Información

8.3: Preparación de muestras - Biología

8.3: Preparación de muestras - Biología


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Prepare sus muestras para la electroforesis mientras el gel se cura agregando tampón de carga concentrado. El tampón de carga también contiene glicerol, lo que hace que la muestra sea lo suficientemente densa como para hundirse hasta el fondo del pozo de muestra.

Agregue 4 μL de tampón de carga 6X directamente a cada una de las reacciones de PCR de 20 μL del último laboratorio. Brevemente, centrifugue cada tubo para mezclar el tinte y las muestras, si es necesario. Utilizará la mitad de cada muestra en sus geles. Guarde la muestra restante en el refrigerador.


8.3: Preparación de muestras - Biología

Principio de PAGE nativo:

Native PAGE usa los mismos frentes discontinuos de iones de cloruro y glicina que SDS-PAGE para formar límites móviles que se apilan y luego separan los polipéptidos por la relación de carga a masa. Las proteínas se preparan en un tampón de muestra no reductor no desnaturalizante, que mantiene la estructura secundaria de las proteínas y la densidad de carga nativa. Por lo tanto, puede ver fácilmente varias bandas de la foto de cámara de su gel PAGE nativo si su proteína objetivo tiene formas polimerizadas en su muestra. En la electroforesis de PAGE nativa, la mayoría de las proteínas tienen un pl (punto isoeléctrico) ácido o ligeramente básico (

3-8) y migran hacia el polar negativo. Si el pl de su proteína es mayor que 8,9, por ejemplo, probablemente debería invertir el ánodo y ejecutar el gel PAGE nativo.

Obtenga más información sobre Native-PAGE:

  • Para el sistema de electroforesis, se recomienda un sistema bio-rad.
  • Para un gel de apilamiento PAGE nativo de 5 ml

*: Agregado justo antes de cada uso.

Para un gel separador PAGE nativo de 10 ml:

Porcentaje de acilamida 6% 8% 10% 12% 15%
Acrilamida / Bis-acrilamida (30% / 0,8% p / v) 2ml 2,6 ml 3,4 ml 4ml 5ml
Tris-HCl 0,375 M (pH = 8,8) 7,89 ml 7,29 ml 6,49 ml 5,89 ml 4,89 ml
* 10% (p / v) de persulfato de amonio (AP) 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl
* TEMED 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl

*: Agregado justo antes de cada uso.

Tampón de muestra (2x):

Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8
25% de glicerol Glicerol
1% de azul de bromofenol

Tris de 25 mM
Glicina 192 mM

Nota: el búfer de ejecución debe ser

pH 8,3. No ajuste el pH.

Protocolo de ejecución de gel:

1. Prepare la cantidad adecuada de gel separador en un vaso de precipitados pequeño, luego agregue un volumen específico. de AP y TEMED y agite suavemente la batidora para asegurar una mezcla suficiente. Pipetee la solución de gel en el espacio entre las placas de vidrio del molde de gel (no llene completamente). Llene el espacio de descanso con agua (isopropanol alternativamente). Deje pasar 20-30 minutos para una gelificación completa.

2. Puede preparar la solución de gel de apilamiento mientras se gelifica el gel de separación. Prepare la cantidad adecuada de gel de apilamiento en una batidora y mezcle con AP al 10% y TEMED al 1%. Vierta el agua en el primer paso y pipetee la solución de gel de apilamiento en el espacio e inserte el peine. Deje que se solidifique durante 20-30 minutos.

3. Mezcle su muestra con tampón de muestra. ¡No caliente su muestra!

4. Cargue la mezcla de muestra y establezca un voltaje apropiado para ejecutar la electroforesis.

Nota: Es mejor poner el sistema en hielo y no establecer un Volt relativamente alto en caso de que las proteínas se degraden.

5. Tiñe como lo haría con un protocolo estándar de azul de Coomassie o proceda a un procedimiento de inmunotransferencia (western-blot).


8.3: Preparación de muestras - Biología

Protocolo Laemmli PAGE-SDS


% Acrilamida 10% 10% 12% 12% 15%
Número de minigeles 5 8 5 8 5
TrisHCl 1,5 M, pH 8,3 + SDS al 0,4% 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml
30% Acrilamida 0,8% Metilen bis acrilamida 9,3 ml 13,9 ml 11,3 ml 16,9 ml 13,9 ml
H 2 O 12,3 ml 18,4 ml 9,3 ml 13,9 ml 6,3 ml
10% APS 100 ul 150 ul 100 ul 150 ul 100 ul
TEMED 23 ul 35 ul 23 ul 35 ul 23 ul

% Acrilamida 10% 10% 12% 12% 15%
Número de minigeles 5 8 5 8 5
TrisHCl 1,5 M, pH 8,3 + SDS al 0,4% 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml 10,5 ml 7,0 ml
40% Acrilamida / Metilen bis acrilamida (relación: 37,5: 1) 7,2 ml 10,8 ml 8,6 ml 12,9 ml 10,8 ml
H 2 O 14,4 ml 21,5 ml 12 ml 17,9 ml 9,4 ml
10% APS 100 ul 150 ul 100 ul 150 ul 100 ul
TEMED 23 ul 35 ul 23 ul 35 ul 23 ul

Agregue TEMED y APS al final. Gire suavemente el matraz para mezclar, teniendo cuidado de no generar burbujas. Pipetee la solución a un nivel de 4 cm de la parte superior. Agregue 0.3ml de n-buttanol. Una interfaz líquida muy nítida será visible en 10-20 minutos. Deje polimerizar el gel durante al menos una hora más. Enjuague la superficie del gel con agua antes de verter el gel de apilamiento.

Gel de apilamiento

Número de minigeles 2 5 8
Número de minigeles 2 5 8
TrisHCl 0,5 M pH 6,8+ 0,4% SDS 2,5 ml 4,0 ml 5,2 ml TrisHCl 0,5 M pH 6,8+ 0,4% SDS 2,5 ml 4,0 ml 5,2 ml
30 % Acrilamida 0,8% metilen bis acrilamida 1,0 ml 1,5 ml 2,0 ml 40 % De acrilamida / metilen bis acrilamida (relación: 37,5: 1) 0,75 ml 1,1 ml 1,4 ml
H 2 O 6,4 ml 9,6 ml 12,8 ml H 2 O 6,6 ml 10 ml 13,4 ml
10% APS 100 ul 150 ul 200 ul 10% APS 100 ul 150 ul 200 ul
TEMED 10 ul 15 ul 20 ul TEMED 10 ul 15 ul 20 ul

Llene cada sándwich con solución de gel apilable e inserte un peine en cada lugar teniendo cuidado de no atrapar burbujas debajo de los dientes. El gel debe polimerizar completamente después de 1 hora. Cubra el gel con una envoltura de nailon. Mantenga los geles no más de 2 semanas a 4 ° C.

Antes de agregar el tampón de muestra, mantenga las muestras a 0 ° C. Agregue el tampón de muestra SDS (RT) a la muestra (todavía en hielo) y hierva a 100 ° C inmediatamente de 3 a 5 min. NO deje la muestra en el tampón de muestra SDS sin calentarlas. Las proteasas endógenas son muy activas en el tampón de muestra SDS y pueden causar una degradación grave. Una vez calentada, la muestra puede permanecer a temperatura ambiente durante un corto tiempo hasta que se cargue, o a -20 ° C durante un tiempo prolongado.
Para un espesor de gel de 0,75 mm y 15 pocillos se aplicaron 10-25 ug de proteína de una mezcla compleja, al teñir con azul de Coomasie y de 0,5 a 5 ug para muestras de una o pocas proteínas. Si se usa tinción de plata, se puede usar de 10 a 100 veces menos proteína.
Las muestras pueden concentrarse o eliminarse las interferencias (sales, etc.) con TCA, acetona, TCA-DOC, etanol, etc. (ver Protocolo adjunto). Los iones de potasio en particular deben eliminarse ya que precipitan el SDS.
Algunas proteínas, como las proteínas nucleares no histonas y las proteínas de membrana, requieren la presencia de urea 8 M en el tampón de muestra SDS para obtener una solubilización completa.
Algunas proteínas unidas a la membrana experimentan agregación a temperaturas superiores a 40-50 ° C. En este caso incubar 30min a 40 & degC con tampón de muestra.
Un cambio en las distancias de migración de las proteínas.
con puentes internos de disulfuro se pudo observar incubando muestras en SDS en presencia o ausencia de agentes reductores (mercaptoetanol, DTT, DTE, etc.)


Contenido

Preparación de la biblioteca Editar

Los pasos generales para preparar una biblioteca de ADN complementario (ADNc) para la secuenciación se describen a continuación, pero a menudo varían entre plataformas. [8] [3] [9]

  1. Aislamiento de ARN:El ARN se aísla del tejido y se mezcla con desoxirribonucleasa (DNasa). La DNasa reduce la cantidad de ADN genómico. La cantidad de degradación del ARN se verifica con electroforesis en gel y capilar y se usa para asignar un número de integridad del ARN a la muestra. Esta calidad de ARN y la cantidad total de ARN inicial se tienen en cuenta durante los pasos posteriores de preparación, secuenciación y análisis de la biblioteca.
  1. Selección / agotamiento de ARN: Para analizar las señales de interés, el ARN aislado se puede mantener como está, filtrar el ARN con colas poliadeniladas (poli (A)) en 3 'para incluir solo ARNm, reducir el ARN ribosómico (ARNr) y / o filtrar el ARN que une secuencias específicas (Métodos de selección y agotamiento de ARN La mesa debajo). El ARN con colas 3 'poli (A) se compone principalmente de secuencias codificantes maduras procesadas. La selección de poli (A) se realiza mezclando ARN con oligómeros poli (T) unidos covalentemente a un sustrato, típicamente perlas magnéticas. [10] [11] La selección de poli (A) tiene limitaciones importantes en la detección de biotipos de ARN. Muchos biotipos de ARN no están poliadenilados, incluidos muchos transcritos de proteínas de núcleo de histonas y ARN no codificantes, o están regulados a través de la longitud de su cola de poli (A) (p. Ej., Citocinas) y, por lo tanto, es posible que no se detecten después de la selección de poli (A). [12] Además, la selección de poli (A) puede aumentar el sesgo 3 ', especialmente con ARN de menor calidad. [13] [14] Estas limitaciones se pueden evitar con el agotamiento del ribosoma, eliminando el ARNr que típicamente representa más del 90% del ARN en una célula. Tanto el enriquecimiento de poli (A) como los pasos de agotamiento del ribosoma son laboriosos y podrían introducir sesgos, por lo que se han desarrollado enfoques más simples para omitir estos pasos. [15] Los objetivos de ARN pequeños, como el miARN, pueden aislarse aún más mediante la selección del tamaño con geles de exclusión, perlas magnéticas o kits comerciales.
  1. Síntesis de ADNc: El ARN se transcribe de forma inversa a ADNc porque el ADN es más estable y permite la amplificación (que utiliza ADN polimerasas) y aprovecha una tecnología de secuenciación de ADN más madura. La amplificación posterior a la transcripción inversa da como resultado la pérdida de la hebra, que puede evitarse con el marcaje químico o la secuenciación de una sola molécula. La fragmentación y la selección del tamaño se realizan para purificar las secuencias que tienen la longitud adecuada para la máquina de secuenciación. El ARN, el ADNc o ambos se fragmentan con enzimas, sonicación o nebulizadores. La fragmentación del ARN reduce el sesgo 5 'de la transcripción inversa cebada aleatoriamente y la influencia de los sitios de unión del cebador, [11] con la desventaja de que los extremos 5' y 3 'se convierten en ADN de manera menos eficiente. A la fragmentación le sigue la selección del tamaño, en la que se eliminan las secuencias pequeñas o se selecciona un rango estrecho de longitudes de secuencia. Debido a que los ARN pequeños como los miARN se pierden, estos se analizan de forma independiente. El ADNc de cada experimento se puede indexar con un código de barras hexámero u octámero, de modo que estos experimentos se pueden agrupar en un solo carril para la secuenciación multiplexada.

Secuenciación complementaria de ADN (cDNA-Seq) Editar

La biblioteca de ADNc derivada de biotipos de ARN se secuencia luego en un formato legible por computadora. Existen muchas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para la secuenciación de ADNc, incluidas las plataformas desarrolladas por Illumina, Thermo Fisher, BGI / MGI, PacBio y Oxford Nanopore Technologies. [16] Para la secuenciación de lectura corta de Illumina, una tecnología común para la secuenciación de cDNA, los adaptadores se ligan al cDNA, el DNA se une a una celda de flujo, los clústeres se generan a través de ciclos de amplificación y desnaturalización en puente, y la secuencia por síntesis es realizado en ciclos de síntesis de hebras complementarias y excitación láser de bases con terminadores reversibles. La elección y los parámetros de la plataforma de secuenciación están guiados por el diseño experimental y el costo. Las consideraciones comunes del diseño experimental incluyen decidir la longitud de la secuenciación, la profundidad de la secuenciación, el uso de secuenciación de un solo extremo frente a la secuencia de pares, el número de réplicas, la multiplexación, la aleatorización y las adiciones. [17]

Secuenciación de ARN pequeño / ARN no codificante Editar

Al secuenciar un ARN distinto del ARNm, se modifica la preparación de la biblioteca. El ARN celular se selecciona en función del rango de tamaño deseado. Para objetivos de ARN pequeños, como miARN, el ARN se aísla mediante selección de tamaño. Esto se puede realizar con un gel de exclusión de tamaño, mediante perlas magnéticas de selección de tamaño o con un kit desarrollado comercialmente. Una vez aislados, los enlazadores se añaden al extremo 3 'y 5' y luego se purifican. El último paso es la generación de ADNc mediante transcripción inversa.

Secuenciación directa de ARN Editar

Debido a que se ha demostrado que la conversión de ARN en ADNc, la ligadura, la amplificación y otras manipulaciones de muestras introducen sesgos y artefactos que pueden interferir con la caracterización y cuantificación adecuadas de las transcripciones, [18] empresas como Helicos han explorado la secuenciación directa de ARN de una sola molécula. (en quiebra), Oxford Nanopore Technologies, [19] y otros. Esta tecnología secuencia las moléculas de ARN directamente de una manera masivamente paralela.

Secuenciación de ARN en tiempo real de una sola molécula Editar

Se ha explorado la RNA-Seq directa de una sola molécula masivamente paralela como una alternativa a la RNA-Seq tradicional, en la que la conversión, ligación, amplificación y otros pasos de manipulación de la muestra de RNA a cDNA pueden introducir sesgos y artefactos. [20] Las plataformas tecnológicas que realizan RNA-Seq de una sola molécula en tiempo real incluyen la secuenciación Nanopore de Oxford Nanopore Technologies (ONT), [19] PacBio IsoSeq y Helicos (en quiebra). La secuenciación del ARN en su forma nativa conserva modificaciones como la metilación, lo que permite investigarlas directa y simultáneamente. [19] Otro beneficio de RNA-Seq de molécula única es que las transcripciones se pueden cubrir en su totalidad, lo que permite una detección y cuantificación de isoformas de mayor confianza en comparación con la secuenciación de lectura corta. Tradicionalmente, los métodos de RNA-Seq de molécula única tienen tasas de error más altas en comparación con la secuenciación de lectura corta, pero los métodos más nuevos como ONT directo RNA-Seq limitan los errores al evitar la fragmentación y la conversión de cDNA. Los usos recientes de la secuencia de ARN directa de ONT para la expresión diferencial en poblaciones de células humanas han demostrado que esta tecnología puede superar muchas limitaciones de la secuenciación de ADNc corta y larga. [21]

Secuenciación de ARN unicelular (scRNA-Seq) Editar

Los métodos estándar, como los microarrays y el análisis de secuencia de ARN a granel estándar, analizan la expresión de ARN de grandes poblaciones de células. En poblaciones de células mixtas, estas medidas pueden ocultar diferencias críticas entre células individuales dentro de estas poblaciones. [22] [23]

La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-Seq) proporciona los perfiles de expresión de las células individuales. Aunque no es posible obtener información completa sobre cada ARN expresado por cada célula, debido a la pequeña cantidad de material disponible, los patrones de expresión génica pueden identificarse mediante análisis de agrupamiento de genes. Esto puede descubrir la existencia de tipos de células raras dentro de una población celular que tal vez nunca antes se hayan visto. Por ejemplo, dos grupos que realizaron scRNA-Seq en el epitelio de las vías respiratorias del pulmón identificaron en 2018 células especializadas raras en el pulmón llamadas ionocitos pulmonares que expresan el regulador de conductancia transmembrana de fibrosis quística. [24] [25]

Procedimientos experimentales Editar

Los protocolos de scRNA-Seq actuales implican los siguientes pasos: aislamiento de células individuales y ARN, transcripción inversa (RT), amplificación, generación de bibliotecas y secuenciación. Las células individuales se separan mecánicamente en micropocillos (p. Ej., BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform o CellMicrosystems CellRaft) o se encapsulan en gotitas (p. Ej., 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop, Dolomite Bio Nadia). [26] Las células individuales se marcan agregando perlas con oligonucleótidos con códigos de barras, tanto las células como las perlas se suministran en cantidades limitadas, de modo que la co-ocupación con múltiples células y perlas es un evento muy raro. Una vez que se completa la transcripción inversa, los ADNc de muchas células se pueden mezclar para secuenciar las transcripciones de una célula en particular que se identifican mediante el código de barras único de cada célula. [27] [28] Se puede adjuntar un identificador molecular único (UMI) a las secuencias diana de ARNm / ADNc para ayudar a identificar los artefactos durante la preparación de la biblioteca. [29]

Los desafíos para scRNA-Seq incluyen preservar la abundancia relativa inicial de mRNA en una célula e identificar transcripciones raras. [30] El paso de transcripción inversa es fundamental ya que la eficiencia de la reacción de RT determina qué cantidad de la población de ARN de la célula será finalmente analizada por el secuenciador. La procesividad de las transcriptasas inversas y las estrategias de cebado utilizadas pueden afectar la producción de ADNc de longitud completa y la generación de bibliotecas sesgadas hacia el extremo 3 'o 5' de los genes.

En la etapa de amplificación, actualmente se usa PCR o transcripción in vitro (IVT) para amplificar el ADNc. Una de las ventajas de los métodos basados ​​en PCR es la capacidad de generar ADNc de longitud completa. Sin embargo, también se pueden amplificar exponencialmente diferentes eficiencias de PCR en secuencias particulares (por ejemplo, contenido de GC y estructura de retroceso), produciendo bibliotecas con cobertura desigual. Por otro lado, mientras que las bibliotecas generadas por IVT pueden evitar el sesgo de secuencia inducido por PCR, las secuencias específicas pueden transcribirse de manera ineficaz, provocando así la pérdida de secuencia o generando secuencias incompletas. [31] [22] Se han publicado varios protocolos de scRNA-Seq: Tang et al., [32] STRT, [33] SMART-seq, [34] CEL-seq, [35] RAGE-seq, [36] Quartz -seq [37] y C1-CAGE. [38] Estos protocolos difieren en términos de estrategias para la transcripción inversa, síntesis y amplificación de ADNc, y la posibilidad de acomodar códigos de barras específicos de secuencia (es decir, UMI) o la capacidad de procesar muestras agrupadas. [39]

En 2017, se introdujeron dos enfoques para medir simultáneamente el ARNm de una sola célula y la expresión de proteínas a través de anticuerpos marcados con oligonucleótidos conocidos como REAP-seq, [40] y CITE-seq. [41]

Aplicaciones Editar

scRNA-Seq se está utilizando ampliamente en disciplinas biológicas que incluyen Desarrollo, Neurología, [42] Oncología, [43] [44] [45] Enfermedades autoinmunes, [46] y Enfermedades infecciosas. [47]

scRNA-Seq ha proporcionado información considerable sobre el desarrollo de embriones y organismos, incluido el gusano Caenorhabditis elegans, [48] y el planario regenerativo Schmidtea mediterranea. [49] [50] Los primeros animales vertebrados que se mapearon de esta manera fueron el pez cebra [51] [52] y Xenopus laevis. [53] En cada caso, se estudiaron múltiples etapas del embrión, lo que permitió mapear todo el proceso de desarrollo célula por célula. [8] La ciencia reconoció estos avances como el Avance del año 2018. [54]

Consideraciones experimentales Editar

Se consideran una variedad de parámetros al diseñar y realizar experimentos de RNA-Seq:

  • Especificidad de tejido: La expresión génica varía dentro de los tejidos y entre ellos, y RNA-Seq mide esta mezcla de tipos de células. Esto puede dificultar el aislamiento del mecanismo biológico de interés. La secuenciación de una sola célula se puede utilizar para estudiar cada célula de forma individual, mitigando este problema.
  • Dependencia del tiempo: La expresión genética cambia con el tiempo y RNA-Seq solo toma una instantánea. Se pueden realizar experimentos de curso temporal para observar cambios en el transcriptoma.
  • Cobertura (también conocida como profundidad): El ARN alberga las mismas mutaciones observadas en el ADN y la detección requiere una cobertura más profunda. Con una cobertura lo suficientemente alta, se puede utilizar RNA-Seq para estimar la expresión de cada alelo. Esto puede proporcionar información sobre fenómenos como la impronta o los efectos cis-reguladores. La profundidad de secuenciación requerida para aplicaciones específicas se puede extrapolar de un experimento piloto. [55]
  • Artefactos de generación de datos (también conocidos como variación técnica): Los reactivos (por ejemplo, el kit de preparación de la biblioteca), el personal involucrado y el tipo de secuenciador (por ejemplo, Illumina, Pacific Biosciences) pueden generar artefactos técnicos que podrían malinterpretarse como resultados significativos. Al igual que con cualquier experimento científico, es prudente realizar RNA-Seq en un entorno bien controlado. Si esto no es posible o el estudio es un metanálisis, otra solución es detectar artefactos técnicos al inferir variables latentes (típicamente análisis de componentes principales o análisis factorial) y posteriormente corregir estas variables. [56]
  • Gestión de datos: Un solo experimento de RNA-Seq en humanos suele ser de 1 a 5 Gb (comprimido), o más cuando se incluyen archivos intermedios. [57] Este gran volumen de datos puede plantear problemas de almacenamiento. Una solución es comprimir los datos utilizando esquemas computacionales multipropósito (por ejemplo, gzip) o esquemas específicos de genómica. Este último puede basarse en secuencias de referencia o de novo. Otra solución es realizar experimentos de microarrays, que pueden ser suficientes para trabajos basados ​​en hipótesis o estudios de replicación (a diferencia de la investigación exploratoria).

Ensamblaje del transcriptoma Editar

Se utilizan dos métodos para asignar lecturas de secuencias sin procesar a características genómicas (es decir, ensamblar el transcriptoma):

  • De novo: Este enfoque no requiere un genoma de referencia para reconstruir el transcriptoma y se usa típicamente si el genoma es desconocido, incompleto o sustancialmente alterado en comparación con la referencia. [58] Los desafíos al usar lecturas cortas para ensamblaje de novo incluyen 1) determinar qué lecturas deben unirse en secuencias contiguas (contigs), 2) robustez a errores de secuenciación y otros artefactos, y 3) eficiencia computacional. El algoritmo principal utilizado para el ensamblaje de novo pasó de gráficos superpuestos, que identifican todas las superposiciones por pares entre lecturas, a gráficos de Bruijn, que dividen las lecturas en secuencias de longitud k y colapsan todos los k-mers en una tabla hash. [59] Se utilizaron gráficos superpuestos con la secuenciación de Sanger, pero no se adaptan bien a los millones de lecturas generadas con RNA-Seq. Ejemplos de ensambladores que usan gráficos de Bruijn son Trinity, [58] Oases [60] (derivado del ensamblador de genoma Velvet [61]), Bridger, [62] y rnaSPAdes. [63] La secuenciación de pares y de lectura larga de la misma muestra puede mitigar los déficits en la secuenciación de lectura corta sirviendo como plantilla o esqueleto. Las métricas para evaluar la calidad de un ensamblaje de novo incluyen la longitud media del contig, el número de contigs y N50. [64]
  • Guiado por genoma: Este enfoque se basa en los mismos métodos utilizados para la alineación del ADN, con la complejidad adicional de alinear las lecturas que cubren porciones no continuas del genoma de referencia. [65] Estas lecturas no continuas son el resultado de secuenciar transcripciones empalmadas (ver figura). Por lo general, los algoritmos de alineación tienen dos pasos: 1) alinear porciones cortas de la lectura (es decir, sembrar el genoma) y 2) usar programación dinámica para encontrar una alineación óptima, a veces en combinación con anotaciones conocidas. Las herramientas de software que utilizan la alineación guiada por el genoma incluyen Bowtie, [66] TopHat (que se basa en los resultados de BowTie para alinear uniones de empalme), [67] [68] Subread, [69] STAR, [65] HISAT2, [70] y GMAP . [71] El resultado de las herramientas de alineación (mapeo) guiadas por el genoma se puede utilizar adicionalmente con herramientas como Cufflinks [68] o StringTie [72] para reconstruir secuencias de transcripciones contiguas (es decir., un archivo FASTA) .La calidad de un ensamblaje guiado por genoma se puede medir con 1) métricas de ensamblaje de novo (por ejemplo, N50) y 2) comparaciones con transcripciones conocidas, unión de empalme, genoma y secuencias de proteínas utilizando precisión, recuperación, o su combinación (por ejemplo, puntuación F1). [64] Además, en silico La evaluación podría realizarse utilizando lecturas simuladas. [73] [74]

Una nota sobre la calidad del montaje: El consenso actual es que 1) la calidad del ensamblaje puede variar según la métrica que se utilice, 2) las herramientas de ensamblaje que obtuvieron una buena puntuación en una especie no necesariamente funcionan bien en las otras especies, y 3) la combinación de diferentes enfoques podría ser la más confiable. [75] [76] [77]

Cuantificación de expresión génica Editar

La expresión se cuantifica para estudiar los cambios celulares en respuesta a estímulos externos, las diferencias entre estados sanos y enfermos y otras cuestiones de investigación. Los niveles de transcripción se utilizan a menudo como un indicador de la abundancia de proteínas, pero a menudo no son equivalentes debido a eventos postranscripcionales como la interferencia del ARN y la desintegración mediada por tonterías. [78]

La expresión se cuantifica contando el número de lecturas que se asignaron a cada locus en el paso de ensamblaje del transcriptoma. La expresión se puede cuantificar para exones o genes usando contigs o anotaciones de transcripción de referencia. [8] Estos recuentos de lectura de RNA-Seq observados se han validado sólidamente frente a tecnologías más antiguas, incluidos los microarrays de expresión y qPCR. [55] [79] Las herramientas que cuantifican los recuentos son HTSeq, [80] FeatureCounts, [81] Rcount, [82] maxcounts, [83] FIXSEQ, [84] y Cuffquant. Estas herramientas determinan los recuentos de lectura a partir de datos de RNA-Seq alineados, pero también se pueden obtener recuentos sin alineación con Sailfish [85] y Kallisto. [86] Los recuentos leídos se convierten luego en métricas apropiadas para pruebas de hipótesis, regresiones y otros análisis. Los parámetros para esta conversión son:

  • Profundidad / cobertura de secuenciación: Aunque la profundidad está preespecificada cuando se realizan múltiples experimentos de RNA-Seq, aún variará ampliamente entre los experimentos. [87] Por lo tanto, el número total de lecturas generadas en un solo experimento generalmente se normaliza convirtiendo los recuentos en fragmentos, lecturas o recuentos por millón de lecturas mapeadas (FPM, RPM o CPM). La diferencia entre RPM y FPM se derivó históricamente durante la evolución de la secuenciación de fragmentos de un solo extremo a la secuenciación de extremos emparejados. En la secuenciación de un solo extremo, solo hay una lectura por fragmento (es decir., RPM = FPM). En la secuenciación de pares, hay dos lecturas por fragmento (es decir., RPM = 2 x FPM). La profundidad de secuenciación a veces se denomina tamaño de biblioteca, el número de moléculas de ADNc intermediarias en el experimento.
  • Longitud del gen: Los genes más largos tendrán más fragmentos / lecturas / recuentos que los genes más cortos si la expresión de la transcripción es la misma. Esto se ajusta dividiendo el FPM por la longitud de una característica (que puede ser un gen, transcripción o exón), lo que da como resultado los fragmentos métricos por kilobase de característica por millón de lecturas mapeadas (FPKM). [88] Al observar grupos de características en muestras, FPKM se convierte en transcripciones por millón (TPM) dividiendo cada FPKM por la suma de FPKM dentro de una muestra. [89] [90] [91]
  • Salida total de ARN de la muestra: Debido a que se extrae la misma cantidad de ARN de cada muestra, las muestras con más ARN total tendrán menos ARN por gen. Estos genes parecen tener una expresión disminuida, lo que resulta en falsos positivos en los análisis posteriores. [87] Las estrategias de normalización que incluyen el cuantil, DESeq2, TMM y la relación mediana intentan explicar esta diferencia comparando un conjunto de genes expresados ​​no diferencialmente entre muestras y escalando en consecuencia. [92]
  • Varianza para la expresión de cada gen: está modelado para tener en cuenta el error de muestreo (importante para genes con recuentos de lectura bajos), aumentar la potencia y disminuir los falsos positivos. La varianza se puede estimar como una distribución binomial normal, de Poisson o negativa [93] [94] [95] y con frecuencia se descompone en varianza técnica y biológica.

Mejoras para la cuantificación absoluta y la detección de efectos en todo el genoma Editar

Los picos de ARN son muestras de ARN en concentraciones conocidas que se pueden utilizar como estándares de oro en el diseño experimental y durante los análisis posteriores para la cuantificación absoluta y la detección de efectos en todo el genoma.

  • Cuantificación absoluta: La cuantificación absoluta de la expresión génica no es posible con la mayoría de los experimentos de RNA-Seq, que cuantifican la expresión en relación con todas las transcripciones. Es posible realizar RNA-Seq con picos, muestras de RNA a concentraciones conocidas. Después de la secuenciación, los recuentos de lectura de las secuencias de aumento se utilizan para determinar la relación entre los recuentos de lectura de cada gen y las cantidades absolutas de fragmentos biológicos [11] [96] En un ejemplo, esta técnica se utilizó en Xenopus tropicalis embriones para determinar la cinética de transcripción. [97]
  • Detección de efectos en todo el genoma: Los cambios en los reguladores globales, incluidos los remodeladores de cromatina, los factores de transcripción (p. Ej., MYC), los complejos de acetiltransferasa y el posicionamiento de los nucleosomas no son congruentes con los supuestos de normalización y los controles con picos pueden ofrecer una interpretación precisa. [98] [99]

Expresión diferencial Editar

El uso más simple pero a menudo más poderoso de RNA-Seq es encontrar diferencias en la expresión génica entre dos o más condiciones (p.ej., tratado versus no tratado) este proceso se llama expresión diferencial. Las salidas se denominan con frecuencia genes expresados ​​diferencialmente (DEG) y estos genes pueden regularse hacia arriba o hacia abajo (es decir., mayor o menor en la condición de interés). Hay muchas herramientas que realizan expresión diferencial. La mayoría se ejecutan en R, Python o la línea de comandos de Unix. Las herramientas de uso común incluyen DESeq, [94] edgeR, [95] y voom + limma, [93] [100] todas las cuales están disponibles a través de R / Bioconductor. [101] [102] Estas son las consideraciones comunes al realizar la expresión diferencial:

  • Entradas: Las entradas de expresión diferencial incluyen (1) una matriz de expresión de RNA-Seq (M genes x N muestras) y (2) una matriz de diseño que contiene condiciones experimentales para N muestras. La matriz de diseño más simple contiene una columna, que corresponde a las etiquetas de la condición que se está probando. Otras covariables (también denominadas factores, características, etiquetas o parámetros) pueden incluir efectos por lotes, artefactos conocidos y cualquier metadato que pueda confundir o mediar en la expresión génica. Además de las covariables conocidas, las covariables desconocidas también se pueden estimar mediante enfoques de aprendizaje automático no supervisados ​​que incluyen análisis de componentes principales, variables sustitutas [103] y PEER [56]. Los análisis de variables ocultas a menudo se emplean para datos de RNA-Seq de tejido humano, que normalmente tienen artefactos adicionales que no se capturan en los metadatos (p.ej., tiempo isquémico, abastecimiento de múltiples instituciones, rasgos clínicos subyacentes, recopilación de datos a lo largo de muchos años con mucho personal).
  • Métodos: La mayoría de las herramientas utilizan estadísticas de regresión o no paramétricas para identificar genes expresados ​​diferencialmente y se basan en recuentos de lectura mapeados en un genoma de referencia (DESeq2, limma, edgeR) o en recuentos de lectura derivados de la cuantificación sin alineación (sleuth, [104 ] Cuffdiff, [105] Ballgown [106]). [107] Después de la regresión, la mayoría de las herramientas emplean ajustes del valor p de la tasa de error familiar (FWER) o la tasa de descubrimiento falso (FDR) para tener en cuenta múltiples hipótesis (en estudios en humanos,

20.000 genes codificadores de proteínas o

Los análisis posteriores para una lista de genes expresados ​​diferencialmente vienen en dos sabores, validando observaciones y haciendo inferencias biológicas. Debido a las trampas de la expresión diferencial y RNA-Seq, las observaciones importantes se replican con (1) un método ortogonal en las mismas muestras (como PCR en tiempo real) u (2) otro experimento, a veces prerregistrado, en una nueva cohorte . Esto último ayuda a garantizar la generalización y, por lo general, puede seguirse con un metanálisis de todas las cohortes agrupadas. El método más común para obtener una comprensión biológica de alto nivel de los resultados es el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes, aunque a veces se emplean enfoques de genes candidatos. El enriquecimiento del conjunto de genes determina si la superposición entre dos conjuntos de genes es estadísticamente significativa, en este caso la superposición entre genes expresados ​​diferencialmente y conjuntos de genes de rutas / bases de datos conocidas (p.ej., Ontología de genes, KEGG, Ontología de fenotipo humano) o de análisis complementarios en los mismos datos (como redes de coexpresión). Las herramientas comunes para el enriquecimiento de conjuntos de genes incluyen interfaces web (p.ej., ENRICHR, g: profiler, WEBGESTALT) [114] y paquetes de software. Al evaluar los resultados del enriquecimiento, una heurística es buscar primero el enriquecimiento de la biología conocida como una verificación de cordura y luego expandir el alcance para buscar una nueva biología.

Empalme alternativo Editar

El empalme de ARN es parte integral de los eucariotas y contribuye significativamente a la regulación y diversidad de proteínas, lo que ocurre en & gt90% de los genes humanos. [115] Existen múltiples modos de empalme alternativos: omisión de exón (modo de empalme más común en humanos y eucariotas superiores), exones mutuamente excluyentes, sitios donantes o aceptores alternativos, retención de intrones (modo de empalme más común en plantas, hongos y protozoos), sitio de inicio de la transcripción alternativo (promotor) y poliadenilación alternativa. [115] Uno de los objetivos de RNA-Seq es identificar eventos de empalme alternativos y probar si difieren entre las condiciones. La secuenciación de lectura larga captura la transcripción completa y, por lo tanto, minimiza muchos de los problemas en la estimación de la abundancia de isoformas, como el mapeo de lectura ambiguo. Para RNA-Seq de lectura corta, existen varios métodos para detectar empalmes alternativos que se pueden clasificar en tres grupos principales: [116] [89] [117]

  • Basado en conteo (también basado en eventos, empalme diferencial): estimate exon retention. Examples are DEXSeq, [118] MATS, [119] and SeqGSEA. [120]
  • Isoform-based (also multi-read modules, differential isoform expression): estimate isoform abundance first, and then relative abundance between conditions. Examples are Cufflinks 2 [121] and DiffSplice. [122]
  • Intron excision based: calculate alternative splicing using split reads. Examples are MAJIQ [123] and Leafcutter. [117]

Differential gene expression tools can also be used for differential isoform expression if isoforms are quantified ahead of time with other tools like RSEM. [124]

Coexpression networks Edit

Coexpression networks are data-derived representations of genes behaving in a similar way across tissues and experimental conditions. [125] Their main purpose lies in hypothesis generation and guilt-by-association approaches for inferring functions of previously unknown genes. [125] RNA-Seq data has been used to infer genes involved in specific pathways based on Pearson correlation, both in plants [126] and mammals. [127] The main advantage of RNA-Seq data in this kind of analysis over the microarray platforms is the capability to cover the entire transcriptome, therefore allowing the possibility to unravel more complete representations of the gene regulatory networks. Differential regulation of the splice isoforms of the same gene can be detected and used to predict their biological functions. [128] [129] Weighted gene co-expression network analysis has been successfully used to identify co-expression modules and intramodular hub genes based on RNA seq data. Co-expression modules may correspond to cell types or pathways. Highly connected intramodular hubs can be interpreted as representatives of their respective module. An eigengene is a weighted sum of expression of all genes in a module. Eigengenes are useful biomarkers (features) for diagnosis and prognosis. [130] Variance-Stabilizing Transformation approaches for estimating correlation coefficients based on RNA seq data have been proposed. [126]

Variant discovery Edit

RNA-Seq captures DNA variation, including single nucleotide variants, small insertions/deletions. and structural variation. Variant calling in RNA-Seq is similar to DNA variant calling and often employs the same tools (including SAMtools mpileup [131] and GATK HaplotypeCaller [132] ) with adjustments to account for splicing. One unique dimension for RNA variants is allele-specific expression (ASE): the variants from only one haplotype might be preferentially expressed due to regulatory effects including imprinting and expression quantitative trait loci, and noncoding rare variants. [133] [134] Limitations of RNA variant identification include that it only reflects expressed regions (in humans, <5% of the genome), could be subject to biases introduced by data processing (e.g., de novo transcriptome assemblies underestimate heterozygosity [135] ), and has lower quality when compared to direct DNA sequencing.

RNA editing (post-transcriptional alterations) Edit

Having the matching genomic and transcriptomic sequences of an individual can help detect post-transcriptional edits (RNA editing). [3] A post-transcriptional modification event is identified if the gene's transcript has an allele/variant not observed in the genomic data.

Fusion gene detection Edit

Caused by different structural modifications in the genome, fusion genes have gained attention because of their relationship with cancer. [136] The ability of RNA-Seq to analyze a sample's whole transcriptome in an unbiased fashion makes it an attractive tool to find these kinds of common events in cancer. [4]

The idea follows from the process of aligning the short transcriptomic reads to a reference genome. Most of the short reads will fall within one complete exon, and a smaller but still large set would be expected to map to known exon-exon junctions. The remaining unmapped short reads would then be further analyzed to determine whether they match an exon-exon junction where the exons come from different genes. This would be evidence of a possible fusion event, however, because of the length of the reads, this could prove to be very noisy. An alternative approach is to use paired-end reads, when a potentially large number of paired reads would map each end to a different exon, giving better coverage of these events (see figure). Nonetheless, the end result consists of multiple and potentially novel combinations of genes providing an ideal starting point for further validation.

RNA-Seq was first developed in mid 2000s with the advent of next-generation sequencing technology. [139] The first manuscripts that used RNA-Seq even without using the term includes those of prostate cancer cell lines [140] (dated 2006), Medicago truncatula [141] (2006), maize [142] (2007), and Arabidopsis thaliana [143] (2007), while the term "RNA-Seq" itself was first mentioned in 2008 [144] The number of manuscripts referring to RNA-Seq in the title or abstract (Figure, blue line) is continuously increasing with 6754 manuscripts published in 2018. The intersection of RNA-Seq and medicine (Figure, gold line) has similar celerity. [145]

Applications to medicine Edit

RNA-Seq has the potential to identify new disease biology, profile biomarkers for clinical indications, infer druggable pathways, and make genetic diagnoses. These results could be further personalized for subgroups or even individual patients, potentially highlighting more effective prevention, diagnostics, and therapy. The feasibility of this approach is in part dictated by costs in money and time a related limitation is the required team of specialists (bioinformaticians, physicians/clinicians, basic researchers, technicians) to fully interpret the huge amount of data generated by this analysis. [146]

Large-scale sequencing efforts Edit

A lot of emphasis has been given to RNA-Seq data after the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) and The Cancer Genome Atlas (TCGA) projects have used this approach to characterize dozens of cell lines [147] and thousands of primary tumor samples, [148] respectively. ENCODE aimed to identify genome-wide regulatory regions in different cohort of cell lines and transcriptomic data are paramount in order to understand the downstream effect of those epigenetic and genetic regulatory layers. TCGA, instead, aimed to collect and analyze thousands of patient's samples from 30 different tumor types in order to understand the underlying mechanisms of malignant transformation and progression. In this context RNA-Seq data provide a unique snapshot of the transcriptomic status of the disease and look at an unbiased population of transcripts that allows the identification of novel transcripts, fusion transcripts and non-coding RNAs that could be undetected with different technologies.

This article was submitted to WikiJournal of Science for external academic peer review in 2019 (reviewer reports). The updated content was reintegrated into the Wikipedia page under a CC-BY-SA-3.0 license ( 2021 ). The version of record as reviewed is: Felix Richter et al. (17 May 2021). "A broad introduction to RNA-Seq". WikiJournal of Science. 4 (2): 4. doi:10.15347/WJS/2021.004. ISSN 2470-6345. Wikidata Q100146647.


1 An introduction to statistics

1.3 Why biologists have to repeat everything

1.4 Why biologists have to bother with statistics

1.5 Why statistical logic is so strange

1.6 Why there are so many statistical tests

1.7 Using the decision chart

2 Dealing with variability

2.2 Examining the distribution of data

2.3 The normal distribution

2.4 Describing the normal distribution

2.5 The variability of samples

2.7 Presenting descriptive statistics and confidence limits

2.8 Introducing computer programs

2.9 Calculating descriptive statistics

2.10 Self-assessment problems

3 Testing for normality and transforming data

3.1 The importance of normality testing

3.3 What to do if your data has a significantly different distribution from the normal

3.4 Examining data in practice

3.6 The complete testing procedure

3.7 Self-assessment problems

4 Testing for differences from an expected value or between two groups

4.2 Why we need statistical tests for differences

4.3 How we test for differences

4.4 One- and two-tailed tests

4.5 The types of t test and their non-parametric equivalents

4.9 Introduction to non-parametric tests for differences

4.10 The one-sample sign test

4.11 The Wilcoxon matched pairs test

4.12 The Mann–Whitney U test

4.13 Self-assessment problems

5 Testing for differences between more than two groups: ANOVA and its non-parametric equivalents

5.3 Deciding which groups are different – post hoc tests

5.4 Presenting the results of one-way ANOVAs

5.5 Repeated measures ANOVA

5.6 The Kruskal–Wallis test

5.9 The Scheirer–Ray–Hare Test

5.11 Self-assessment problems

6 Investigating relationships

6.2 Examining data for relationships

6.5 Statistical tests for linear relationships

6.8 Studying common non-linear relationships

6.9 Dealing with non-normally distributed data: rank correlation

6.10 Self-assessment problems

7 Dealing with categorical data

7.2 The problem of variation

7.3 The x2 test for differences

7.4 The x2 test for association

7.7 Self-assessment problems

8.3 Excluding confounding variables

8.4 Replication and pseudoreplication

8.5 Randomisation and blocking

8.6 Choosing the statistical test

8.7 Choosing the number of replicates: power calculations

8.8 Dealing with your results

8.9 Self-assessment problems

9 More complex statistical analysis

9.1 Introduction to complex statistics

9.2 Experiments investigating several factors

9.3 Experiments in which you cannot control all the variables

9.4 Investigating the relationships between several variables

9.5 Exploring data to investigate groupings

10 Presenting and writing about statistics

10.1 Introduction – less is more!

10.2 The introduction section

10.5 The discussion section

10.6 The abstract or summary

Table S1: Critical values for the t statistic

Table S2: Critical values for the correlation coefficient r

Table S3: Critical values for the x2 statistic

Table S4: Critical values for the Wilcoxon T distribution

Table S5: Critical values for the Mann–Whitney U distribution

Table S6: Critical values for the Friedman x2 distribution

Table S7: Critical values for the Spearman rank correlation coefficient r


Sample Preparation with Nanomaterials. Next Generation Techniques and Applications. Edition No. 1

Sample Preparation with Nanomaterials: Next Generation Techniques for Sample Preparation delivers insightful and complete overview of recent progress in the use of nanomaterials in sample preparation. The book begins with an overview of special features of nanomaterials and their applications in analytical sciences. Important types of nanomaterials, like carbon nanotubes and magnetic particles, are reviewed and biological sample preparation and lab-on-a-chip systems are presented.

The distinguished author places special emphasis on approaches that tend to green and reduce the cost of sample treatment processes. He also discusses the legal, economical, and toxicity aspects of nanomaterial samples. This book includes extensive reference material, like a complete list of manufacturers, that makes it invaluable for professionals in analytical chemistry.

Sample Preparation with Nanomaterials offers considerations of the economic aspects of nanomaterials, as well as the assessment of their toxicity and risk. Readers will also benefit from the inclusion of:

  • A thorough introduction to nanomaterials in the analytical sciences and special properties of nanomaterials for sample preparation
  • An exploration of the mechanism of adsorption and desorption on nanomaterials, including carbon nanomaterials used as adsorbents
  • Discussions of membrane applications of nanomaterials, surface enhanced raman spectroscopy, and the use of nanomaterials for biological sample preparation
  • A treatment of magnetic nanomaterials, lab-on-a-chip nanomaterials, and toxicity and risk assessment of nanomaterials

Perfect for analytical chemists, materials scientists, and process engineers, Sample Preparation with Nanomaterials: Next Generation Techniques for Sample Preparation will also earn a place in the libraries of analytical laboratories, universities, and companies who conduct research into nanomaterials and seek a one-stop resource for sample preparation.

1 Nanomaterials (NMs) in Analytical Sciences
1.1 Introduction
1.2 Types of NMs
1.3 Applications of NMs
1.4 Conclusions
Referencias

2 Special Properties of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
2.1 Introduction
2.2 Mechanical Properties of NMs
2.3 Thermal Properties of NMs
2.4 Electrical Properties of NMs
2.5 Optical Properties of NMs
2.6 Magnetic Properties of NMs
2.7 Adsorption Properties of NMs
2.8 Conclusions
Referencias

3 Adsorption Mechanism on Nanomaterials (NMs)
3. 1Introduction
3.2 Adsorption Process
3.3 Conclusions and Future Perspective
Referencias

4 Carbon Nanomaterials (CNMs) as Adsorbents for SamplePreparation
4.1 Introduction
4.2 Carbon Nanomaterials (CNMs)
4.3 Adsorption on CNMs
4.4 Applications of CNMs
4.5 Conclusions
Referencias

5 Membrane Applications of Nanomaterials (NMs)
5.1 Introduction935.2Traditional Membranes
5.2 Traditional Membranes
5.3 Carbon Nanomaterial-based Membranes
5.4 Nanoparticle-based Membranes
5.5 Molecularly Imprinted Polymer (MIP)-based Membranes
5.6 Conclusions
Referencias

6 Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) withNanomaterials (NMs)
6.1 Introduction
6.2 Theory of SERS
6.3 SERS Mechanisms
6.4 Determination of SERS Enhancement Factor
6.5 Selection Rules
6.6 Fabrications of SERS Substrates
6.7 Applications of SERS
6.8 Conclusions
Referencias

7 Nanomaterials (NMs) for Biological Sample Preparations
7.1 Introduction
7.2 The Use of NMs in Diagnostic Platforms
7.3 NMs-based Lab-on-a-chip (LOC) Platforms
7.4 Biomedical Applications of NMs
7.5 Sensor Applications of NMs
7.6 Conclusions

8 Magnetic Nanomaterials for Sample Preparation
8.1 Introduction
8.2 Synthesis of Magnetic Nanoparticles
8.3 Solid-Phase Extraction (SPE)
8.4 Magnetic Solid-Phase Extraction (MSPE)
8.5 Conclusions and Future Trends
Referencias

9 Lab on Chip with Nanomaterials (NMs)
9.1 Introduction
9.2 Lab-on-a-Chip (LOC) Concept
9.3 NM-Based LOC Platforms
9.4 Conclusions and Future Perspectives
Referencias

10 Toxicity and Risk Assessment of Nanomaterials
10.1 Introduction
10.2 Hazard Assessment of Nanomaterials
10.3 Toxicity Mechanism of Nanomaterials
10.4 The Traditional Risk Assessment Paradigm
10.5 Strategies for Improving Specific Risk Assessment
10.6 Conclusions
Referencias

11 Economic Aspects of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
11.1 Introduction
11.2 Toxicity Concerns of NMs
11.3 Global Market for NM-Based Products
11.4 Conclusions
Referencias

12 Legal Aspects of Nanomaterials (NMs) for SamplePreparation
12.1 Introduction
12.2 Safety Issues of NMs
12.3 Regulatory Aspects of NMs
12.4 Conclusions
Referencias

13 Monitoring of Nanomaterials (NMs) in the Environment
13.1 Introduction
13.2 Toxicity and Safety Concerns of NMs
13.3 Main Sources and Transport Routes of Nanopollutants
13.4 Requirements of Analytical Approaches
13.5 Sampling of NMs in Environmental Samples
13.6 Separation of NMs in Environmental Samples
13.7 Detection Techniques for the Characterization of NMs
13.8 Conclusions
Referencias

14 Future Prospect of Sampling
14.1 Introduction
14.2 Sampling
14.3 Sample Preparation
14.4 Green Chemistry
14.5 Miniaturization of Analytical Systems
14.6 Conclusions
Referencias


4. Discusión

Given the urgent need to control the COVID-19 pandemic, vaccine development is being accelerated into the clinical trials phase [4] , [7] , [8] , even though understanding of the immunologic features of the antigens of SARS-CoV-2 remains poor. In this phase I trial, a study was performed to investigate the safety and immunogenicity of this inactivated vaccine in 191 subjects. The data collected show several notable features. First, the clinical safety observations among the 191 subjects suggest that there were no severe adverse reactions related to vaccination, and the most frequently reported events were mild, including redness, itching and swelling at the inoculation site and a few cases of slight fatigue there were no significant differences between the vaccine and control groups. These data support the clinical safety of this vaccine. However, based on the current concern about the possibility of immunopathology due to SARS-Cov-2 infection [16] , we extended our safety observations to the investigation of variations in immune cell populations and cytokine levels in the peripheral blood. The test results suggested that there were no abnormalities in most of the 48 detected cytokines and the proportions of immune cells. Second, not only did serological detection show the presence of neutralizing antibodies, antibodies against the S protein, the N protein and the complete virion antigens were also found in ELISA assays to have been elicited in the vaccinated population, and there were dynamic alterations in the levels of these antibodies based on the dose and the vaccination schedule. However, the medium and high doses in both the 0, 14 and 0, 28 schedule groups led to 100% seroconversion of ELISA anti-S antibody after two inoculations, and interestingly, the medium dose group assigned to the 0, 14 schedule reached 100% seroconversion of the neutralizing antibody with the highest GMT value. However, the high-dose group exhibited lower seroconversion and GMT values. According to our understanding, this result might be due to the medium dose providing suitable signal stimulation to the immune system or the limited sample size. Therefore, further investigations in phase II and III trials are necessary. Additionally, the neutralizing antibody can neutralize different pandemic strains with diverse mutations. However, the GMT of neutralizing antibodies measured in this trial is obviously lower than the GMTs observed in the trials of mRNA vaccines developed by Moderna and Pfizer [17] , [18] this difference suggests that characteristic immune responses are elicited by mRNA vaccines and vaccines against the inactivated virus and that these vaccines should be evaluated based upon their clinical protective efficacy [19] . At the time of the antibody response, a CTL response with IFN-gamma specificity against the S, N and virion antigens was detected in immunized individuals in comparison with individuals receiving the placebo this suggests that any one of these three antigens enables the specific activation of T cells even if the immune response does not show dose-dependent effects. These immunological indexes indicate that a systemic immune response was elicited by our vaccine in the human population. To examine the genetic diversity of the specific immunity elicited by the vaccine, we examined the mRNA gene profile of the PBMCs from vaccinated individuals and found that most of the expressed mRNA genes were related to various signaling pathways of the innate and adaptive immune systems, and the immune functions were upregulated in comparison with the placebo group. Here, activation of the multiple signaling pathways involved in the immune response resulted in variations in hundreds of genes related to activation of innate immunity at day 7 after booster immunization regardless of the immunization schedule however, the cytokines that were found to have elevated levels in COVID-19 patients had only mild variations and were at levels similar to those in the placebo control group, which corresponded with those detected in the serum. The activation of genes related to T cells, B cells, DCs and mononuclear cells/macrophages with varying dynamics is evidence of the immune resonse elicited by the vaccine. All the data obtained in this trial support the safety and immunogenicity of this inactivated vaccine and are encouraging with regard to further studies of its efficacy in the future.

A limitation of this study is the lack of analysis of the protective efficacy of the vaccine and the lack of a comparative transcriptional analysis of PBMCs from vaccinated individuals and COVID-19 patients the latter comparison was not possible because few blood samples have been obtained from COVID-19 patients in mainland China at this time.


The Exams

The external assessment

The IB uses a criterion based approach to assessment. This means that students work is judged against identified levels of attainment and not against the work of other students. At the grade award meeting which takes place once all the papers have been marked levels of attainment, in the form of grade boundaries are agreed. There is consideration of the difficulty of the exams and the performance of students and a committee of people are involved.

Several methods of assessment are used: Assessment criteria when the task in open ended, Markbands with a range of level descriptors used to judge students answers to some extended response questions, Analytic markschemes where a particular kind of response is required, and Marking notes are used to clarify assessment criteria.

Examiners are monitored throughout the marking process and ever effort is made to ensure consistency in marking.

Standard Level

Multiple choice questions are quite challenging and students need practice with the style.

Each question has a "distractor" or answer which is almost correct. Usually one or two answers are quite obviously wrong.

The data analysis questions at the beginning of this paper require good skills in the interpretation of graphs but also an ability to cope with unfamiliar material.

The short answer questions are the least complicated part of the external assessment. If a student knows the biology these questions resemble the work a student often does using text books and worksheets in lessons. The challenge is to be prepared to answer questions on any part of the IB Biology guide.

There is a choice of two extended response questions, students must answer all three sections of one question. Care is required in reading the questions, in particular the command term so that students give the right sort of answers. Often there is one part which requires a diagram.

Historically, many students find this exam easier than paper 2 because there is less syllabus coverage and students can prepare more thoroughly for the option material. There are two or three questions in section A which will test knowledge of practical experiment skills and analysis of results from any part of the core topics and the prescribed experiments. Section B resembles the short answer section of paper 2 except that it covers only material from the chosen option. Students should be trained in choosing the correct option and only answering questions from one option.

Internal Assessment

This investigation is assessed by the teacher in school and a sample of work is moderated by the IB and adjustments made to marks so that all centres are awarding marks in a similar standard. For further details see The Investigation pages.

Higher Level

Although the length of all the exams for HL is longer than the SL exams, the structure of all examinations and the investigation is the same as for SL.

The only exception is in Paper 2 where students will have a choice of two out of three extended response questions. The weighting of paper two is slightly less that the SL paper 2 to allow for assessment of the extra HL material in the option paper.


Riffle Sample Splitters with chutes

Riffle sample Splitters, also called Sample Dividers with Chutes, allow dividing samples into two representative subsamples with a good accuracy.

Riffle Sample Splitter is the most universally used sampling device for preparing representative splits of dry, free-flowing granular product.

The technique is rapid and the equipment is economical.

It is precisely designed to reduce the bulk of material to a convenient representative size for laboratory analysis. When used properly, it provides an accuracy that is recognized through out the industry

With Riffle Sample Splitters, a homogenous, dry, free-flowing sample is poured evenly into the hopper / funnel. The material flows through the alternately arranged passages in the opposite direction (chutes / riffle bank) into the two collecting pans under the dividing head outlets. With every operation the feed sample is divided in two representative subsamples. The operation can be repeated as many times as necessary, until the required dividing quantity has been obtained.


8.3: Sample preparation - Biology

There are two methods to transform E. coli cells with plasmid DNA - chemical transformation and electroporation. For chemical transformation, cells are grown to mid-log phase, harvested and treated with divalent cations such as CaCl2. Cells treated in such a way are said to be competent. To chemically transform cells, competent cells are mixed with the DNA , on ice, followed by a brief heat shock. Then, cells are incubated with rich medium and allowed to express the antibiotic resistant gene for 30-60 minutes prior to plating. For electroporation, cells are also grown to mid-log phase but are then washed extensively with water to eliminate all salts. Usually, glycerol is added to the water to a final concentration of 10% so that the cells can be stored frozen and saved for future experiments. To electroporate DNA into cells, washed E. coli are mixed with the DNA to be transformed and then pipetted into a plastic cuvette containing electrodes. A short electric pulse, about 2400 volts/cm, is applied to the cells causing smalls holes in the membrane through which the DNA enters. The cells are then incubated with broth as above before plating.

For chemical transformation, there is no need to pre-treat the DNA. For electroporation, the DNA must be free of all salts so the ligations are first precipitated with alcohol before they are used.

Diseño experimental :

To determine the efficiency of transformation, a positive control transformation should be done using 1 ng of uncut plasmid DNA, e.g. pUC19. The efficiency of transformation is calculated as the number of transformants/&mug of input DNA. A negative control should also be included that contains cells with no added DNA.

A negative control with cells only (no added DNA) should also be included.

For most cloning applications, we use DH5&alpha host cells. These cells are compatible with lacZ blue/white selection procedures, are easily transformed, and good quality plasmid DNA can be recovered from transformants. One notable exception is when transforming with plasmid constructs containing recombinant genes under control of the T7 polymerase. These constructs are typically transformed into DH5&alpha for the cloning phase, but need to be transformed into a different bacterial strain, BL21(DE3) for expression of the recombinant protein (BL21 strains carry the gene for expression of the T7 polymerase).

Electroporation of E. coli:

  • Sterile centrifuge bottles &ndash 250 ml for GSA rotor
  • SOB medium
  • E. coli host strain such as DH5&alpha
  • WB (10% redistilled glycerol, 90% distilled water, v/v) chilled to 4°C&ndash need 500 ml of WB for each 250 ml of culture
  • tRNA (5-10 µg/ml &ndash used as a mass carrier to increase the efficiency of precipitation)
  • 5 M ammonium acetate
  • 100% ethanol
  • 70% ethanol
  • 0.5X TE or EB (10 mM Tris, pH 8.3)
  • SOC medium
  • transformation plates

I. Preparation of E. coli cells for electroporation.

1. Use a fresh colony of DH5&alpha (or other appropriate host strain) to inoculate 5 ml of SOB (without magnesium) medium in a 50 ml sterile conical tube. Grow cells with vigorous aeration overnight at 37°C.

2. Dilute 2.5 ml of cells into 250 ml of SOB (without magnesium) in a 1 liter flask. Grow for 2 to 3 hours with vigorous aeration at 37°C until the cells reach an OD550 = 0.8.

3. Harvest cells by centrifugation at 5000 RPM in a GSA rotor for 10 min in sterile centrifuge bottles. (Make sure you use autoclaved bottles!).

4. Wash the cell pellet in 250 ml of ice-cold WB as follows. First, add a small amount of WB to cell pellet pipet up and down or gently vortex until cells are resuspended. Then fill centrifuge bottle with ice cold WB and gently mix. NOTE- the absolute volume of WB added at this point is not important.

5. Centrifuge the cell suspension at 5,000 RPM for 15 min and carefully pour off the supernatant as soon as the rotor stops. Cells washed in WB do not pellet well. If the supernatant is turbid, increase the centrifugation time.

6. Wash the cell pellet a second time by resuspending in 250 ml of sterile ice-cold WB using the same technique described above. Centrifuge the cell suspension at 5000 RPM for 15 min.

7. Gently pour off the supernatant leaving a small amount of WB in the bottom of the bottle. Resuspend the cell pellet in the WB - no additional WB needs to be added &ndash and the final volume should be about 1 ml. Cells can be used immediately or can be frozen in 0.2 ml aliquots in freezer vials using a dry ice-ethanol bath. Store frozen cells at -70°C.

II. Preparing DNA for Electroporation

DNA for electroporation must have a very low ionic strength and a high resistance. The DNA may be purified by either dilution, precipitation or dialysis.

  • For transformation of purified plasmid DNA, dilute DNA in 10 mM Tris pH 8-8.3 to about 1-50 ng/µl (do not use TE). Use 1 µl for transformation.
  • For ligation reactions, use the following procedure.

Purifying DNA by Precipitation:

1. Add 5 to 10 &mug of tRNA to a 20 &mul ligation reaction in a 1.5 ml tube. Add 22 &mul 5M ammonium acetate (or an equal volume of ligation reaction with added tRNA). Mezclar bien.

2. Add 100 &mul absolute ethanol (or 2.5 volumes of ligation reaction, tRNA and salt). Ice 15 min.

3. Centrifuge at >12,000 x g for 15 min at 4°C. Carefully decant the supernatant.

4. Wash the pellet with 1 ml of 70% ethanol. Centrifuge at >12,000 x g for 15 min at room temperature. Remove the supernate.

5. Air dry the pellet (speed vac okay but don't overdry).

6. Resuspend the DNA in EB buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3) or 0.5X TE buffer [5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA (pH 7.5)] to a concentration of 10 ng/ul of DNA. For ligation reactions, it is convenient to resuspend in 10 µl. Use 1 &mul per transformation of 20 &mul of cell suspension.

III. Electroporation.

1. Mark the required number of micro centrifuge tubes. Place the required number of Micro-electroporation Chambers on ice. Fill the temperature control compartment of the Chamber Safe with

250 ml of ice-water slurry and place the Chamber Rack in the Chamber Safe.

2. Thaw an aliquot of cells that have prepared as in Section I and aliquot 20 µ l of cells to the required number of microfuge tubes on ice. Add 1 µ l of the DNA (or ligation reaction) prepared as in Section II.

3. Using a micro pipette, pipette 20 µ l of the cell-DNA mixture between the bosses in a Micro-Electroporation Chamber. Do not leave an air bubble in the droplet of cells the pressure of a bubble may cause arcing and loss of the sample. Place the chamber in a slot in the Chamber Rack and note its position. Repeat the process if more than one sample is to be pulsed. Up to 4 samples can be placed in the Chamber Rack at one time. Handle the chambers gently to avoid accidentally displacing the sample from between the bosses.

4. Close the lid of the Chamber safe and secure it with the draw latch.

5. Plug the pulse cable into the right side of the Chamber safe.

6. Turn the chamber selection knob on top of the Chamber Safe to direct the electrical pulse to the desired Micro-Electroporation Chamber.

7. Set the resistance on the Voltage Booster to 4 k&Omega set the Pulse Control unit to LOW and 330 µ F double check connections.

8. Charge the Pulse Control unit by setting the CHARGE ARM switch on the Pulse Control unit to CHARGE and then pressing the UP voltage control button until the voltage reading is 5 to 10 volts higher than the desired discharge voltage. Para E. coli, the standard conditions are 2.4 kv, which means setting the Pulse Control unit to 405 volts (400 volts is the desired discharge voltage + 5). The voltage booster amplifies the volts by

6-fold such that the total discharge voltage is 2400 volts, or 2.4 kv. The actual peak voltage delivered to the sample will be shown on the Voltage Booster meter después the pulse is delivered.

9. Set the CHARGE/ARM switch to the ARM position. The green light indicates that the unit is ready to deliver a DC pulse. Depress the pulse discharge TRIGGER button and hold for 1 second.

NOTE: The DC voltage display on the Pulse Control unit should read <10 volts after a pulse has been delivered. If not, discharge the capacitor using the DOWN button.

10. For additional samples, turn the chamber selection knob to the next desired position and repeat steps 8 and 9 until all samples are pulsed.

11. For ampicillin selection, inoculate the samples into 2 ml of SOC medium and shake for 30 minutes (for amp), 60 minutes (for Kan) to allow expression of the antibiotic gene. Plate cells on LB medium with appropriate antibiotic or screening reagent (e.g. 100 µg/ml ampicillin, and/or 40 &mul of 20 mg/ml X-Gal, XP, and 40 &mul of 100 mM IPTG) .

This Web page is maintained by Julie B. Wolf, UMBC
Last updated on 3/2/2010

is designed for students interested in careers in industrial and biomedical sciences.


Ver el vídeo: SEM-EDS I: Preparación de las muestras (Febrero 2023).