación de datos, análisis formal, supervisión, adquisición de fondos, validación, investigación, visualización, metodología, administración del proyecto y redacción: borrador original, revisión y edición.


¿Qué es este líquido rojo producido por una colonia de hongos? - biología

Producida por Jim Deacon
Instituto de Biología Celular y Molecular, Universidad de Edimburgo


Los líquenes se han descrito como `` organismos duales '' porque son asociaciones simbióticas entre dos (o a veces más) tipos de microorganismos completamente diferentes:

  • un hongo (llamado el mycobiont)
  • un alga verde o una cianobacteria (denominada photobiont).

Hay muchos ejemplos de simbiosis en la naturaleza, pero los líquenes son únicos porque se ven y se comportan de manera bastante diferente a los organismos que los componen. Por lo tanto, los líquenes se consideran organismos por derecho propio y se les dan nombres genéricos y de especie. Sin embargo, para fines taxonómicos, los nombres son en realidad nombres de hongos: los líquenes se consideran un grupo especial de hongos: el hongos liquenizados.

Se estima que hay entre 13.500 y 17.000 especies de líquenes, que se extienden desde los trópicos hasta las regiones polares. Algunos de ellos crecen en la corteza de los árboles templados o como epífitas en las hojas de los árboles en las selvas tropicales. Otros ocupan algunos de los ambientes más inhóspitos de la tierra, crecen en flujos de lava enfriados y superficies de rocas desnudas, donde ayudan en el proceso de formación del suelo, y en arenas del desierto donde ayudan a estabilizar la superficie y enriquecerla con nutrientes (ver Cianobacterias ). Some other types of lichen grow abundantly on tundra soils, providing a vital winter food source for animals (including reindeer and caribou) in arctic and sub-arctic regions.Yet other lichens grow on or in the perennial leaves of some economically important tropical crop plants such as coffee, cacao and rubber, where they are regarded as parasites.

All these features make lichens interesting and significant in environmental terms. But lichens also pose challenging scientific problems - how do two or more microorganisms interact at the cellular, genetical and biochemical levels to produce a unique, hybrid organism?

The "body" of a lichen is termed the talo, and its general shape enables us to group lichens into four broad categories.

  • Foliose lichens have a flat, leaf-like structure (Figures A-B below).
  • Fruticose lichens have an erect or pendulous, bushy structure (Figure C, below).
  • Squamulose lichens have a thallus consisting of minute, scale-like squamules (Figures D-E below)
  • Crustose lichens produce a flat crust on or beneath rock or tree surfaces (Figures F-G, below).

Foliose lichens. (A) Parmelia physodes, growing on the twigs of a shrub. The lobes, about 1 cm diameter, are silvery-grey above, black below. (B) Peltigera polydactyla, growing on soil. The lobes are semi-erect, 1-2 cm diameter, and have brown fungal fruiting bodies (ascocarps) at their tips (see later). In this case the lichen thallus is grey because it has dried, but it rapidly becomes bluish-green when rewetted.

Fruticose and squamulose lichens. (C) Usnea comosa, growing on a wooden post. This lichen has a branched, filamentous thallus which hangs down from the point of attachment. (D) Cladonia pyxidata, growing on peaty soil. This lichen has a scale-like squamulose structure (arrowhead) but also produces erect stalked cups termed podetia. (MI) Cladonia coccifera, similar to C. pyxidata but the rims of the podetia bear many conspicuous red ascocarps.

Crustose lichens. (F) A patchwork of lichens on a rock surface, including several colonies of the green-coloured Rhizocarpon geografica and the white Lecidia especies. (GRAMO) Lecanora muralis (también conocido como Squamaria muralis) growing on a wall. The thallus has a pale green colour with small lobes at the margin but the centre is crustaceous. Also present are many pale brown ascocarps.

A few lichen fungi (approximately 20) are members of the fungal group Basidiomycota, but the vast majority are members of the Ascomycota (ascus-forming fungi) and they often produce conspicuous fungal fruiting bodies (ascocarps) - usually disk-shaped structures termed apothecia (e.g. Figures E, G). Almost half of the recorded fungi in the world are ascomycota, and nearly half of these are found only in lichens. Although their spores are dispersed from the fruiting bodies, these fungi do not seem to have an independent role in nature because they are extremely slow-growing and generally lack the enzyme systems for degrading complex polymers.

In contrast to the many thousands of lichen fungi, there are only about 100 photosynthetic partners. The most common are single-celled green algae of the genus Trebouxia (Figure H), which are found in many lichens of temperate and arctic/alpine regions, including all species of the common lichen genus Cladonia (see Figures D, E). Trebouxia species seldom grow as free-living cells in nature instead they seem to be specialised lichen symbionts. Another common photobiont is the filamentous green algal genus Trentepohlia, especially in Mediterranean and tropical regions. This and other algal genera of the tropical lichens can be found growing independently in nature. About 10% of lichens have cyanobacteria (e.g. Nostoc) as the main or only photosynthetic partner. For example, this is true of many Peltigera species (Figure B). However, some lichens that contain green algae can also have cyanobacteria in special wart-like structures on the lichen surface. These structures are termed cephalodia. They are found in about 3-4% of lichen species and their role is probably to exploit the nitrogen-fixing ability of cyanobacteria.

The fact that lichens can be formed by more than one type of fungus and more than one type of photosynthetic partner shows us that the lichen symbiosis must have evolved independently on several occasions.

Lichens vary in their degree of structural organisation. At one extreme are some simple, almost casual associations between fungal hyphae and photosynthetic cells, in which there is little structural modification. These simple associations may be quite common but are inconspicuous. The more conspicuous lichens have a well-defined structure, often with distinct zonation of the partners, as shown in Figures I-K, below. Usually, the photosynthetic cells are found in a defined band where they are closely associated with fungal hyphae, for nutrient exchange. Above this band is a corteza consisting of tightly packed fungal cells with a gelatinous matrix between them. Within and below the photosynthetic zone is a médula of loosely packed hyphae. Often there is a thinner, lower cortex, and several types of lichen attach themselves to a surface by root-like structures termed rhizinae or rhizines (see Fig. K ).

Figure I. Structure of the lichen Peltigera polydactyla. In cross section (left) the lichen thallus is seen to consist of an upper corteza (c) of tightly packed fungal cells resembling a tissue. This is seen at higher magnification in the centre image. Beneath the cortex is a médula (m) of more typical fungal hyphae (seen at higher magnification in the right-hand image). The photosynthetic cells (a cyanobacterium in this case) are seen as a green-coloured band beneath the cortex. The lichen also has a lower cortex, beneath the medulla, but it is not seen in this section.

Note the air pockets in the upper part of the medulla, close to the photosynthetic zone (grey-black regions in the left-hand image). They indicate that the fungal hyphae in this region are hydrophobic. Note also the extremely thick walls of hyphae in the medulla (the right-hand image). These thick-walled, hydrophobic hyphae contribute to drought-tolerance.

Figures J, K. Structure of the common foliose lichen Xanthoria parietina, which grows on many types of surface, including concrete, roofs of buildings, and rocks subjected to sea spray. The lichen thallus (J) has foliose lobes at the margin (see top of Figure J) but much of the surface is covered with bright orange apothecia about 3-5 mm diameter (arrowheads). The orange colour of this lichen is due to production of the pigment parietin at the lichen surface.

(K) Cross section of one of the marginal lobes, viewed by phase-contrast microscopy. The photosynthetic zone (pag) is seen as a distinct band of green algal cells. Above this band is the cortex (C) consisting of densely packed fungal cells . The surface of the cortex is pigmented because the cell walls are impregnated with parietin. The lower part of the thallus consists of a medulla (metro) with conspicuous air pockets (a), and a thin lower cortex (lc). Like many foliose lichens, Xanthoria produces rhizinae (r) that penetrate into crevices and help to anchor the lichen to a surface. The pigmentation near the tip of the rhizina is due to production of a purple-red pigment by the hyphal cells in this region.

The mycobiont has two principal roles in the lichen symbiosis:

    to protect the photobiont from exposure to intense sunlight and desiccation

to absorb mineral nutrients from the underlying surface or from minute traces of atmospheric contaminants.

The photobiont also has two roles:

    to synthesise organic nutrients from carbon dioxide

in the case of cyanobacteria, to produce ammonium (and then organic nitrogen compounds) from N2 gas, by fijación de nitrogeno. In some ecosystems such as desert soils, tundra heaths, and Douglas-fir forests of the Pacific Northwest of the USA, lichens can provide the major input of nitrogen which supports other forms of life (see Further reading ).

Thus, through the lichen partnership, the photobionts are protected and able to grow in conditions in which they could not grow alone they also benefit from the highly efficient uptake of mineral nutrients by the lichen fungi. The fungi, in turn, obtain sugars and in some cases organic nitrogen from the photosynthetic partner, enabling them to grow in environments deficient in organic nutrients.

Lichens are remarkable for their ability to withstand prolonged drying and to resume activity rapidly after rewetting. Most lichens that contain green algae can recover from drought by absorbing water from humid air and then begin to photosynthesise. However, the lichens that contain cyanobacteria can only resume photosynthesis after absorbing free (liquid) water.

The drought-tolerance of lichens is likely to be conferred by a water-repellent (hydrophobic) coating on the hyphal walls of the medulla. Small peptides that are rich in sulphur-containing amino acids have been found on the hyphal walls of many free-living fungi. They are termed hydrophobins and they probably also occur in lichen fungi. The presence of these compounds would ensure that the medulla around the photosynthetic cells does not become waterlogged, allowing the diffusion of gaseous carbon dioxide for photosynthesis. Of interest, the hydrophobic materials seem to be produced only by the fungus, because cells of Trebouxia, which have a naturally hyrophilic surface, become covered with a hydrophobic material when grown in the presence of a lichen fungus.

The rewetting of lichens is thought to start by water absorption in the gelatinous matrix of the cortex, after which water might move through the medulla in the wall space of the fungal hyphae or perhaps by capillarity in regions where the hyphae have a hydrophilic surface.

Most attention to nutrient exchange in lichens has centred on the mechanisms of carbon flow from the photosynthetic partner to the fungus, because radioactive labelling studies have shown that both green algae and cyanobacteria can release up to 90% of their photosynthate to the fungal partner.

In lichens with Trebouxia, and presumably also with other green algae, the fungal hyphae can produce short branches that penetrate through the algal wall to serve as nutrient-absorbing haustoria. This is similar to the behaviour of biotrophic plant pathogens (see Biotrophic Plant Pathogens ). In contrast, in lichens with cyanobacteria (e.g. Peltigera) there is no penetration of the photosynthetic cells. Instead, the fungal hyphae of the central region (usually hydrophobic) produce thin-walled protrusions that penetrate the hydrophilic gelatinous sheaths that surround the cyanobacterial cells.

The major soluble carbohydrates in lichens are sugar alcohols (polyols). In the fungal partner these compounds are present as manitol and, to a lesser degree, arabitol. In these respects lichen fungi are no different from other fungi, which characteristically have sugar alcohols as the main soluble carbohydrates. The green algae produce sugar alcohols as their main photosynthetic products - e.g. the sugar alcohol ribitol es producido por Trebouxia. However, the cyanobacteria seem to release glucose to the fungal partner. This seems to occur passively through a glucose carrier in the cell membrane, after enzymic degradation of an intracellular glucan (glucose polymer) in the cyanobacteria.

Of interest, the maximum rates of nutrient release from the photosynthetic partner occur in optimal moisture conditions, whereas the photosynthetic cells retain most of their carbohydrate in conditions of water stress. So, it has been suggested that cycles of wetting and drying may be advantageous in maintaining a lichen symbiosis, because both partners could gain sufficient carbohydrate at different stages of this cycle.

Figures L, M. The fungal sporing stage of Xanthoria parietina. (L) Section through part of a thallus in the region of a disk-shaped apothecium. The apothecium consists of many club-shaped asci (one ascus is marked by an arrowhead) with sterile "packing" hyphae (paraphyses) between the asci. The tips of the paraphyses are orange-pigmented (top of the section). (METRO) Part of the apothecium crushed to show the asci (one marked by an arrowhead), each containing 8 oval ascosporas, and the orange-tipped paraphyses.

Figures N-P. The fungal sporing stage of Peltigera polydactyla. ( norte ) Apothecia are seen as brown, shield-like structures at the tips of the thallus (this Figure is a close-up of Figure B). ( O ) Part of a crushed apothecium showing asci (one marked by arrowhead) and brown-tipped paraphyses. ( PAG ) Ascospores released by crushing an apothecium. In this lichen the ascospores are needle-shaped, unlike the oval ascospores of Xanthoria.

Most lichens are dispersed by vegetative propagation. The dry lichen thallus is brittle, so fragments can be broken off easily and transported by wind or by animals. In addition, several lichens produce stalk-like or pillar-shaped structures termed isidia, which are easily broken off and dispersed. All these fragments can resume growth in a new environment after they are rewetted.

A further means of propagation is by the production of specialised dispersal units termed soredia (Figures Q, R). These consist of a few photosynthetic cells enveloped in fungal hyphae, and they are formed as a powdery mass near the centre of a lichen thallus or (e.g. Parmelia physodes, Figure A) at the tips of some of the thallus lobes. Soredia are readily dispersed by wind.

In addition to these dispersal methods, many lichens produce apothecia or other fungal fruiting structures, to disperse the spores of the fungal partner (Figures L-PAG). The spores in these cases (ascosporas) are formed in asci as the result of sexual reproduction (see The Fungal Web ), although a few lichen fungi produce asexual dispersal spores. When these spores germinate they must contact the cells of a photosynthetic partner to establish a new lichen thallus. This process of "reassembly" of a lichen can be demonstrated in experimental conditions, and evidence suggests that it also occurs in nature. But its frequency in natural conditions may vary substantially between different types of lichen. For example, the separate dispersal of fungal and algal (Trebouxia) spores might be the major means of dispersal for the common lichen Xanthoria parietina (see Figure J) and for Buellia species because these lichens do not seem to have soredia. In these cases there is immunological evidence to suggest that lichens are synthesised in nature from free-living Trebouxia and fungal spores on rock surfaces (Mukhtar et al., 1994).

Figure Q. Physcia grisea, a common lichen that grows on walls, trees and fence posts in city environments. The colony margins consist of narrow lobes (about 2-3 mm) but the centre of each thallus has a darker, greener appearance and is more granular, because it is covered with soredia.

Figure R. Seven soredia seen at high magnification. Each is about 0.1 mm diameter and consists of a cluster of algal cells in a meshwork of hyphae.

Lichens are amongst the slowest-growing organisms, but their tolerance of environmental extremes enables them to colonise habitats where few other macroscopic organisms can grow. They grow where neither the fungal partner nor the photosynthetic partner could survive alone, because they benefit from their unique symbiotic association.

However, most lichens are highly intolerant of atmospheric pollution, particularly sulphur dioxide, so they are found mainly in rural environments rather than cities. Only a few species, such as Physcia grisea y Xanthoria parietina, are found commonly in towns, and even they grow poorly in towns compared with in non-polluted environments. Part of the reason for this intolerance is the extreme efficiency of lichen fungi in accumulating nutrients from trace levels in the atmosphere. An extreme demonstration of this is the ability of lichens to accumulate radioactive isotopes from the environment. Following the Chernobyl disaster, the lichens (mainly Cladonia rangiferina, the "reindeer moss") of northern Scandinavia accumulated so much radioactivity that reindeer feeding on them were considered dangerous for human consumption.

(1) Books, journals and major reference sources

Hale ME (1983) The Biology of Lichens. Edward Arnold, London [The best general book on lichen biology]

Nash TH (1996) Lichen Biology. Prensa de la Universidad de Cambridge, Cambridge. [An update of Hale's book, with chapters by different authors, but highly detailed - not recommended for beginners]

The main journal for all aspects of lichens is The Lichenologist, published by Academic Press.

Many detailed aspects of lichen biology can be found in the three volumes of CRC Handbook of Lichenology (ed. M. Galun), 1988. CRC Press, Boca Raton, Fl, USA.

Access many lichen sites through the home page of the International Association of Lichenologists ( not on this server )

Ver también: Lichen photos ( not on this server )

And a "lighter" but useful site: Fun with Lichens ( not on this server )

(3) Selected references for specific topics:

Synthesis of lichens in laboratory conditions, and in nature:

Stocker-W rg tter E & Turk R (1991) Artificial resynthesis of thalli of the cyanobacterial lichen Peltigera praetextata under laboratory conditions. Lichenologist 23, 127-138.

Mukhtar A, Garty J & Galun M (1994) Does the lichen alga Trebouxia occur free-living in nature: further immunological evidence. Simbiosis 17, 247-253.

Movement of radionuclides from lichens through the animal food chain:

Thomas PA, Sheard JW & Swanson S (1994). Health Physics 66, 666-677.

Contribution of lichens to nitrogen-enrichment of various ecosystems:

Pike LH (1978) Briólogo 81, 247-257.
Crittenden PD & Kershaw KL (1978) Briólogo 81, 258-267.
Eldridge DJ & Greene RSB (1994) Australian Journal of Soil Research 32, 389-415.
Nadkarni NM (1994) Zoólogo americano 34, 70-78.

Smith DC & Douglas AE (1987) The Biology of Symbiosis. Edward Arnold, London.

Richardson DHS (1993). The physiology of drying and rewetting in lichens. pp. 275-296 in Stress Tolerance of Fungi (Ed. DH Jennings) Academic Press, London.

Lichen interactions and community development:

Lawrey JD (1991) Biotic interactions in lichen community development a review. Lichenologist 23, 205-214.


Resultados

Isolation and chemical characterization of SRF secondary metabolites

The filtered culture broth of SRF (3 l) was extracted with EtOAc to afford 95 mg of crude extract that was separated by flash chromatography. Six fractions were collected, and among these, fraction 2 (10·5 mg), fraction 3 (9·3 mg) and fraction 4 (6·6 mg) contained the bulk of material recovered. Methanolic extracts of the mycelium and the other collected fractions showed no biological activity and were mainly constituted by fatty acids (GC-MS data not shown).

One of the less polar fractions (fraction 2) gave 10·5 mg of a metabolite that was identified as veratryl alcohol (VA –Fig. 1a). The structure of VA was deduced from 1 H NMR and 13 C NMR/ Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (DEPT) spectral data. The MS analysis indicated a molecular ion [M] + at m / z 168, corresponding to the molecular formula C9H12O3. The isolated compound showed the same spectroscopic properties to those reported for VA ( Lundquist and Kirk 1978 ): 1 H NMR 400 MHz, CDCl3: 3·88 (3 H, s, OCH3), 3·89 (3 H, s, OCH3), 4·62 (2 H, s, CH2), 6·84 (1 H, d, J = 8 Hz orto coupling), 6·90 (1 H, dd, J = 1·6 Hz, meta coupling, and 8 Hz, orto coupling), 6·93 (1 H, d, J = 1·6 Hz, meta coupling).

Chemical structures of secondary metabolites isolated from the sterile red fungus. (a) veratryl alcohol (VA) (b) 4-hydroxymethyl-quinoline.

Fractions 3 and 4 were further purified by preparative TLC to afford 4-hydroxymethyl-quinoline (1·5 mg) (OQ –Fig. 1b). The mass spectrum from GC-MS analysis showed a [M] + peak at m / z 157 and a high level of similarity with that of 4-quinolinecarbaldehyde. These data were not in agreement with those obtained by NMR analysis, particularly for the presence of a singlet of two protons at δ 5·18 and a –CH2– (DEPT) at δ 61·55 that can be assigned to a hydroxymethyl group. A one-proton doublet at δ 7·55 (J = 4·5 Hz) showed coupling to another at δ 8·91, indicative of a 4-hydroxymethylquinoline. To resolve this incongruence, a sample of the metabolite was treated with the silylating agent BSTFA. The mass spectrum of the trimethylsilyl derivative indicated that the original compound had the molecular formula C10H9NO. The peak at m / z 157 arose from the corresponding 4-quinolinecarbaldehyde, an artefact of the GC-MS analysis.

Antifungal and plant growth promotion activity of SRF secondary metabolites

The evaluation of antifungal activity of VA revealed weak inhibition against R. solani (about 10% at 1 μg: Fig. 2), while up to 45 and 35% inhibitions were registered using 1 μg of the metabolite against P. irregulare y S. sclerotiorum, respectivamente. However, the increase in the metabolite concentration did not affect significantly the levels of inhibition (Fig. 2).

Antibiotic activity of veratryl alcohol against (◆) Sclerotinia sclerotiorum, () Pythium irregulare and (▪) Rhizoctonia solani. Concentrations ranging from 0·1 to 100 μg per plug. Bars indicate standard deviation.

OQ inhibited the growth of P. irregulare (50%), S. sclerotiorum (35%) and R. solani (20%) at 100 μg (Fig. 3). Lower concentrations significantly reduce OQ activity against all the tested pathogens (Fig. 3).

Antibiotic activity of hydroxymethyl-quinoline against (◆) Sclerotinia sclerotiorum, () Pythium irregulare and (▪) Rhizoctonia solani. Concentrations ranging from 0·1 to 100 μg per plug. Bars indicate standard deviation.

The effects of VA and OQ on plant growth promotion were evaluated by measuring the length of the canola seedlings whose seeds were previously coated with different amounts of the SRF metabolites. The growth of canola seedlings was affected by treatments with VA and OQ. The length of canola seedlings increased when seeds were treated with 0·01 ng of VA (Table 1) or with 0·1–1 μg of OQ (Table 2). On the other hand, VA and OQ did not significantly promote root growth in comparison to control (Tables 1 and 2). Interestingly, a reduction in root length by about 30% was observed when seeds were coated with 1 μg VA (Table 1).

Stem length (cm) Dakota del Sur Root length (cm) Dakota del Sur
Control 1·171a 0·045 6·425a 1·639
1 μg 1·114a 0·136 4·600b 0·545
0·1 μg 1·200a 0·187 6·100a 0·954
0·01 μg 1·100a 0·087 6·689a 1·679
1 ng 1·267a 0·141 7·975a 1·444
0·1 ng 1·240a 0·136 7·629a 1·163
0·01 ng 1·675b 0·259 7·500a 2·080
  • Values are means of ten replicates. Values with the same letter do not differ significantly (PAG < 0·05).
  • SD, ± standard deviation.
Stem length (cm) Dakota del Sur Root length (cm) Dakota del Sur
Control 1·200a 0·156 6·425a 1·639
1 μg 1·620b 0·160 7·657a 2·265
0·1 μg 1·738b 0·264 6·500a 1·133
0·01 μg 1·289a 0·137 6·575a 0·807
1 ng 1·210a 0·170 6·600a 1·439
0·1 ng 1·257a 0·238 7·486a 1·333
0·01 ng 1·250a 0·087 7·800a 0·998
  • Values are means of ten replicates. Values with the same letter do not differ significantly (PAG < 0·05).
  • SD, ± standard deviation.

Automation When Working with Bacterial Colonies

Like many laboratory research aspects, the growing and picking of bacterial colonies can be automated with robotics and automation software.

In fact, labs can use automation throughout the workflow, from preparing the bacterial samples for plating to isolating the molecules or proteins of choice from the picked colonies.

A colony picking robot can accurately select the required bacterial colony by using advanced imaging hardware and algorithms. It can determine how many cells are in a colony, on the average from colony size, automatically identify the desired colonies according to customizable parameters such as radius, color, or separation and pick the colonies that fit the preset parameters. It can also automatically record and store information on the selected colonies ensuring you have complete documentation.

Working with bacterial colonies is an essential part of any biological lab as they are often the main component used in research and within the production of proteins and enzymes. Therefore, accurately identifying colony morphology and picking the right colony can significantly improve your lab results.