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¿Cuáles son los requisitos de estructura secundaria para los dominios de transducción de proteínas de péptidos que penetran en las células?

¿Cuáles son los requisitos de estructura secundaria para los dominios de transducción de proteínas de péptidos que penetran en las células?


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Péptidos penetrantes de células.

Los péptidos penetrantes de células (CPP) son una clase de secuencias cortas de aminoácidos que son suficientes para cruzar las membranas celulares y entregarse junto con cualquier carga adherida al citoplasma de las células. Fueron marcados como CPP recientemente, mientras que el término "dominio de transducción de proteínas" (PTD) se usó en los primeros días de su estudio, cuando las secuencias necesarias se aislaron de proteínas nativas con actividad de penetración celular (en particular, Tat del VIH-1). .

La mayor parte de la literatura científica que he encontrado sobre los CPP se centra en su relevancia potencial para la administración de fármacos dirigida, y principalmente analiza la administración de proteínas y nanopartículas a través de la fusión de CPP al extremo N de la proteína objetivo. La única pregunta y respuesta de este sitio sobre los CPP también apunta a una discusión sobre la fusión N-terminal de los CPP a un péptido de carga. Sin embargo, la investigación sobre los péptidos que penetran en las células ha avanzado mucho desde el artículo de 2005 al que se hace referencia en esa publicación.

La revisión de Milletti de 2012 destaca que ha habido un aumento dramático en el número de diferentes clases de péptidos penetrantes de células, incluidos los CPP hidrófobos, los CPP anfipáticos primarios, los CPP anfipáticos alfa helicoidales, los CPP anfipáticos de hoja beta y los CPP ricos en prolina, entre otros. . ¡Y eso es solo entre 2005 y 2012! El artículo de Milletti 2012 también cubre algunos CPP aislados de otros virus.

No he podido encontrar una revisión de detalles similares escrita desde entonces, aunque estoy seguro de que se ha avanzado mucho en el campo.

Aunque no es mi pregunta principal, agradecería cualquier cita de revisiones más recientes que detallen el mecanismo molecular de penetración celular para una o más clases de CPP, especialmente una revisión de la función de las PTD en sus proteínas nativas.

Solo he comenzado a investigar los CPP y los PTD en sus proteínas nativas y en el entorno de administración de medicamentos porque se hizo evidente que una proteína que estoy estudiando para una tesis de pregrado puede tener un PTD interno que es esencial para su función. No soy un experto en el tema y agradecería información sobre CPP / PTD, incluidos otros sinónimos de CPP / PTD para ayudar en mi búsqueda de literatura, especialmente sinónimos específicos de proteínas nativas con funciones similares a CPP.

¿Cuáles son los requisitos de estructura secundaria para los péptidos que penetran en las células?

Mi pregunta es si los CPP cargados positivamente descritos anteriormente y / o las nuevas clases de CPP descritas en Milletti 2012 solo son funcionales como fusiones N-terminales, o si generalmente funcionan de manera eficiente cuando se incorporan dentro de un bucle interno (en términos de secuencia primaria, pero aún expuesta al solvente). El artículo de 2005 citado en la pregunta anterior de Este sitio sobre este tema afirmaba que el CPP derivado de Tat del VIH-1 se basa en los residuos 47-57, que son residuos internos de la proteína de 86 aminoácidos, una proteína que tiene actividad de penetración celular. en su papel nativo en la infección por VIH-1.

Por lo tanto, mi pregunta no es si esto ocurre alguna vez. claramente lo hace - pero ¿hasta qué punto las CPP aisladas de secuencias internas de proteínas nativas tienen funciones similares a las de CPP en sus proteínas nativas?

El sistema que estoy estudiando para mi tesis es un virus, por lo que cualquier información específica sobre la función de los CPP y los PTD en las proteínas nativas de los virus sería particularmente útil.


Referencias

Jones, S. W., Christison, R., Bundell, K., Voyce, C. J., Brockbank, S. M. V., Newham, P. y Lindsay, M. A. (2005). Caracterización de la liberación de péptidos mediada por péptidos que penetran en las células. Revista británica de farmacología, 145 (8), 1093-1102. http://doi.org/10.1038/sj.bjp.0706279

Milletti, F. (2012). Revisión: Péptidos penetrantes de células: clases, origen y panorama actual. Drug Discovery Today, 17850-860. doi: 10.1016 / j.drudis.2012.03.002

Vivès, E., Brodin, P. y Lebleu, B. (1997). Un dominio básico de la proteína Tat del VIH-1 truncado se transloca rápidamente a través de la membrana plasmática y se acumula en el núcleo celular. Revista de química biológica, 272 (25), 16010-16017.

Si alguien interesado en responder esta pregunta no es un experto, el mejor recurso que puedo proporcionar actualmente para una lista de CPP derivados de proteínas naturales (además del artículo de Milletti 2012 anterior) es:

Hallbrink, M., Kilk, K., Elmquist, A., Lundberg, P., Lindgren, M., Jiang, Y. y… Langel, U. (sin fecha). Predicción de péptidos penetrantes en células. Revista internacional de investigación y terapéutica de péptidos, 11 (4), 249-259.


Continuaré investigando este tema para mi tesis, por lo que si está interesado en responder esta pregunta pero necesita más información, no dude en comentar solicitando información específica que pueda ayudar.

¡Gracias!


No puedo dar una explicación a su pregunta como una respuesta única, pero estoy seguro de que los artículos mencionados a continuación aclararán sus dudas.

  1. Péptidos penetrantes de células: estrategias de diseño más allá de la estructura primaria y la anfipaticidad - Moléculas 2017, 22 (11), 1929; doi: 10,3390 / moléculas22111929. PMID: 29117144

  2. Péptidos que penetran en las células y su utilidad en las modificaciones de la función del genoma (Revisión). Int J Mol Med. Diciembre de 2017; 40 (6): 1615-1623. doi: 10.3892 / ijmm.2017.3172. Publicación electrónica 4 de octubre de 2017 PMID: 29039455

  3. Análisis cuantitativo de espectroscopia de fluorescencia y citometría de flujo de las vías de internalización de péptidos que penetran en las células: optimización, trampas, comparación con la cuantificación por espectrometría de masas. Scientific Reports volumen 6, número de artículo: 36938 (2016). doi: 10.1038 / srep36938


Péptidos que penetran en las células: de los mecanismos moleculares a la terapéutica

El reciente descubrimiento de nuevas moléculas terapéuticas potentes que no llegan a la clínica debido a un suministro deficiente y una baja biodisponibilidad han hecho del suministro de moléculas una piedra angular en el desarrollo terapéutico. Se han diseñado varias tecnologías para mejorar la captación celular de moléculas terapéuticas, incluidos los CPP (péptidos que penetran en las células), que representan un concepto nuevo e innovador para evitar el problema de la biodisponibilidad de los fármacos. Los CPP constituyen herramientas muy prometedoras y se han aplicado con éxito en vivo. Hasta la fecha se han descrito dos estrategias de CPP, la primera requiere un enlace químico entre el fármaco y el portador para la internalización celular del fármaco, y la segunda se basa en la formación de complejos estables con fármacos, dependiendo de su naturaleza química. Las familias Pep y MPG son péptidos anfipáticos cortos, que forman nanopartículas estables con proteínas y ácidos nucleicos respectivamente. Las nanopartículas basadas en MPG y Pep ingresan a las células independientemente de la vía endosomal y entregan cargas de manera eficiente, en una forma completamente biológicamente activa, en una gran variedad de líneas celulares, así como en modelos animales. Esta revisión se centra en la relación estructura-función de las estrategias MPG y Pep-1 no covalentes, y sus requisitos para la captación celular de biomoléculas y aplicaciones en células cultivadas y modelos animales.

Abreviaturas utilizadas:


Abstracto

Los péptidos penetrantes de células (CPP) pueden transportar diversas cargas a través de las membranas de las células vivas. Dado que las primeras generaciones de CPP adolecían de una selectividad celular y tisular insuficiente, estabilidad frente a proteasas y escape de endosomas, se desarrolló una nueva generación de péptidos con propiedades optimizadas. Estos se derivan de fuentes naturales o se crean mediante la combinación de estructuras multivalentes. El segundo método permite lograr una alta eficiencia de internalización, una alta selectividad celular y tisular, y la liberación de los endosomas a través de estructuras híbridas, combinando secuencias para la liberación endosómica, secuencias homing y secuencias para la activación en el tejido diana y para la entrega local de cargas. Los CPP con selectividad tumoral innata incluyen azurina, crotamina, maurocalcina, licosina-I, catelicidina de búfalo y péptido CB5005. Algunos de ellos pueden penetrar las membranas de las células vivas e influir en las vías de señalización intracelular, ejerciendo así efectos citotóxicos contra las células tumorales. Para obtener la penetración de múltiples capas y la estabilización contra la degradación proteolítica, así como para un mejor manejo, los CPP a menudo se conjugan con nanopartículas. Un problema especial para el tratamiento de tumores es la eficiencia del transporte de fármacos a través de cultivos celulares tridimensionales. Por lo tanto, la capacidad de los CPP para administrar el fármaco incluso a los tejidos más internos es de crucial importancia. En particular, la capacidad de ciertos CPP para atravesar barreras como la piel, la barrera hematoencefálica (BBB) ​​y la córnea o conjuntiva de los ojos permitió el reemplazo de inyecciones peligrosas y dolorosas con aerosoles, cremas y gotas calmantes. Sin embargo, es difícil clasificar la eficacia de los CPP porque la eficiencia del transporte y la selectividad del tejido dependen no solo del CPP en sí, sino también del tejido u órgano diana, así como de la carga y el método de acoplamiento CPP-carga. Por lo tanto, la presente revisión describe algunos ejemplos de CPP de nueva generación y tiene como objetivo brindar asesoramiento sobre cómo encontrar o crear el CPP adecuado para una tarea determinada.


Capítulo 10 - Entrega de péptidos y proteínas con péptidos que penetran en las células

Se ha demostrado que los péptidos penetrantes de células (CPP) más comúnmente utilizados: Tat, oligoarginina y transportan, facilitan la entrada de cargas de proteínas / péptidos en las células tanto in vitro como in vivo. En los sistemas celulares, transportan ha mostrado mayores propiedades de internalización que las CPP ricas en arginina antes mencionadas y sus eficiencias de absorción se pueden representar de la siguiente manera: transportan & gt oligoarginina & gt Tat péptido. Al elegir la secuencia de CPP "correcta" para la entrega de la carga, se deben considerar ambos aspectos, y cuando se utilizan concentraciones más bajas, se debe preferir el transportan u oligoarginina. Sin embargo, in vivo, la eficacia de absorción, la especificidad y la toxicidad no se han estudiado exhaustivamente para los diferentes CPP. Sin embargo, es evidente que para la entrega dirigida, es necesario agregar algunos motivos adicionales a la secuencia de CPP. Un aspecto bastante prometedor para la administración de péptidos / proteínas mediada por CPP es que la transcitosis en células endoteliales requiere caveolina. Varios CPP, pero especialmente el transportan, explotan la vía de la caveolina para la entrada celular, posiblemente dando al transportan una “ventaja” beneficiosa in vivo. A pesar de la cantidad de obstáculos y desafíos pendientes que aún se enfrentan en la actualidad, el creciente número de ejemplos de administración in vivo, Tat-HSP70 para el rescate neuronal y Tat-Bcl-x (L) para mejorar la supervivencia de las células precursoras neuronales, confirman que los problemas pueden ser superar de una forma u otra.


¿Por qué utilizar DDS?

El organismo humano plantea muchas dificultades para el suministro seguro de productos farmacéuticos eficaces a la célula diana 14. La administración sistémica y las estrategias endovenosas permiten una biodisponibilidad del 100%, evitando la degradación metabólica entérica y hepática. Una vez en el torrente sanguíneo, el plomo del fármaco debe superar algunos desafíos, evitar la respuesta del sistema inmunológico (activación del complemento y fagocitosis), así como la agregación de proteínas séricas y la filtración renal 24. Una vez cerca de la célula diana, la membrana eucariota planteará más obstáculos, siendo una barrera impermeable para la mayoría de xenobióticos 11, 15, 24, 25. La membrana plasmática solo permite la entrada de pequeños compuestos, que requieren transportadores para la mayoría de las macromoléculas hidrófilas 17.

La necesidad de DDS de moléculas pequeñas y terapias a medida basadas en genes también resulta de sus características bioquímicas, como la escasa estabilidad, la falta de captación celular y la capacidad insuficiente para alcanzar los objetivos 18, 19, 26, 27. Estos son, por tanto, los nuevos retos clave en la medicina: cómo obtener agentes terapéuticos eficaces que actúen localmente con efectos adversos limitados fuera del objetivo 26, sin pérdida de potencia farmacéutica ni necesidad de aumentar las dosis.

Se han desarrollado varios DDS 14, 28, 29. Mientras se imagina dicha tecnología, se debe considerar el uso de materiales biocompatibles para procesos de ensamblaje simples pero fuertes. La optimización y el ajuste de los parámetros biofísico-químicos para mejorar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del DDS también son demandas urgentes en este campo 14, 26. Un DDS exitoso debe funcionar en diferentes tejidos, tener una rápida liberación de endosomas, ser funcional a dosis bajas, no tener toxicidad y ser fácil de administrar en cuanto a aplicaciones terapéuticas 18.

Se han desarrollado varias tecnologías y algunos ejemplos de enfoques de DDS son: electroporación 30, suministro de plásmido mediado por ultrasonido 31, suministro viral 32, nebulización 33, modificación química directa 34 y asociación con un vehículo de suministro no viral como lípidos 35, liposomas 36, dendrímeros 37 , polímeros catiónicos 38, partículas inorgánicas 39, nanotubos de carbono 40, moléculas pequeñas 41, ligandos de receptores 42, más recientemente, proteínas sobrealimentadas 43, 44 y CPP 18, 45, 46. Esta revisión se centrará en un tipo específico de DDS, CPP, principalmente en sus características y su aplicación a las terapias clínicas. La Figura 1 ejemplifica el estado de las tecnologías DDS y las cargas que ya fueron entregadas a las células mediante vías endocíticas celulares o mediante translocación directa de membrana.


Aplicación de estrategias de CPP al suministro de moléculas terapéuticas.

El número de aplicaciones que utilizan CPP está aumentando conscientemente, y hasta ahora más de 300 estudios que utilizan estrategias basadas en CPP covalentes o no covalentes de in vitro para en vivo (Dietz y Bähr, 2004 Gros et al., 2006 Moschos et al., 2007 Patel et al., 2007 Foerg y Merkle, 2008). El interés por los CPP se debe principalmente a su baja citotoxicidad y al hecho de que no existe limitación para el tipo de carga. Aunque los CPP se han utilizado para mejorar la entrega de cargas que varían mucho en tamaño y naturaleza (moléculas pequeñas, oligonucleótidos, ADN plasmídico, péptidos, proteínas, nanopartículas, formulación a base de lípidos, virus, puntos cuánticos), la mayoría de las aplicaciones describen la administración de oligopéptido / proteína (Dietz y Bähr, 2004 Gros et al., 2006 Patel et al., 2007) y ácidos nucleicos o análogos (Juliano et al., 2008) (Tabla 1).

Estrategias basadas en CPP para la entrega de genes

La escasa permeabilidad de la membrana plasmática de las células eucariotas al ADN junto con la baja eficacia del ADN o de los oligonucleótidos para alcanzar su objetivo dentro de las células constituyen las dos barreras principales para el desarrollo de estas moléculas terapéuticas. En la última década, se han desarrollado varios portadores de péptidos que combinan la unión al ADN, principalmente dominio electrostático (polilisina y poliarginina) y propiedades desestabilizadoras de la membrana para facilitar la transferencia de genes a células cultivadas y animales vivos (Niidome y Huang, 2002 Glover et al., 2005 Morris et al., 2008). Péptidos anfipáticos con actividades fusogénicas y endosomolíticas dependientes del pH, como el péptido de fusión de HA2 Se ha demostrado que la subunidad de hemaglutinina de la influenza o los análogos sintéticos GALA, KALA, JTS1 y los péptidos ricos en histidina aumentan la eficiencia de la transfección cuando se asocian con poli-L-lisina / ADN, péptido / ADN de condensación, lípidos catiónicos, polietilenimina o poliamidoamina. polímeros en cascada (para revisión: Morris et al., 2008). Cadenas de péptidos individuales capaces de condensar el ADN y favorecer el escape endosómico (PPTG1) (Rittner et al., 2002) o prevenir la captación endosomal (MPG: Morris et al., 1999) también se han utilizado para la administración de genes en células cultivadas. Sin embargo, solo se han validado unos pocos CPP en vivo para la entrega de genes y, hasta ahora, el péptido anfipático secundario PPTG1 constituye uno de los únicos ejemplos que reportan una significativa en vivo respuesta de expresión génica después de la inyección intravenosa (Rittner et al., 2002). Los CPP de Tat, Transportan y poliarginina se han asociado con otros métodos de administración de genes no virales basados ​​en lípidos, incluidos liposomas, PEI o nanoestructuras (Branden et al., 1999 Tung et al., 2002 Ignatovich et al., 2003 Rudolph et al., 2003 Kilk et al., 2005). La asociación de Tat y octa-arginina a nanoportadores farmacéuticos, descritos como sistemas de entrega no virales basados ​​en nuevos conceptos de empaque. et al., 2004 MacKay et al., 2008), se ha demostrado que mejora la entrega de genes y ofrece la ventaja de combinar motivos de entrega, empaquetado y focalización dentro de la misma partícula (Torchilin, 2008 Vivès et al., 2008 ).

La segunda barrera importante de los sistemas de administración de genes no virales es su escasa translocación nuclear, que sin embargo es esencial para la transfección de células que no se dividen y la terapia génica. Para mejorar la entrega nuclear de plásmidos de ADN, se han aplicado ampliamente péptidos sintéticos que contienen NLS (Cartier y Reszka, 2002 Escriou et al., 2003). La mayoría de estos estudios se realizaron con la secuencia derivada del antígeno T grande NLS de SV40 (PKKKRKV). Esta secuencia se asoció con péptidos catiónicos o que penetran en la membrana, pero también se unió directamente a cargas o se combinó con otros métodos de transfección para facilitar la entrega al núcleo. Además, las secuencias de NLS se han asociado con diferentes CPP hidrófobas para favorecer la focalización nuclear, así como la unión y compactación del ADN. Se ha demostrado que el dominio NLS de MPG mejora la translocación nuclear de ácidos nucleicos sin requerir la ruptura de la membrana nuclear durante la mitosis. La tecnología MPG se ha aplicado tanto al ADN plasmídico como al suministro de oligonucleótidos con alta eficiencia en un gran número de líneas celulares adherentes y en suspensión (Simeoni et al., 2003 Morris et al., 2007b).

Estrategias basadas en CPP para la entrega de análogos de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos neutros pequeños de bloque estérico que incluyen PNA y morfolino-oligómeros de morforodiamidato de fosforodiamidato (PMO) constituyen moléculas potentes para la aplicación antisentido o las estrategias de corrección de empalme de ARNm. Se han aplicado con éxito varios CPP para la entrega de PNA y PMO sin cobrar in vitro y en vivo mediante acoplamiento covalente (Gait, 2003 Moulton y Moulton, 2004 Zatsepin et al., 2005 Juliano et al., 2008). Informado originalmente con Transportan para en vivo suministro de un PNA antisentido dirigido a los receptores de galanina y modificando la transmisión del dolor (Pooga et al., 1998), el uso de CPP para el suministro de oligonucleótidos de bloque estérico se ha extendido a Tat, penetratina, TP10 (una versión corta de Transportan) y péptidos ricos en arginina. Se han informado varios enfoques covalentes basados ​​en CPP para la administración de PNA antisentido (Koppelhus y Nielsen, 2003). Sin embargo, solo se han utilizado unos pocos en vivo, y hasta hace poco no se informó que ninguno de ellos fuera activo a concentraciones submicromolares (Gait, 2003 Abes et al., 2007). Un estudio detallado de la administración de PNA mediada por CPP ha informado que la principal limitación se debe a su secuestro endosómico (Koppelhus y Nielsen, 2003) y, más recientemente, los grupos Lebleu y Gait han descrito nuevas CPP que incluyen R6-penetratina y 6-aminohexanoico oligoarginina espaciada con ácido [(R-Ahx-R)4], que presentan un secuestro endosómico limitado y dan lugar a una respuesta de corrección submicromolar antisentido o de empalme (Abes et al., 2006 2007). Estos CPP han sido validados en vivo para la corrección de empalme en dos modelos terapéuticos: distrofia muscular de Duchenne (Fletcher et al., 2007) y la replicación del coronavirus en ratones (Burrer et al., 2007). También se han aplicado estrategias no covalentes para la liberación de ANP y moléculas imitadoras de ADN (Nan et al., 2005). El péptido Pep-3, una variante de Pep-1, se aplicó con éxito al suministro de PNA y análogos dirigidos a la proteína reguladora del ciclo celular ciclina B1 in vitro y en vivo (Morris et al., 2004b 2007b). Curiosamente, la organización de nanopartículas del complejo Pep-3 / PNA permite la funcionalización de la capa superficial de la partícula, y la PEGilación del portador mejora significativamente la eficacia de la respuesta estabilizando los complejos. Este estudio muestra que dicha modificación mejora el Pep-3 para la administración sistémica en ratones, lo que permite una reducción significativa de la dosis necesaria para inducir una respuesta biológica específica y robusta, que en consecuencia limita los efectos citotóxicos inespecíficos descritos en el tratamiento con altas concentraciones. de conjugado CPP-PNA o complejos no covalentes (Morris et al., 2007b).

Entrega de oligonucleótidos y ARNip

Los oligonucleótidos señuelo y los ARN de interferencia cortos (ARNip) constituyen poderosas herramientas biomédicas para controlar la activación de proteínas y / o la expresión génica postranscripcionalmente. (Elbashir et al., 2001 Hannon, 2002). Sin embargo, la principal limitación de las aplicaciones de ARNip, como la mayoría de las estrategias antisentido o basadas en ácidos nucleicos, sigue siendo su escasa captación celular asociada con la escasa permeabilidad de la membrana celular a los ácidos nucleicos. Se han propuesto varias estrategias virales y no virales para mejorar la entrega de vectores que expresan siRNA o siRNA sintéticos tanto en células cultivadas como en en vivo (De Fougerolles et al., 2007 Juliano et al., 2008). Se han desarrollado estrategias basadas en CPP para mejorar la entrega de oligonucleótidos tanto in vitro y en vivo. La administración de oligonucleótidos cargados y ARNip es más desafiante ya que múltiples cargas aniónicas del ácido nucleico interactúan con el resto de CPP e inhiben la captación por impedimento estérico. La liberación de oligonucleótidos cargados se logró mediante el uso de estrategias de hibridación de PNA o no covalentes basadas en péptidos. En el último, los CPP se unen covalentemente a un PNA que puede hibridar con un oligonucleótido señuelo bicatenario que contiene en una hebra una secuencia flanqueante complementaria al PNA. Se han aplicado estrategias con Transportan y TP10 CPP para la entrega de oligonucleótidos señuelo que interactúan con NFkB o Myc (Fisher et al., 2004 El-Andaloussi et al., 2005). El sistema de administración basado en péptidos MPG se ha aplicado con éxito para la administración de varios tipos de ácidos nucleicos, incluido el fosfodiéster-oligonucleótido dirigido a la proteína fosfatasa cdc25C (Morris et al., 1999), fosforotioato-oligonucleótidos dirigidos al promotor MDR-1 en células de leucemia CEM humanas (Marthinet et al., 2000) y antagonistas de la plantilla de telomerasa tio-fosforamidato en células cancerosas (Asai et al., 2003 Gryaznov et al., 2003). Se han utilizado varias estrategias basadas en CPP para el suministro de ARNip en células cultivadas. ARNip covalentemente ligado a Transportan (Muratovska y Eccles, 2004) y penetratina (Davidson et al., 2004) se han asociado con una respuesta de silenciamiento. Sin embargo, las estrategias no covalentes parecen ser más apropiadas para la entrega de ARNip y producen una respuesta biológica asociada significativa (Simeoni et al., 2003 Kim et al., 2006 Veldhoen et al., 2006 Crombez et al., 2007 Kumar et al., 2007 Lundberg et al., 2007 Meade y Dowdy, 2007). Se ha informado que el péptido MPG mejora la entrega de ARNip en un gran panel de líneas celulares que incluyen líneas celulares adherentes, células en suspensión, cáncer y líneas celulares primarias desafiantes (Simeoni et al., 2003 Morris et al., 2004a Nguyen et al., 2006). Se ha solicitado MPG en vivo entrega de ARNip dirigido a OCT-4 en blastocitos de ratón (Zeineddine et al., 2006) y del ARNip que se dirige a una proteína esencial del ciclo celular, se ha demostrado que la inyección intravenosa de ciclina B1 de partículas de ARNip MPG / ciclina B1 bloquea eficazmente el crecimiento tumoral (Crombez et al., 2007). También se ha demostrado que una variante de MPG (MPG-alfa) que alberga cinco mutaciones en el dominio hidrófobo, para favorecer la conformación helicoidal del péptido, mejora la entrega de ARNip (Veldhoen et al., 2006). Sin embargo, tales modificaciones de MPG aumentan la toxicidad y favorecen la captación celular endosomal (Deshayes et al., 2004c Veldhoen et al., 2006). Este enfoque no covalente se ha extendido a otros CPP, incluida la poliarginina- (Kim et al., 2006 Kumar et al., 2007), penetración- (Lundberg et al., 2007) y péptidos derivados de Tat- (Meade y Dowdy, 2007). Se ha informado que el péptido Tat asociado con un motivo de unión a ARN bloquea en vivo factor de crecimiento epidérmico (EGF), se ha demostrado que el colesterol-Arg9 mejora la entrega de ARNip en vivo contra los factores de crecimiento del endotelio vascular (Kim et al., 2006) y más recientemente, se ha demostrado que un pequeño péptido derivado de la glicoproteína del virus de la rabia asociada a la poliarginina R9 libera ARNip en el SNC (Kumar et al., 2007 ).


Introducción

Durante los últimos 5 años, se ha producido una aparición espectacular de nuevas moléculas terapéuticas potenciales, principalmente debido al desarrollo de la proteómica y la genómica. Sin embargo, estas moléculas siguen estando limitadas por su escasa capacidad para entrar en las células. Para hacerlos más aplicables a la terapia. en vivo, se está tomando un interés creciente en el desarrollo de métodos de administración no virales (Niidome y Huang, 2002 Torchilin, 2005). Con este objetivo, los CPP (péptidos penetrantes en las células) se han utilizado con éxito para mejorar el suministro de macromoléculas biológicamente activas, incluidos ácidos nucleicos, péptidos y proteínas, tanto en cultivos celulares como en en vivo (Järver y Langel, 2004 Gupta et al., 2005). Se han desarrollado dos estrategias principales. El primero se basa en PTD (dominios de transducción de proteínas) naturales o quiméricos unidos covalentemente a cargas, de las cuales las más representativas incluyen un péptido derivado de la proteína Tat del VIH-1 (Fawell et al., 1994 Vivés et al., 1997 Frankel y Pabo, 1998 Schwarze et al., 1999), poliarginina (Wender et al., 2000 Futaki et al., 2001), la tercera hélice de pAnt (proteína homeodominio de antennapedia) (Derossi et al., 1994) y transportan (Pooga et al., 1994). al., 1998). El segundo se basa en péptidos anfifáticos primarios, como MPG o Pep-1, que forman complejos no covalentes estables con cargas (Morris et al., 1997, 2001 Simeoni et al., 2003 Gros et al., 2006). Se ha demostrado que el mecanismo de captación celular de las PTD está esencialmente asociado con las vías endosómicas (Richard et al., 2003, 2005 Nakase et al., 2004 Wadia et al., 2004). Sin embargo, se han reportado evidencias claras de distintas rutas de captación celular, algunas de las cuales son independientes de la ruta endosomal e involucran potenciales transmembrana (Dom et al., 2003 Terrone et al., 2003 Thoren et al., 2003 Rothbard et al. , 2004 Deshayes et al., 2005 Pujals et al., 2006).

El primer contacto que hacen los CPP con las células se produce a través de componentes de la matriz extracelular, los proteoglicanos, que luego desencadenan la captación celular. Los proteoglicanos son proteínas heterogéneas que llevan una o más cadenas laterales de GAG ​​(glicosaminoglicanos) y que varían en tamaño y forma (Kjellen y Lindahl, 1991 Esko y Selleck, 2002). Los proteoglicanos tienden a formar interacciones electrostáticas con moléculas, que son principalmente mediadas por cargas y dependen del número de cargas (Ruoslahti, 1998). Por lo tanto, constituyen un "ancla" de membrana a través de sus cadenas GAG para una gran variedad de ligandos (Sawitsky et al., 1996 Esclatine et al., 2001 Juliano, 2002 Couchman, 2003). Se ha informado que los proteoglicanos están involucrados en diferentes vías que controlan la motilidad celular, la forma o la proliferación celular, que están directamente asociadas con la dinámica del citoesqueleto y la red de actina (Ruoslahti, 1988 Sawitsky et al., 1996 Esclatine et al., 2001 Juliano, 2002 Couchman, 2003 Beauvais y Rapraeger, 2004 Iozzo, 2005). Los HSPG (proteoglicanos de heparán sulfato) sindecán y glucano interactúan con la red de actina a través de su cola citoplasmática de la proteína de unión a actina y ambos participan en la regulación de los 'receptores' de membrana y la captación celular de macromoléculas (Couchman, 2003 Yoneda y Couchman, 2003 Beauvais y Rapraeger, 2004). GAG y HSPG juegan un papel central en el mecanismo de translocación de portadores policatiónicos, liposomas (Mislick y Baldeschwieler, 1996 Kopatz et al., 2004) y PTD (Belting, 2003). Se ha sugerido que GAG ​​constituye un receptor de superficie celular para moléculas portadoras de péptidos extracelulares que están asociadas o no con cargas (Rusnati et al., 1999, 2001 Belting, 2003). El paso inicial para varios CPP, incluidos los péptidos Tat y pAnt ricos en arginina, se asocia con fuertes interacciones electrostáticas con GAG cargados negativamente, que desencadenan su internalización a través de diferentes vías de endocitosis según la presencia y la naturaleza de la carga y la capacidad de el CPP para interactuar con los lípidos (Suzuki et al., 2002 Console et al., 2003 Nakase et al., 2004 Wadia et al., 2004 Richard et al., 2005).

Los portadores de MPG son péptidos anfipáticos que llevan un dominio hidrófobo derivado del dominio de fusión de gp41 del VIH-1 (glicoproteína 41) y una NLS (secuencia de localización nuclear) con 5 cargas positivas. Las MPG son capaces de formar complejos estables con ácidos nucleicos y mejorar su captación celular y, por tanto, su respuesta biológica asociada. Se han utilizado en gran medida para mejorar el suministro de oligonucleótidos antisentido (Morris et al., 1997), ADN plasmídico (Morris et al., 1999a), ARNip (ARN de interferencia pequeños) (Simeoni et al., 2003 Morris et al., 2004 Langlois et al., 2005) y péptidos (Morris et al., 1999b). Se han desarrollado dos péptidos MPG llamados MPG-α y MPG-β que difieren en su estructura secundaria cuando están dentro de la membrana lipídica (Deshayes et al., 2004a, 2004b). Se ha informado que el mecanismo de captación de los complejos de carga y MPG biológicamente activos es independiente de la vía endosómica y está asociado con la capacidad de MPG para interactuar con los lípidos e inducir la desestabilización local de la membrana (Deshayes et al., 2004a, 2004b). Sin embargo, los parámetros asociados con la iniciación del mecanismo de captación celular de estos CPP aún no se conocen bien. En el presente trabajo, hemos investigado el primer paso del mecanismo de captación celular de MPG-β y MPG-α. Hemos demostrado que tanto MPG como MPG: los complejos de carga interactúan con el GAG cargado negativamente de la matriz extracelular. La unión de MPG a GAG desencadena la activación específica de Rac1 GTPasa, que está asociada con la remodelación de la red de actina, lo que constituye el 'inicio' de la captación celular y promueve la entrada en la célula de MPG o MPG: complejos de ADN y, por la mayoría de los CPP, por una mayor fluidez de la membrana. Nuestros resultados sugieren que, aunque la entrada celular de CPP puede seguir diferentes vías, existen algunos pasos iniciales comunes que involucran la plataforma GAG y la activación de GTPasa.


Péptidos y peptidomiméticos como reguladores de interacciones proteína-proteína

Las interacciones proteína-proteína son esenciales para casi todos los procesos celulares.

Los péptidos son candidatos ideales para dirigirse a interacciones proteína-proteína (PPI).

Examinamos los métodos de detección y diseño racional para identificar péptidos que inhiban los IBP.

La creciente popularidad de los péptidos como terapéuticos puede dar lugar a una nueva era de descubrimiento de fármacos.

Las interacciones proteína-proteína son esenciales para casi todos los procesos biológicos intracelulares y extracelulares. La regulación de las interacciones proteína-proteína es una estrategia para regular el destino celular de una manera altamente selectiva. Específicamente, los péptidos son candidatos ideales para la inhibición de las interacciones proteína-proteína porque pueden imitar la superficie de una proteína para competir eficazmente por la unión. Además, los péptidos son sintéticamente accesibles y pueden estabilizarse mediante modificaciones químicas. In this review, we survey screening and rational design methods for identifying peptides to inhibit protein–protein interactions, as well as methods for stabilizing peptides to effectively mimic protein surfaces. In addition, we discuss recent applications of peptides to regulate protein–protein interactions for both basic research and therapeutic purposes.


1 Cell-penetrating peptides: what are they?

The identification of proteins that can enter cells was first reported in the late eighties, contradicting the acknowledged understanding that the plasma membrane is impermeable to hydrophilic molecules. Thus, it has been demonstrated that the Trans-Activator of Transcription (Tat) protein of the Human Immunodeficiency Virus was able to efficiently enter tissue-cultured cells and promote the viral gene expression [1, 2] . Moreover, Antennapedia homeodomain, a transcription factor of Drosophilia melanogaster, was also shown to enter nerve cells and regulate neural morphogenesis [3] . The interesting spontaneous entry of both proteins led to extensive structure/function studies to find the shortest amino acid sequence necessary for the uptake. This resulted in the identification of the first CPPs: Tat peptide, corresponding to the basic domain of HIV-1 Tat protein [4, 5] and penetratin, corresponding to the third helix of the Antennapedia homeodomain [6] . Ever since, various peptides showing the same penetrating capacities have been discovered or rationally designed.

1.1 Definition and classification of CPPs

The field of CPPs evolved rapidly, ever since the first sequences were described. This makes it hard to have a general definition covering the characteristics of the different CPPs discovered. So far, one can say that CPPs are short peptides (generally not exceeding 30 residues) that have the capacity to ubiquitously cross cellular membranes with very limited toxicity, via energy-dependent and/or independent mechanisms, without the necessity of a chiral recognition by specific receptors. Most common CPPs are positively charged peptides, though the presence of few anionic or hydrophobic CPPs was also demonstrated. A primary or secondary amphipathic character is also implicated but not strictly required for the internalization.

According to their origin, we can distinguish three main classes of CPPs: peptides derived from proteins, chimeric peptides that are formed by the fusion of two natural sequences, and synthetic CPPs which are rationally designed sequences usually based on structure–activity studies (Table 1). Other attempts to classify CPPs, in spite of their diversity, were based on the physico-chemical characteristics of the sequences (e.g., their amphipathicity [7] , or their hydrophobicity [8] ). A recent review summarizes the different classifications and the physico-chemical properties of the so-far described CPPs [9] .

Péptido Origen Sequence Referencia
Protein-derived
Penetratin Antennapedia (43–58) RQIKIWFQNRRMKWKK [6]
Tat peptide Tat(48–60) GRKKRRQRRRPPQ [5]
pVEC Cadherin(615–632) LLIILRRRIRKQAHAHSK [10]
Chimeric
Transportan Galanine/Mastoparan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL [11]
MPG HIV-gp41/SV40 T-antigen GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV [12]
Pep-1 HIV-reverse transcriptase/SV40 T-antigen KETWWETWWTEWSQPKKKRKV [13]
Sintético
Polyarginines Based on Tat peptide (R) norte 6 < norte < 12 [14, 15]
MAP de novo KLALKLALKALKAALKLA [16]
R6W3 Based on penetratin RRWWRRWRR [17]

1.2 Applications

CPPs can transport inside living cells a variety of covalently or non-covalently linked cargoes, as has been reviewed for nanoparticles [18] , peptides [18, 19] , proteins [20, 21] , antisense oligonucleotides [20, 22] , small interfering RNA [23] , double stranded DNA [18] and liposomes [18] .

The transport of the smallest cargo to large 120 kDa proteins had been successfully carried out both in vitro and in vivo. For instance, activable CPPs (ACPPs) were recently employed in vivo to target cancer cells over-expressing metalloproteinase-2 [24] , while treatment of various inflammatory diseases by inhibition of NF-κB was also effective in vivo by coupling the inhibitors to different CPPs [25] . Tumor-targeting was also achieved in vivo for the (D)R8–doxorubicin conjugate [26] . It is difficult to keep track of the various applications because the field is emerging rapidly. Recently, a novel class of intrinsically bioactive CPPs, baptized bioportide, made an appearance with the description of a CPP sequence derived from cytochrome c that mimicked the apoptotic role of the entire protein once it entered inside cells [27, 28] . Another in vitro study on mouse neuronal hypothalamic cells revealed that the N-terminal sequence derived from the prion protein could penetrate cells and disabled the formation of prions [29] .


Métodos

Cell Culture

All cell lines were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) and passaged using standard techniques. The HeLa cell line was maintained and tested in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) high glucose, 10% fetal calf serum (FCS), and 1% antibiotic𠄺ntimycotic (ABAM) solution. The MDA-MB-231 cell line culture medium was Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium 1640 (Gibco) supplemented with 9.5% FCS, 0.25 IU mL 𠄱 human insulin (Actrapid Penfill), and 20 mM HEPES (Gibco). The MCF-10A culture medium consisted of DMEM/F12 (Gibco) supplemented with 5% horse serum, human insulin (10 μg mL 𠄱 ), hydrocortisone (0.5 μg mL 𠄱 ), EGF (20 ng mL 𠄱 ), and cholera toxin (100 ng mL 𠄱 ).

Síntesis de péptidos

All peptides were prepared, either commercially (Purar Chemicals, Australia) or in-house, by solid-phase peptide synthesis using Fmoc chemistry and Rink amide resin (except for FITC-labeled peptides, which utilized Fmoc-Val-Wang resin) and cleavage from the resin using standard procedures. The solution concentration of the peptides was determined spectrophotometrically at 280 nm using extinction coefficients determined from the amino acid content, 36 except for FITC-labeled peptides that were quantitated on the basis of the absorbance of fluorescein at 498 nm. 37

Biotinylated Penetratin Biotin-P16 (biotin-ahx-RQIKIWFQNRRMKWKK, where ahx = 1,6-aminohexanoic acid) was prepared with biotin linked N-terminally via the ahx group that served as a spacer. The peptide was purified to homogeneity using reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC), and its identity was confirmed using mass spectrometry (calcd metro/z (C120H194norte38O22S2) 5+ : 517.7 found (C120H194norte38O22S2) 5+ : 518.1).

Biotinylated N-terminal seven residues of Penetratin Biotin-P7 (biotin-βG-RRMKWKK, where βG = β-glycine) was prepared with biotin linked N-terminally via the β-glycine residue that served as a spacer. The peptide was purified to homogeneity using RP-HPLC, and its identity was confirmed using mass spectrometry (calcd metro/z (C59H101norte21O10S2) 4+ : 332.9 found (C59H101norte21O10S2) 4+ : 333.0).

The control peptides Penetratin P16 (RQIKIWFQNRRMKWKK) and G7-18NATE (cyclo-CH2CO-WFEGYDNTFPC) were prepared as reported previously. 35,38

Cargo-containing peptides G7-18NATE-P16 (cyclo-(CH2CO-WFEGYDNTFPC-RQIKIWFQNRRMKWKK)) and G7-18NATE-P7 (cyclo-(CH2CO-WFEGYDNTFPC-RRMKWKK)) were synthesized as a continuous peptide chain and then cyclized via the formation of thioether between the N-terminus and the cysteine side chain post cleavage, as described for G7-18NATE. 38 The peptides were purified to homogeneity using RP-HPLC, and their identities were confirmed using mass spectrometry G7-18NATE-P16 (calcd metro/z (C171H246norte48O38S2) 6+ : 608.3 found (C171H246norte48O38S2) 6+ : 608.6) and G7-18NATE-P7 (calcd metro/z (C113H159norte31O26S2) 5+ : 487.03 found (C113H159norte31O26S2) 5+ : 487.25).

FITC-labeled peptides FITC-P16-NLS (FITC-ahx-RQIKIWFQNRRMKWKK-PKKKRKV), FITC-P7-NLS (FITC-ahx-RRMKWKK-PKKKRKV), and FITC-NLS (FITC-ahx-PKKKRKV) were prepared with FITC linked N-terminally via the ahx group (1,6-aminohexanoic acid), which served as a spacer. The peptides were purified to homogeneity using RP-HPLC, and their identities were confirmed using mass spectrometry FITC-P16-NLS (calcd metro/z (C171H266norte50O33S2) 6+ : 603.0 found (C171H266norte50O33S2) 6+ : 603.46), FITC-P7-NLS (calcd metro/z (C113H179norte33O21S2) 4+ : 600.59 found (C113H179norte33O21S2) 4+ : 601.03), and FITC-NLS (calcd metro/z (C67H100norte16O14S) 3+ : 462.58 found (C67H100norte16O14S) 3+ : 462.72).

Peptide Internalization Assay

HeLa cells were seeded in 96-well plates (30� cells per well) in a culture medium. After 24 h, the media was replaced with a media containing the peptide of interest (at 1 μM) and incubated for 15 min. The cells were washed three times in ice-cold phosphate-buffered saline (PBS), fixed with 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.5% Tween20/PBS. The endogenous alkaline phosphatase activity was neutralized by incubating the plates at 65 ଌ for 60 min. The cells were blocked using 3% bovine serum albumin (BSA)/PBS and treated with streptavidin APase (1 μg mL 𠄱 in 0.1% BSA/PBS) for 30 min at room temperature. Following three times washing with PBS, 50 μL of 100 mg.mL 𠄱 p-nitrophenol phosphate was introduced and incubated for 30 min at room temperature. The enzyme reaction was quenched using 2 M NaOH. The absorbance was measured at 405 nm using FLUOstar Omega. The samples were measured in triplicates, and the background absorbance was determined using untreated cells and subtracted from the test conditions. The statistical analysis was performed using GraphPad Prism6 (GraphPad Software, CA).

Wound-Closure Migration Assay

The MDA-MB-231 or MCF-10A cells were seeded until confluent in 24-well plates, wounded with a sterile pipette tip to create a cell-free gap and cell debris cleared away with fresh media. Lyophilized peptides were resuspended in sterile MQ, diluted to the appropriate concentration in fresh media, and added to the appropriate wells, with each treatment duplicated. The media also contained 1 ng mL 𠄱 EGF to stimulate migration. The Leica AF6000 LX live-cell-imaging system was used to capture images in real time (at 37 ଌ, 5% CO2), with images collected every 30 min from a minimum of five positions per well. The remaining gap area was measured using ImageJ (Fiji) at 0 and 12 h and averaged from all measured positions across the duplicates. At least three independent experiments were performed. To allow for a direct comparison, the results are displayed as the relative percentage of gap closure compared with the untreated control cells normalized to 100%.

Cellular Uptake Assay

MDA-MB-231 cells were seeded (50�) in 24-well plates and grown until 60�% confluent. The media was replaced with the peptide-treated media (at 20 μM) and incubated for 20 min at 37 ଌ. The cells were washed gently three times with the growth media and incubated with Hoechst-treated media (1 μM) for 5 min at 37 ଌ before being transferred to the Leica AF6000 LX live-cell-imaging system. Here, the cells were maintained at 37 ଌ and 5% CO2, and images were taken within 15 min using a 20× objective lens.

Expression and Purification of the Grb7-SH2 Domain

Grb7-SH2 (415� residues) was incorporated into the pGex2T plasmid and expressed and purified, as described previously. 39

Thermal Shift Assays

The lyophilized peptides of interest were resuspended in 50 mM NaPO4, 150 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, and 5% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) and tested at a final concentration of 50 μM. Grb7-SH2, dialyzed in the same buffer (excluding DMSO), was tested at 40 μM. Using Rotor-Gene 3000 (Corbett Life Science), the temperature was increased in 0.5 ଌ increments from 50 to 70 ଌ with a holding time of 60 s. The wavelength of excitation/emission was measured at 530/555 nm. Each condition was measured in duplicate or triplicate with values averaged. Peptide-only and buffer-only control samples were measured and subtracted from the averaged test measurements. At least three independent experiments were conducted. The statistical analysis was performed using GraphPad Prism6 (GraphPad Software, CA).


Ver el vídeo: Cell-penetrating peptide penetratin interacting with a DPPC bilayer (Octubre 2022).