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¿Cómo saber qué residuos pertenecen a las regiones variables o constantes de un Fab (fragmento de anticuerpo)?

¿Cómo saber qué residuos pertenecen a las regiones variables o constantes de un Fab (fragmento de anticuerpo)?


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Tengo un fragmento de estructura de anticuerpo (Fab) y conozco sus secuencias de aminoácidos de su cadena pesada y cadena ligera. Como cada cadena de Fab se puede dividir en regiones variables y constantes, ¿cómo puedo saber qué residuos pertenecen a las regiones variable o constante?

Por supuesto, puedo mirar su estructura 3-D enpymol, pero es difícil saber la pertenencia de los residuos entre las regiones variable y constante.

Este enlace muestra claramente cómo identificar las regiones CDR en función de su secuencia de aminoácidos. ¿Existe una forma similar de diferenciar regiones variables y constantes?


Centrarse en el cuello de botella tecnológico de los fármacos con anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos son secretados por células plasmáticas transformadas a partir de células B, y cada línea de células B puede producir sólo un determinante antigénico específico. El anticuerpo, producido a partir de una única línea celular, se denomina anticuerpo monoclonal (McAb). La primera generación de anticuerpos monoclonales provino de anticuerpo de hibridoma tecnología desarrollada por Koehler y Milstein en 1975. Sobre la base de la tecnología de fusión celular, las células B de ratón capaces de secretar anticuerpos específicos y las células de mieloma de ratón con capacidad reproductiva ilimitada se fusionaron en el hibridoma de células B. Se puede preparar un anticuerpo específico contra un epítopo antigénico cultivando un grupo de células con una sola célula de hibridoma con esta propiedad, como se muestra en la figura 1. Sin embargo, el sistema inmunológico humano puede reconocer anticuerpos monoclonales de ratón, que pueden causar anticuerpos humanos anti-ratón. respuesta de anticuerpos (HAMA). Esto no solo acorta la vida media y debilita la eficacia de los anticuerpos monoclonales terapéuticos, sino que a veces también provoca reacciones adversas graves, por lo que la aplicación clínica de la primera generación de anticuerpos monoclonales es muy limitada.

Figura 1. Ilustración que muestra la ruta de producción de la tecnología de hibridomas.

Desde la aparición del primer anticuerpo monoclonal de ratón Muromonab OKT3 en el mundo en 1986, se han comercializado en el mundo casi 80 anticuerpos monoclonales. Hasta ahora, el anticuerpo monoclonal se ha desarrollado hasta la cuarta generación: la primera generación es el anticuerpo monoclonal de ratón (momab), la segunda generación es el anticuerpo monoclonal quimérico humano-ratón (ximab), la tercera generación es el anticuerpo monoclonal humanizado (zumab), el cuarta generación es anticuerpo monoclonal completamente humano (mumab). La ventaja del anticuerpo monoclonal humanizado y del anticuerpo monoclonal humano es que puede superar la reacción del anticuerpo anti-ratón humano, evitar que la molécula de anticuerpo monoclonal sea rápidamente eliminada por el sistema inmunológico como proteína heterogénea y mejorar la actividad biológica de la molécula de anticuerpo monoclonal. . En particular, las regiones variables y constantes de los anticuerpos humanos son humanas, que pueden eliminar además la inmunogenicidad y los efectos secundarios basándose en los anticuerpos humanizados. Los anticuerpos humanizados y los anticuerpos humanos tienen las características de alta afinidad, alta especificidad y baja toxicidad y efectos secundarios, que superan en gran medida las deficiencias de los anticuerpos de ratón y los anticuerpos monoclonales quiméricos. Por lo tanto, se ha convertido en la tendencia inevitable del desarrollo de fármacos de anticuerpos terapéuticos.

Los anticuerpos monoclonales generalmente se dirigen a antígenos relacionados con la enfermedad o receptores específicos en la superficie celular, como el receptor PD-1 en la superficie de las células tumorales y el ligando PD-L1 en la superficie de las células T. Los inhibidores de PD-1 / PD-L1, que están en el centro de atención, pertenecen a los anticuerpos monoclonales y son el foco de la inmunoterapia tumoral en los últimos años. Nivolumab y pembrolizumab, que están en el mercado, son inhibidores de PD-1 y se utilizan principalmente en el tratamiento del melanoma y el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Los inhibidores de PD-L1 atezolizumab (nombre comercial Tecentriq), durvalumab (nombre comercial Imfinzi) y avelumab (nombre comercial Bavencio) han sido aprobados para el tratamiento del cáncer epitelial uretral. El 28 de septiembre de 2018, la FDA aprobó la lista de Libtayo (cemiplimab-rwlc) desarrollada conjuntamente por Sanofi (Sanofi) y Regenerative. Se usa para tratar el carcinoma de células escamosas de piel metastásico (CSCC) o pacientes con CSCC localmente avanzado que no pueden recibir cirugía de curación o radioterapia. Este es también el tercer anticuerpo anti-PD-1 aprobado por la FDA.

Figura 2. Mecanismo del receptor de PD-1 y los inhibidores de PD-L1 / L2 mediados por la inmunoterapia del cáncer.

Hasta ahora, los fármacos de anticuerpos monoclonales se han convertido en una parte importante de la biomedicina y tienen amplias perspectivas de aplicación en el tratamiento médico. Se ha utilizado con éxito en el tratamiento de tumores, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, rechazo de trasplantes y otras enfermedades. Sin embargo, existen muchos cuellos de botella en la preparación de anticuerpos monoclonales. En la actualidad, el cuello de botella de la investigación y el desarrollo de fármacos de anticuerpos radica en el cribado de moléculas diana, la humanización de anticuerpos y la preparación de anticuerpos humanos, el cribado de anticuerpos de alto rendimiento y a gran escala, la predicción, el modelado y el análisis de epítopos antigénicos, la construcción de configuración tridimensional de la interacción antígeno-anticuerpo y diversas técnicas para aumentar la función del efecto del anticuerpo.

Cribado objetivo del fármaco anticuerpo

Los fármacos de anticuerpos tradicionales se desarrollan a nivel de un solo gen, una sola proteína y un solo anticuerpo. En primer lugar, se necesitarán muchos años para estudiar la función del gen y su proteína codificante para confirmar si el gen y su proteína codificada pueden usarse como dianas de fármacos de anticuerpos para desarrollar fármacos de anticuerpos. El principal inconveniente de este método es que el número de dianas de fármacos de anticuerpos obtenidos es extremadamente limitado, y estos dianas se descubrieron hace más de una década y lleva mucho tiempo, generalmente de 10 a 20 años. Con el progreso continuo de la genómica, el transcriptoma, la proteómica y la tecnología de secuenciación, se han encontrado más y más genes y proteínas nuevos, que se espera que seleccionen dianas de fármacos de anticuerpos adecuados.

¿Cuáles son los criterios para la detección de dianas de fármacos de anticuerpos? En el caso de dianas de fármacos antineoplásicos, en primer lugar, debería haber diferencias en la expresión de la diana, como diferencias entre tejidos normales y tumorales, o pérdida de expresión en órganos clave del huésped, o expresión persistente en el progreso de la enfermedad. En segundo lugar, la diana debe desempeñar un papel, cuando el uso de anticuerpos para el tratamiento, el antígeno no puede ser degradado fácilmente por las enzimas. La producción de anticuerpos de alta afinidad a partir de dianas terapéuticas conocidas no es un obstáculo importante, pero el principal desafío es cribar las moléculas diana.

Ahora, los científicos han utilizado la tecnología de anticuerpos humanizados y la tecnología de anticuerpos completamente humanos, con la esperanza de encontrar mejores dianas de anticuerpos a través del sistema inmunológico humano, a fin de desarrollar mejores fármacos de anticuerpos. La tecnología de anticuerpos completamente humanos está optimizada por la tecnología de hibridoma humano-ratón, la tecnología de hibridoma humano-humano, la inmortalización de células B y la tecnología de biblioteca de anticuerpos completamente humanos de alta eficiencia y alto rendimiento. La selección, maduración y producción de anticuerpos se forman en el cuerpo humano, por lo que todos son anticuerpos humanos en sentido estricto. El sistema inmunitario humano completa la selección de anticuerpos, la producción de anticuerpos y la modificación postranscripcional después de una serie de exámenes. Los anticuerpos producidos por esta técnica tienen la mejor afinidad natural y poder de unión, y actúan de manera más efectiva sobre el cuerpo humano. La tecnología de biblioteca de anticuerpos totalmente humanos de alta eficiencia y alto rendimiento podrá secretar anticuerpos del aislamiento, purificación, enriquecimiento y proliferación de la célula diana. La especificidad del anticuerpo secretado por el subclon de células B se puede cribar e identificar mediante ELISPOT, ELISA o prueba de placa hemolítica. La secuencia génica del anticuerpo diana se obtuvo a partir de la línea celular de cultivo monoclonal y el vector de expresión procariótico o eucariótico se construyó y se transfirió a bacterias o células de ingeniería para reconstruir la actividad del anticuerpo.

2.Análisis de inmunogenicidad de fármacos con anticuerpos monoclonales

En la actualidad, las reacciones adversas frecuentes de los anticuerpos monoclonales se deben principalmente a su inmunogenicidad . Los anticuerpos anti-fármaco causados ​​por inmunogenicidad tienen una gran influencia en la seguridad y eficacia del fármaco. La inmunogenicidad es uno de los factores decisivos en el desarrollo de medicamentos biotecnológicos, por lo que su inmunogenicidad debe tenerse en cuenta al evaluar la seguridad de los medicamentos. Con este fin, los científicos han tomado medidas para mejorar la inmunogenicidad de los fármacos de anticuerpos monoclonales, como la humanización de anticuerpos, la mejora de la solubilidad, la modificación de proteínas (como la modificación de proteínas con polietilenglicol) y la mejora de la función de la molécula efectora.

Figura 3. Modificación de anticuerpos con polietilenglicol.

Los métodos actuales para evaluar y analizar la inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (Elisa), la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), la resonancia de plasma de superficie (SPR), la electroquimioluminiscencia (ECL) y el radioinmunoensayo (RIA). Sin embargo, estos métodos aún no han llegado a una conclusión unificada sobre el valor crítico de la inmunogenicidad, y el valor crítico de la inmunogenicidad es diferente debido a las diferentes leyes de distribución y empresas de cálculo, lo que hace imposible unificar los criterios de aceptación entre diferentes fármacos. Sin embargo, con el progreso continuo de la tecnología de biología molecular, se han mejorado los componentes humanizados de los anticuerpos monoclonales, e incluso se han alcanzado los anticuerpos humanos completos. Mejorar la función molecular de unión y efectora de estos anticuerpos, combinado con modificación de proteínas , se espera que evite la inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales. Al mismo tiempo, mejorar el método de detección de inmunogenicidad, unificarlo y estandarizarlo hará que el ensayo clínico tenga principios rectores claros y, finalmente, acelere la aplicación clínica de los fármacos de anticuerpos monoclonales.

3.Técnica de expresión de células animales de alto rendimiento

En términos de expresión de proteínas sistema, en los últimos años, los científicos han desarrollado y optimizado el sistema de expresión de muchas moléculas de anticuerpos, como bacterias, levaduras, células de insectos, células de mamíferos, sistemas de expresión de células vegetales y sistemas de expresión in vitro. Entre ellos, el sistema de expresión de células de mamífero tiene muchas ventajas importantes, como alta actividad y buena estabilidad, y se ha convertido en el sistema de expresión más importante en la fabricación de productos biotecnológicos de anticuerpos.

Desde el punto de vista de la escala, la velocidad y la función de la preparación de anticuerpos, el desarrollo de tecnología de preparación de anticuerpos de alto rendimiento es muy importante. El cultivo eficiente y a gran escala de células de mamíferos es el principal modo de producción y la tecnología clave de los cuellos de botella de los productos biomédicos. En la actualidad, hay tecnología de cultivo de flujo y tecnología de cultivo de perfusión en el mundo.

4. Construcción y optimización de anticuerpos humanizados y completamente humanos.

Con el desarrollo de la inmunología y la biología molecular, la tecnología de recombinación de ADN se utiliza cada vez más en la construcción y optimización de anticuerpos. Las técnicas para la construcción y optimización de anticuerpos humanizados incluyen el anticuerpo de rejuvenecimiento y el anticuerpo remodelado. Anticuerpo de rejuvenecimiento se refiere a la humanización de residuos de aminoácidos en la superficie de anticuerpos heterogéneos. El principio de este método es reemplazar solo las regiones que son obviamente diferentes de la superficie del anticuerpo humano y reemplazar los aminoácidos similares a los residuos de la superficie del anticuerpo humano sobre la base de mantener la actividad del anticuerpo y reducir la heterogenicidad. Además, no debe haber demasiados segmentos para reemplazar, y los residuos que podrían afectar el tamaño de la cadena lateral, la carga, la hidrofobicidad o pueden formar enlaces de hidrógeno, que influyen en la conformación de la región determinante complementaria (CDR) de anticuerpo, no debe reemplazarse en la medida de lo posible. El anticuerpo reformado se refiere al anticuerpo construido mediante el corte y empalme de los residuos de unión al antígeno del anticuerpo heterogéneo con el anticuerpo humano, incluido el trasplante de la región determinante de complementariedad, el trasplante de la región determinante del complemento parcial y el trasplante de la región determinante específica.

Figura 4. Anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados.

Tanto las cadenas ligeras como pesadas de anticuerpos humanizados provienen de seres humanos y son la región de desarrollo de anticuerpos terapéuticos. En la actualidad, existen técnicas de cribado de bibliotecas de anticuerpos para la construcción y optimización de anticuerpos humanizados, como el reemplazo de cadena y ratones de ingeniería genética para preparar anticuerpos humanizados. Las técnicas de cribado de bibliotecas de anticuerpos más maduras incluyen biblioteca de anticuerpos de fagos , biblioteca de anticuerpos sintéticos y visualización del ribosoma tecnología.

La tecnología de antibióticos se basa en la genómica y la proteómica, combinada con la tecnología de hibridomas y la tecnología de anticuerpos de ingeniería genética, después de un cribado de alto rendimiento de objetivos de anticuerpos, el establecimiento de una biblioteca de anticuerpos a gran escala y finalmente se aplica. En comparación con la tecnología de anticuerpos monoclonales tradicional, la tecnología de la biblioteca de anticuerpos tiene las ventajas de una gran capacidad de biblioteca, más cribado de especies, más fácil de obtener anticuerpos monoclonales altamente activos contra epítopos de antígenos específicos, etc. Al mismo tiempo, la tecnología de la biblioteca de anticuerpos ahorra más tiempo, ahorra mano de obra, es más eficiente y económica en el proceso de selección.

Los ratones siguen siendo la especie animal más fácil para la inmunización y la posterior ingeniería genética, pero el gen de la región V del anticuerpo de ratón todavía se obtiene a través de la biblioteca de anticuerpos de ratón. Para que sea seguro para el uso clínico, se debe llevar a cabo una transformación humanizada de seguimiento. La tecnología de ratón transgénico de anticuerpos completamente humanos desarrollada en los últimos dos años nos permite preparar una biblioteca de anticuerpos inmunes humanos a través de ratones transgénicos con un conjunto completo de genes de anticuerpos humanos, a partir de los cuales podemos seleccionar directamente el gen de la región V del anticuerpo completamente humano. con valor terapéutico. No hay necesidad de una transformación humanizada.

5.Desarrollo de nuevos fármacos con anticuerpos

Los fármacos de anticuerpos tradicionales inhiben el crecimiento tumoral al bloquear una única vía de señal, y la resistencia a los fármacos de los fármacos de anticuerpos es fácil de manifestar en la clínica. Por lo tanto, anticuerpo biespecífico (BsAb) nació. Por medio de la ingeniería genética, se combinan dos fragmentos de anticuerpos que se dirigen a diferentes antígenos, lo que tiene dos sitios de unión al antígeno, que pueden desempeñar un papel sinérgico y mejorar el efecto terapéutico. Este diseño estructural puede mejorar eficazmente el proceso farmacocinético de los fármacos de anticuerpos in vivo y potenciar el efecto terapéutico clínico. Sin embargo, el diseño de BsAb con buen efecto curativo, alta estabilidad y propicio para la producción aún necesita ser estudiado más a fondo.

Los fármacos de anticuerpos en el mercado en los últimos años reflejan la nueva tendencia del desarrollo de la próxima generación de fármacos de anticuerpos. La primera dirección es hacer que los fármacos de anticuerpos tengan un peso molecular más pequeño, de modo que tengan mejores parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos, y sean más fáciles de fabricar a gran escala, como el fragmento Fab, el fragmento Fab & # 8217, F (ab & # 8217) 2, fragmento variable monocatenario (scFv), anticuerpo de dominio único (sdAb), diacuerpo, triacuerpo y minicuerpo. La segunda dirección es conectar al menos dos moléculas con ciertas funciones biológicas para formar proteínas de fusión basadas en moléculas de fármacos conocidas, tales como anticuerpo biespecífico, anticuerpo trifuncional, anticuerpo sintético (sincuerpo), conjugado anticuerpo-fármaco (ADC).

Los acopladores de fármaco-anticuerpo están compuestos por anticuerpos monoclonales y fármacos de pequeño peso molecular con efecto terapéutico. Estos medicamentos realizan la administración dirigida de medicamentos químicos al tejido tumoral con la ayuda de anticuerpos. El conjugado anticuerpo-fármaco tiene una alta estabilidad en la sangre y las moléculas del fármaco no se caerán, por lo que los efectos tóxicos y secundarios son pequeños, pero el efecto inhibidor sobre las células tumorales es mucho mayor que el de los anticuerpos desnudos. Esta estrategia de diseño no solo puede mejorar la capacidad de destrucción de los fármacos de anticuerpos, sino que también mejora la ventana de tratamiento de las pequeñas sustancias químicas moleculares.

Figura 5. Conjugado anticuerpo-fármaco.

Los medicamentos de anticuerpos monoclonales proporcionan una nueva forma de tratamiento de una variedad de enfermedades. En la actualidad, los fármacos de anticuerpos monoclonales se han utilizado ampliamente en el tratamiento clínico de tumores y otras enfermedades. Desde la perspectiva del proceso de desarrollo de fármacos de anticuerpos monoclonales antitumorales, se divide principalmente en cinco partes: descubrimiento del objetivo, selección del objetivo, preparación del antígeno, selección de la tecnología de preparación del anticuerpo monoclonal e identificación de la función del anticuerpo. A través de las características técnicas de estos enlaces, podemos encontrar los factores de riesgo que afectan los resultados de la I + D + i, encontrar los factores de riesgo y utilizar el pensamiento y los métodos de gestión de riesgos para analizar. Las diferentes tecnologías utilizadas en la preparación de anticuerpos monoclonales encontrarán diferentes desafíos. Por esta razón, es necesario que los desarrolladores realicen análisis específicos de problemas específicos y superen constantemente estos desafíos técnicos para desarrollar anticuerpos monoclonales realmente útiles y llevar nuevos medicamentos que salvan la vida de los pacientes.


Modelado de anticuerpos utilizando el servidor web Prediction of ImmunoGlobulin Structure (PIGS)

Los anticuerpos (o inmunoglobulinas) son cruciales para defender a los organismos de los patógenos, pero también son actores clave en muchas aplicaciones médicas, de diagnóstico y biotecnológicas. La capacidad de predecir su estructura y los residuos específicos implicados en el reconocimiento de antígenos tiene varias aplicaciones útiles en todas estas áreas. A lo largo de los años, hemos desarrollado o colaborado en el desarrollo de una estrategia que permite a los investigadores predecir la estructura 3D de los anticuerpos con una precisión muy satisfactoria. La estrategia es completamente automatizada y extremadamente rápida, requiriendo solo unos pocos minutos (10 min en promedio) para construir un modelo estructural de un anticuerpo. Se basa en el concepto de estructuras canónicas de los bucles de anticuerpos y en nuestra comprensión de la forma en que se agrupan las cadenas ligeras y pesadas.


Introducción

Esta clase de laboratorio está diseñada para enseñar la estructura proteica de las moléculas de inmunoglobulina (Ig) y así ampliar el conocimiento y comprensión de esta materia que los estudiantes deberían haber adquirido en las clases teóricas. Combina la visualización molecular de las moléculas de Ig con la animación y experimentación de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). Esto asegura la variedad en las técnicas de enseñanza, mientras que la asociación de las moléculas de Ig con la enfermedad humana aumenta la relevancia de esta clase para los estudiantes de biomedicina.

Las moléculas de Ig son componentes importantes del sistema inmunológico humoral. Son producidos por los linfocitos B como respuesta a la presencia de una molécula extraña (llamada antígeno) en un organismo en particular. Las moléculas de Ig están presentes principalmente en sangre, donde representan la segunda proteína más abundante después de la albúmina, y también lo están en otros fluidos fisiológicos, como el líquido intersticial y las secreciones mucosas 1, 2.

Las moléculas de Ig humana comprenden cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas idénticas con masas moleculares de 53 a 75 kDa (γ, α, µ, δ, ε) que definen las clases de Ig (es decir, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, respectivamente ) y dos cadenas ligeras idénticas con masas moleculares de 25 kDa (κ, λ). La mezcla habitual de moléculas de Ig incluye aproximadamente un 70% como κ y un 30% como cadenas ligeras λ. No se han encontrado diferencias funcionales entre anticuerpos con cadenas ligeras λ o κ 3. Las cadenas polipeptídicas pesadas y ligeras están unidas covalentemente por cuatro enlaces disulfuro entre cadenas, y la estructura terciaria / cuaternaria tiene la forma de una "Y", que se estabiliza aún más mediante enlaces disulfuro intracadena (con 12 en IgG) y una plétora de interacciones más débiles. Cada cadena ligera tiene una variable (VL) y una constante (CL) región. Las cadenas pesadas tienen una variable (VH) y tres (IgG, IgA, IgD) o cuatro (IgM, IgE) regiones constantes (CH1, CH2, CH3, CH4) (figura 1). Estas regiones variables y constantes forman dominios de 110-130 aminoácidos que tienen el pliegue de inmunoglobulina típico, esto también se conoce como una hoja plegada β intercalada, y está unida por un enlace disulfuro intracadena 4. Las regiones variables se forman por recombinación de los segmentos V y J de los genes correspondientes, y estos incluyen los bucles determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2, CDR3) que son responsables de la unión estrecha de los antígenos, con constantes de disociación de 10-4 M a 10-10 M. Las regiones constantes son fundamentales en la activación del complemento y en las interacciones con los receptores Fc en las células efectoras del sistema inmunológico 1, 2. Las moléculas de IgG pueden diferir en su CH1 y CH2 regiones, y por lo tanto, estas incluyen las cuatro subclases de IgG1 a IgG4 que muestran diferentes propiedades biológicas 4. La IgA forma dos subclases, IgA1 e IgA2, que se diferencian en la región bisagra y, por tanto, en su sensibilidad a las proteasas bacterianas. IgA1 tiene una región de bisagra más larga y es abundante en suero, mientras que IgA2 domina en las secreciones mucosas 4. Las moléculas de Ig pueden escindirse mediante proteasas en la región bisagra. La acción de la papaína da como resultado el fragmento Fc que se cristaliza fácilmente y dos fragmentos Fab que se unen al antígeno, ya que se escinde en el lado amino terminal del enlace disulfuro intracadena. La pepsina, por otro lado, forma el fragmento Fc y un fragmento de unión al antígeno F (ab ')2 que está unido por enlaces disulfuro intracadena (Fig. 1). El Fab y F (ab ')2 los fragmentos son importantes para aplicaciones terapéuticas 3.

Las moléculas de Ig pueden formar diferentes oligómeros, con IgA como monómero, dímero o trímero, IgD, IgE e IgG como monómeros, e IgM generalmente como pentámero, donde cinco monómeros están dispuestos alrededor de la subunidad J central, con una masa molecular de 15 kDa. (Figura 1). Curiosamente, esta subunidad J está unida por enlaces disulfuro a solo dos de los cinco monómeros de IgM. IgM también puede formar hexámeros 5. Las moléculas de Ig son glicoproteínas que se combinan con cantidades variables de carbohidratos, donde el grado de glicosilación varía según el isotipo 4. Por tanto, las moléculas de Ig individuales consisten en una colección de formas glicosiladas (glicoformas) 6.

La IgG es la más abundante de las moléculas de Ig en el plasma humano, ya que representa alrededor del 75% del total, con una concentración media de 14 g L -1. Le sigue la IgA, que representa el 15-20% y tiene una concentración promedio de 3.5 g L -1, mientras que la IgM representa el 7% de la Ig total y tiene una concentración promedio de 1.5 g L -1. La IgD es menos abundante, con una concentración media de 30 mg L -1, y la IgE se detecta en trazas 2, 4. Las diferentes moléculas de Ig tienen diferentes roles en el organismo. Las IgG son principalmente eficaces contra los antígenos solubles en el líquido intersticial y tienen un papel clave en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), en la que los antígenos recubiertos de anticuerpos activan sus células efectoras (células asesinas naturales, monocitos) al unirse a Receptor de Fc γ (FcγR) 4. La IgG también tiene funciones en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), ya que la región Fc de IgG interactúa con el complemento 1q (C1q), que desencadena la vía clásica del complemento. Debido a la pequeña masa molecular de las moléculas de Ig, pueden atravesar la placenta para proporcionar inmunidad pasiva al feto. Las IgA son importantes para proteger las superficies corporales y están presentes en las secreciones seromucosas, se unen a los microorganismos y evitan su adherencia a las células de la mucosa. Las moléculas de IgM son los principales anticuerpos de la respuesta inmune primaria. Las IgM se expresan en la superficie de las células B (como monómeros) y se encuentran en una forma secretada (como pentámeros), por lo que pueden eliminar patógenos en las primeras etapas de la inmunidad mediada por células B (humoral), antes de que haya suficiente IgG 2. El papel de la IgD circulante no está claro, aunque se ha demostrado que se une a los basófilos y, por tanto, induce factores antimicrobianos, inflamatorios y estimulantes de las células B 4, 7. La IgE se une a los alérgenos y desencadena la liberación de histamina de los mastocitos y basófilos, por lo que se asocia con hipersensibilidad y reacciones alérgicas 8.

Las estructuras 3D de las moléculas de Ig que se han resuelto están disponibles en el Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank (PDB). Entre estos, están las estructuras de IgG humana (1HZH http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1hzh) e IgM (2RCJ http://www.rcsb.org/pdb/ explore / explore.do? structureId = 2rcj) (Fig.2) 9, 10. El primero de ellos es la estructura cristalina a una resolución de 2,7 Å, y el segundo es una estructura en solución que se obtuvo mediante la dispersión de rayos X de sincrotrón y el modelado de gráficos moleculares 9, 10. Hay varios programas informáticos disponibles para la visualización de estas estructuras de proteínas, como RasMol, PyMol, WebLab Viewer, DS Visualizer y otros, y algunos de ellos están disponibles de forma gratuita. La experiencia de la comunidad bioquímica con el software gratuito de visualización molecular fue encuestada recientemente, por lo que se remite a los lectores a estos datos publicados 11.

Las masas moleculares de las proteínas se determinan más comúnmente usando SDS-PAGE. Los geles de poliacrilamida con diferentes tamaños de poro se forman reticulando monómeros de acrilamida con norte,norte′ -Metilenbisacrilamida. Las proteínas se desnaturalizan inicialmente con SDS, un detergente aniónico, que se une con su parte hidrófoba a las regiones hidrófobas de las proteínas en la proporción constante de una molécula por dos aminoácidos. El SDS protege así la carga intrínseca de los aminoácidos y permite la separación de proteínas en función de la masa molecular. Los agentes reductores β-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT) se pueden agregar a las muestras de proteína para romper los enlaces disulfuro covalentes en los polipéptidos. Para estimar la masa molecular de una proteína individual, se procesa una serie de proteínas estándar de masas moleculares conocidas en el mismo gel. A continuación, se pueden medir las distancias que recorren los estándares de proteínas y las proteínas de interés desde el origen, y el registro10 de la masa molecular (Log M) versus la distancia recorrida (en mm) se traza para proporcionar la curva estándar para la conversión de la distancia recorrida en masa molecular.

En esta clase de laboratorio, las estructuras cuaternarias, terciarias y secundarias de las moléculas de Ig se introducen observando las estructuras 3D de IgG e IgM humanas y, además, se evalúan las masas moleculares de las cadenas polipeptídicas individuales y la oligomerización de IgG e IgM utilizando SDS-PAGE.


Contenido

La inmunidad que se desarrolla cuando un individuo está expuesto a antígenos se denomina inmunidad adaptativa o adquirida, en contraste con la inmunidad que se desarrolla al nacer, que es inmunidad innata. La inmunidad adquirida depende de la interacción entre los antígenos y un grupo de proteínas llamadas anticuerpos producidas por las células B de la sangre. Hay muchos anticuerpos y cada uno es específico para un tipo particular de antígeno. Por tanto, la respuesta inmune en la inmunidad adquirida se debe a la unión precisa de los antígenos al anticuerpo. Solo un área muy pequeña de los antígenos y las moléculas de anticuerpos interactúan realmente a través de sitios de unión complementarios, llamados epítopos en los antígenos y paratopos en los anticuerpos. [5]

Estructura de anticuerpos Editar

En un anticuerpo, la región Fab (fragmento, unión a antígeno) se forma a partir del extremo amino terminal de las cadenas ligera y pesada del polipéptido de inmunoglobulina. Esta región, denominada dominio variable (V), está compuesta por secuencias de aminoácidos que definen cada tipo de anticuerpo y su afinidad de unión a un antígeno. La secuencia combinada de cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) crea tres regiones hipervariables (HV1, HV2 y HV3). En VL estos son aproximadamente de los residuos 28 a 35, de 49 a 59 y de 92 a 103, respectivamente. HV3 es la parte más variable. Por tanto, estas regiones pueden ser parte de un paratopo, la parte de un anticuerpo que reconoce y se une a un antígeno. El resto de la región V entre las regiones hipervariables se denominan regiones marco. Cada dominio V tiene cuatro dominios marco, a saber, FR1, FR2, FR3 y FR4. [4] [6]

Base química de la interacción antígeno-anticuerpo Editar

Los anticuerpos se unen a los antígenos a través de interacciones químicas débiles y la unión es esencialmente no covalente. Se sabe que las interacciones electrostáticas, los enlaces de hidrógeno, las fuerzas de van der Waals y las interacciones hidrófobas están involucradas dependiendo de los sitios de interacción. [7] [8] Los enlaces no covalentes entre el anticuerpo y el antígeno también pueden estar mediados por moléculas de agua interfaciales. Dichos enlaces indirectos pueden contribuir al fenómeno de reactividad cruzada, es decir, el reconocimiento de antígenos diferentes pero relacionados por un solo anticuerpo. [9]

Afinidad de la interacción Editar

El antígeno y el anticuerpo interactúan a través de una unión de alta afinidad similar a la de un candado y una llave. [10] Existe un equilibrio dinámico para la unión. Por ejemplo, la reacción es reversible y se puede expresar como:

donde [Ab] es la concentración de anticuerpo y [Ag] es la concentración de antígeno, ya sea en estado libre ([Ab], [Ag]) o unido ([AbAg]).

Por tanto, la constante de asociación de equilibrio se puede representar como:

Recíprocamente la constante de disociación será:

Sin embargo, estas ecuaciones son aplicables solo a la unión de un solo epítopo, es decir, un antígeno en un anticuerpo. Dado que el anticuerpo tiene necesariamente dos paratopos y, en muchas circunstancias, se produce una unión compleja, el equilibrio de unión múltiple se puede resumir como:

donde, en equilibrio, c es la concentración de ligando libre, r representa la relación entre la concentración de ligando unido y la concentración total de anticuerpo yn es el número máximo de sitios de unión por molécula de anticuerpo (la valencia del anticuerpo).

La fuerza general de la unión de un anticuerpo a un antígeno se denomina avidez por ese antígeno. Dado que los anticuerpos son bivalentes o polivalentes, esta es la suma de las fortalezas de las interacciones anticuerpo-antígeno individuales. La fuerza de una interacción individual entre un único sitio de unión en un anticuerpo y su epítopo diana se denomina afinidad de esa interacción.

La avidez y la afinidad se pueden juzgar por la constante de disociación de las interacciones que describen. Cuanto menor sea la constante de disociación, mayor será la avidez o afinidad y más fuerte la interacción.

Normalmente, los anticuerpos pueden detectar y diferenciar las moléculas del exterior del cuerpo y las que se producen dentro del cuerpo como resultado de las actividades celulares. Auto moléculas ignoradas por el sistema inmunológico. Sin embargo, en determinadas condiciones, los anticuerpos reconocen las propias moléculas como antígenos y desencadenan respuestas inmunes inesperadas. This results in different autoimmune diseases depending on the type of antigens and antibodies involved. Such conditions are always harmful and sometimes deadly. The exact nature of antibody-antigen interaction in autoimmune disease is not yet understood. [11] [12]

Antigen-antibody interaction is used in laboratory techniques for serological test of blood compatibility and various pathogenic infections. The most basic is ABO blood group determination, which is useful for blood transfusion. [13] Sophisticated applications include ELISA, [14] enzyme-linked immunospot (Elispot), immunofluorescence, and immunoelectrophoresis. [15] [16] [17]

Precipitation reaction Edit

Soluble antigens combine with soluble antibodies in presence of an electrolyte at suitable temperature and pH to form insoluble visible complex. This is called a precipitation reaction. It is used for qualitative and quantitative determination of both antigen and antibody. It involves the reaction of soluble antigen with soluble antibodies to form large interlocking aggravated called lattice. It occurs in two distinct stages. Firstly, the antigen and antibody rapidly form antigen-antibody complexes within few seconds and this is followed by a slower reaction in which the antibody-antigen complexes forms lattices that precipitate from the solution.

A special ring test is useful for diagnosis of anthrax and determination of adulteration in food.

Agglutination reaction Edit

It acts on antigen-antibody reaction in which the antibodies cross-link particulate antigens resulting in the visible clumping of the particle. There are two types, namely active and passive agglutination. They are used in blood tests for diagnosis of enteric fever.


Discusión

The early approach to CDR conformational classification defined a strict threshold of similarity for clusters, beyond which any new conformation becomes the first member of a new class/cluster. As the number of new antibody structures increased almost exponentially in the past decades, the definition of a strict similarity threshold became problematic as many conformational variants of known classes appeared in the similarity-criterion space between different clusters. An obvious solution to this new and complex data structure was the pre-exclusion of all structures with characteristics that could potentially point to wrong conformations, or essentially be characterised as “noise” in the data. For instance, in the latest CDR clustering (North, Lehmann & Dunbrack, 2011), the data was considerably simplified by removing structures based on several filtering criteria: crystal resolution high CDR backbone, or non-reported B-factors presence of cis-peptide bonds for residues other than a proline highly improbable backbone conformations and loops with very high conformational energies. In the present study however, the goal was set to obtain a classification for every available CDR, so any “data noise” had to be handled by the clustering methodology.

The primary characteristic of the CDR clustering performed in this study is that the main, or level-1, clusters do not carry a pre-defined degree of conformational similarity. This would require the strict definition of a threshold in the RMSD distance on all Cα-atoms from the cluster’s medoid, or as a maximum cluster diameter (e.g., Martin & Thornton, 1996 Kuroda et al., 2009). Alternatively in North, Lehmann & Dunbrack (2011), a dihedral angle-based distance measure was used in order to define a threshold for cluster merging (65° between each dihedral pair), while the main clustering method (an affinity algorithm) practically produced a final result that is roughly equivalent or close to the level-2 clustering in this study (clustering by r-RL). In contrast in this study, level-1 clusters were formed with no use of discreet distance thresholds whatsoever, but instead based on the greater affinity of each object towards its assigned cluster as expressed by the all-positive SWs while the average SC ensured a typically textbook-defined, reasonable or better global partition of clusters (SC ≥ 0.51).

This approach was selected for two reasons: (1) in order to reduce the subjectivity that is inherent with every threshold definition and clustering decision in general, and (2) in order to allow the adherence of conformational variants to their most apparent closest conformational theme. This in turn may reveal the natural flexibility in physiological conditions, or structural mechanisms and synergies that are specific to an antibody’s function. Indeed, it becomes more straightforward to comparatively examine the reason for a conformational variant when it is found connected to its closest conformational theme, rather than when treated as a completely distinct conformation or as an outlier/singleton. This is also the most important difference between the present antibody CDR clustering analysis and the clustering by UPGMA offered by the recently released CDR structural database SAbDab (Dunbar et al., 2014).

The clustering algorithm employed in this study offered simultaneous flexibility in selecting the most appropriate pruning parameters, and in-depth description of clusters by its definition of cluster core objects. Researchers wishing to retrieve the most representative objects (the most tightly represented conformation) of each cluster may select any one of the cluster’s core CDRs (tagged as such in the clustering results listings). Furthermore, the presentation of each cluster’s extremities in the results (most distant members forming the cluster’s diameter), allows the rapid assessment of the extents of conformational variability of the cluster so that researchers can make informed decisions as to the importance of any observed deviations of their target structure with regard to the overall conformational characteristics of the cluster.

In practice over 80% of the clustering was straightforward in establishing a partition with an SC ≥ 0.51, all positive individual SW, the highest number of clusters possible with close-to-ideal maximum diameters and the lowest number of outliers. In fact, the formalisation of the complete procedure contains few subjective features, namely those of the ideal maximum cluster diameter index and of the overall stringency in examining all possible outcomes (average and complete hierarchical trees, 2nd-stage PAM). In the first case, the index had a merely suggestive role in triggering the assessment of a possible cluster splitting strategy, while in the second case the optional PAM stage or one of the two hierarchical methods may be completely omitted, especially if an acceptable result is already obtained. Therefore, this clustering method can be entirely machine-coded and carried out in a fully automated way, if required.

The major challenge in this clustering was brought by the initial decision to include all the available antibody structures as of the 31st December 2011 edition of PDB, in order to create a complete CDR conformational repertoire. While this decision allowed a richer result, and for all the reasons and possible advantages detailed earlier, it was accepted that noise was added to the dataset by the inclusion of a number of potentially erroneous structures. The usual strategy followed in such cases is data re-sampling, or bootstrapping, in order to assess the effects and influence of noise to the dataset configuration by some estimator (e.g., percentiles, medians, variance, etc.) and to attempt projections for the evolution of partitions in the future. There was reluctance in pursuing such a methodology in this case, mainly because the appearance of new antibody structures in the PDB follows a constantly varying scientific interest for diseases, therapeutics and basic research, and as such the obtained dataset cannot be considered representative of some random process. In this sense it is anecdotal that a few months before the closure of the dataset, a considerable number of anti-HIV and anti-‘flu antibody structures (33/128 structures released in 2011, i.e., ∼26%), all with very characteristic CDR conformations, had emerged in the PDB following the research trend for that period.

The solution to noise data was the efficient exclusion of outliers/singletons from clusters, coupled with the nested architecture of the final clustering result. The efficient exclusion was ensured by the requirement that clusters form a tight core while all cluster objects present an individual positive SW with respect to the global cluster partition. Though it was still possible that few, very small 2- or 3-member clusters failed to form due to the positive SW requirement, the subsequent 2nd- and 3rd-level qualitative clustering, based on Ramachandran Logos, would create a common conformational tag to allow recognition and classification of even such small outlying groups. Daughter-level sub-clusters mainly provide a means to identify all the members of important or subtle conformational variants of the parental theme, and by that fact offer more common examples for the researcher to compare their CDR with. Finally, it remains the individual researcher’s decision as to which CDR conformations are useful, important, or potentially wrong. However when consulting the clustering results of this study, the data is classified in such a way and with no loss of information due to pre-filtering, that the researcher has at their disposal all the necessary information to help them take that decision.

As a means of external validation, it is important to observe the comparison and relation of conformational CDR clusters between this and the major previous studies. As far as the first five CDRs are concerned, in many cases clusters from previous work were found to correspond to level-1 clusters from this study on a one-to-one basis (36/72 compared clusters from North, Lehmann & Dunbrack (2011), 21/49 compared clusters from Martin & Thornton (1996), 8/13 compared clusters from Kuroda et al. (2009)), while in several cases more than one cluster from those external sets was found to correspond to the same level-1 cluster (correspondingly for the aforementioned studies: 25/72 clusters contained in 9 level-1 clusters, 15/49 clusters contained in 7 level-1 clusters, and 5/13 clusters contained in 2 level-1 clusters). This is characteristic of the different clustering strategies adopted in each study, as the external sets imposed discreet similarity thresholds on their cluster definition, but also of the fewer number of structures in their datasets which allowed for a sharper, more specific clustering when the data configuration was favourable. In all those cases, the external clusters are still distinct in the present clustering result, as they almost always correspond to different level-2 clusters from this study. In only two cases (clusters 16A/16C in CDR-L1 from Martin & Thornton (1996), and clusters 1A/1B in CDR-L3 from Kuroda et al. (2009)) were external clusters differentiated only at the 3rd-level, meaning that the full, 3-level conformational logo is required to describe them. Finally, in several cases small 2-, or 3-member external clusters, or mere singletons, were found to correspond to outliers in this study (11/72 in North, Lehmann & Dunbrack (2011), 13/49 in Martin & Thornton (1996)), because of the specific requirements for the existence of a tight core and all positive individual SW, as explained previously. Even so, these small external clusters are still distinct in the present result as their members are regrouped at the 2nd-level of clustering. The additional full population analysis of cluster assignments between this study and previous work showed consistency of membership correspondences, at 98% (262/268) for Martin & Thornton (1996), at 97% (1,534/1,589) for North, Lehmann & Dunbrack (2011) and at 98% (188/192) for Kuroda et al. (2009). Most of the observed discrepancies concerned outlying conformations (6/6, 32/55 and 2/4, correspondingly for the aforementioned works). In comparison, the present clustering analysis revealed 117 level-1 clusters in the first five CDRs, 66 of which have no correspondences and are novel. This is due to the larger dataset and to the lack of data pre-filtering.

In CDR-H3, full population correspondences with North, Lehmann & Dunbrack (2011) were expectedly poor (56%, 171/307). This is explained by the much larger number of clustered structures (2,032 versus 307) and the different strategy employed in level-1 cluster formation, but also to some extent, by the discrepancy of 2 residues in the respective CDR-H3 definitions. Indeed, the inclusion of all available CDR-H3 loops in the present clustering procedure allowed an even clearer appreciation of their pronounced conformational hypervariability: 25 H3 lengths, 213 clusters, most of which are in fact singletons that technically acquired the status of a ‘cluster’, because they were represented by more than one structure in the initial dataset. In fact, only 53/213 clusters were populated by more than 1 unique CDR sequence while a revealing total of another 412/2,032 structures were left as outliers/singletons. In this landscape of variability in conformation, sequence and length, the adopted level-1 clustering methodology doesn’t expand a cluster’s radius towards closely-related conformations, but instead restricts that radius appropriately, excluding structures that both fail to form a well-separated core and do not clearly belong to one cluster rather than another. However, these outlying structures are still further classified based on their Ramachandran logos, whenever possible (i.e., at level-2 and -3 of the classification scheme).

All these observations are suggestive of the advantages brought by the multi-level clustering structure, as nearly all identified external clusters are distinct at the 2nd-level of our clustering (mainly in the first five CDRs), with the 1st-level expanding towards closely-related conformational variants when possible, while efficiently excluding outliers. 3rd-level clusters procure even deeper specificity when required. It becomes apparent that the trade-off between conformational specificity and sensitivity is locked in the clusters of previous studies based on the existence of a strict, but subjective, formation threshold. In contrast, the present clustering result produced a more adaptable framework, where the sensitivity and specificity of conformational similarity are more intuitively distributed in its three different levels. As an example of the conformational variability between level-1 clusters in this study and North, Lehmann & Dunbrack (2011), a comparative view of all detected clusters in CDR-H1 13-residues (displaying a rich cluster repertoire) superposed on those from North, Lehmann & Dunbrack (2011) where applicable, is presented in Fig. 7.

The description and commenting of each CDR/length combination obtained in this study may be of small value at this point, firstly due to the massive volume of the data involved, but mainly because the detailed examination of each cluster could warrant a separate, dedicated study in its own right (something that the present study aims to assist and encourage). Nonetheless, it is interesting to observe that in almost all CDR/length combinations with substantial content in unique CDR sequences (i.e., more than 10 unique sequences) there is usually a single cluster which regroups the large majority of the available known conformations, while the remaining fraction may be populating a considerable number of much smaller clusters. In the 15 lengths (first 5 CDRs) that contained more than 10 unique sequences in their clustered population and produced more than one cluster, the major cluster of each length represented on average 74% of the available unique sequences (median: 86%). The case of H2/10-residues is the one exception with two well-populated clusters (H2-10-I and -II) with an approximate 1:2.5 ratio in non-redundant members. L3/10-residues are the only other exception where no major cluster is observed despite the considerable amount of available unique sequences.

Given the considerable volume of structural data included in the work, the above fact could be suggesting that in contrast to the original observation that CDRs adopt one of a limited number of possible conformations in L1, L2, L3, H1 and H2, in fact three out of four CDR sequences seem to result in variants of the prominent conformation for that CDR length. To take this matter even further and based on the respective median, it can also be inferred that in half the well-populated CDR lengths, a variant of the prominent conformational theme is adopted by close to nine out of ten CDR sequences. Furthermore, the animal sources of CDR members of these major clusters are sufficiently varied to suggest that the respective conformations are ubiquitously maintained. These observations combined highlight the importance of subtle conformational variations in antigen recognition and, therefore, of the detailed repertoire provided at levels 2 and 3 of the present clustering analysis (e.g., by rogue analysis at the daughter cluster level). In contrast, the hypervariable (in length, sequence and conformation) CDR-H3 appears as the loop that consistently confers the most pronounced layer of conformational variation in the antibody binding interface.

It is known from experience with humanised antibodies (Saldanha, 2009) that the conservation of residues which maintain the conformation of the CDR in the designed sequence often leads to binding versions and viceversa. Further investigation of the clusters, particularly at levels 2 and 3, for these residues will enhance the modelling and design of humanised sequences by recognition, within the variants, of subtle differences to the main conformational theme.


Immunoglobulin diversity

Virtually all microbes can trigger an antibody response. Successful recognition and eradication of many different types of microbes requires diversity among antibodies their amino acid composition varies allowing them to interact with many different antigens. [21] It has been estimated that humans generate about 10 billion different antibodies, each capable of binding a distinct epitope of an antigen. [22] Although a huge repertoire of different antibodies is generated in a single individual, the number of genes available to make these proteins is limited. Several complex genetic mechanisms have evolved that allow vertebrate B cells to generate a diverse pool of antibodies from a relatively small number of antibody genes. [23]

V(D)J recombination

Somatic recombination of immunoglobulins, also known as V(D)J recombination, involves the generation of a unique immunoglobulin variable region. The variable region of each immunoglobulin heavy or light chain is encoded in several pieces - known as gene segments. These segments are called variable (V), diversity (D) and joining (J) segments. [23] V, D and J segments are found in Ig heavy chains, but only V and J segments are found in Ig light chains. Multiple copies of the V, D and J gene segments exist, and are tandemly arranged in the genomes of mammals. In the bone marrow, each developing B cell will assemble an immunoglobulin variable region by randomly selecting and combining one V, one D and one J gene segment (or one V and one J segment in the light chain). As there are multiple copies of each type of gene segment, and different combinations of gene segments can be used to generate each immunoglobulin variable region, this process generates a huge number of antibodies, each with different paratopes, and thus different antigen specificities. [2]

After a B cell produces a functional immunoglobulin gene during V(D)J recombination, it cannot express any other variable region (a process known as allelic exclusion) thus each B cell can produce antibodies containing only one kind of variable chain. [24] [3]

Somatic hypermutation and affinity maturation

Another mechanism that generates antibody diversity occurs in the mature B cell. Following activation with antigen, B cells begin to proliferate rapidly. In these rapidly dividing cells, the genes encoding the variable domains of the heavy and light chains undergo a high rate of point mutation, by a process called somatic hypermutation (SHM). SHM results in approximately one nucleotide change per variable gene, per cell division. [5] As a consequence, any daughter B cells will acquire slight amino acid differences in the variable domains of their antibody chains.

Somatic hypermutation serves to increase the diversity of the antibody pool and impacts the antibody’s antigen-binding affinity. [25] Some point mutations will result in the production of antibodies that have a weaker interaction (low affinity) with their antigen than the original antibody, and some mutations will generate antibodies with a stronger interaction (high affinity). [26] B cells that express high affinity antibodies on their surface will receive a strong survival signal during interactions with other cells, whereas those with low affinity antibodies will not, and will die by apoptosis. [26] Thus, B cells expressing higher affinity antibodies for will outcompete those with weaker affinities for function and survival. The process of generating antibodies with increased binding affinities is called affinity maturation. Affinity maturation occurs in mature B cells after V(D)J recombination, and is dependent on help from helper T cells. [27]

Class switching

Isotype or class switching is a biological process occurring after activation of the B cell, which allows the cell to produce different classes of antibody (IgA, IgE, or IgG). [2] The different classes of antibody, and thus effector functions, are defined by the constant (C) regions of the immunoglobulin heavy chain. Initially, naïve B cells express only cell-surface IgM and IgD with identical antigen binding regions. Each isotype is adapted for a distinct function, therefore, after activation, an antibody with a IgG, IgA, or IgE effector function might be required to effectively eliminate an antigen. Class switching allows different daughter cells from the same activated B cell to produce antibodies of different isotypes. Only the constant region of the antibody heavy chain changes during class switching the variable regions, and therefore antigen specificity, remain unchanged. Thus the progeny of a single B cell can produce antibodies, all specific for the same antigen, but with the ability to produce the effector function appropriate for each antigenic challenge. Class switching is triggered by cytokines the isotype generated depends on which cytokines are present in the B cell environment. [28]

Class switching occurs in the heavy chain gene locus by a mechanism called class switch recombination (CSR). This mechanism relies on conserved nucleotide motifs, called switch (S) regions, found in DNA upstream of each constant region gene (except in the δ-chain). The DNA strand is broken by the activity of a series of enzymes at two selected S-regions. [29] [30] The variable domain exon is rejoined through a process called non-homologous end joining (NHEJ) to the desired constant region (γ, α or ε). This process results in an immunoglobulin gene that encodes an antibody of a different isotype. [31]


Physicochemical fractionation antibody purification

The main classes of serum immunoglobulins (e.g., IgG, IgM) share the same general structure, including overall amino acid composition and solubility characteristics. These general properties are sufficiently different from most other abundant proteins in serum, such as albumin and transferrin, that the immunoglobulins can be selected and enriched on the basis of these differentiating physicochemical properties.

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Size exclusion chromatography

Dialysis, desalting and diafiltration can be used to exchange antibodies into particular buffers and remove undesired low-molecular weight (MW) components. Dialysis membranes, size-exclusion resins, and diafiltration devices that feature high-molecular weight cut-offs (MWCO) can be used to separate immunoglobulins (>140kDa) from small proteins and peptides. However, except with specialized columns and equipment, these techniques alone cannot purify antibodies from other proteins and macromolecules that are present in typical antibody samples. More commonly, gel filtration and dialysis are used following other purification steps, such as ammonium sulfate precipitation (1).

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Ammonium sulfate precipitation

Ammonium sulfate precipitation is frequently used to enrich and concentrate antibodies from serum, ascites fluid or cell culture supernatant. As the concentration of this lyotropic salt is increased in a sample, proteins and other macromolecules become progressively less soluble until they precipitate the lyotropic effect is called "salting out." Antibodies precipitate at lower concentrations of ammonium sulfate than most other proteins and components of serum.

At 40 to 50% ammonium sulfate saturation (100% saturation equals 4.32M), immunoglobulins will precipitate while other proteins remain in solution (2).The usual method involves very slowly adding an equal volume of saturated ammonium sulfate solution to a neutralized antibody sample, followed by incubation for several hours at room temperature or 4°C. After centrifugation and removal of the supernatant, the antibody-pellet is dissolved in buffer, such as phosphate-buffered saline (PBS).

The selectivity, yield, purity and reproducibility of precipitation depends upon several factors, including time, temperature, pH and rate of salt addition (3). Ammonium sulfate precipitation provides sufficient purification for some antibody applications, but most often it is performed as a preliminary step before column chromatography or other purification method (e.g., Melon Gel Monoclonal IgG Purification Kit). Using partially-purified antibody samples can improve the performance and extend the life of affinity columns.

Other antibody precipitation reagents that have been used for special antibody purification situations include using octonoic acid, polyethylene glycol and ethacridine (3).

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Ion exchange chromatography

Numerous chemically-based, solid-phase chromatography methods have been adapted and optimized to achieve antibody purification in particular situations.

Ion exchange chromatography (IEC) uses positively or negatively charged resins to bind proteins based on their net charges in a given buffer system (pH). Especially in commercial operations involving production of monoclonal antibodies, conditions for IEC can be determined that bind and release the target antibody with a high degree of specificity. Conversely, conditions can be found that bind nearly all other sample components except antibodies. Once so optimized, IEC is a cost-effective, gentle and reliable method for antibody purification.

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Immobilized metal chelate chromatography

Immobilized metal chelate chromatography (IMAC) uses chelate-immobilized divalent metal ions (usually nickel, Ni2+) to bind proteins or peptides that contain clusters of three or more consecutive histidine residues. The strategy is most often used to purify recombinant proteins that have been engineered to contain a terminal 6xHis fusion tag. Interestingly, mammalian IgGs are one of the few abundant proteins in serum (or monoclonal hybridoma cell culture supernatant) that possess histidine clusters capable of being bound by immobilized nickel. As with IEC, IMAC conditions for binding and elution can be optimized for particular samples to provide gentle and reliable antibody purification (3). For example, the Pierce Conjugate Purification Kit uses this technique to separate AP- or HRP-labeled (enzyme-conjugated) antibody from excess, non-conjugated enzyme following a labeling procedure.

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Thiophilic adsorption

Thiophilic adsorption is a highly selective type of protein-ligand interaction that combines the properties of hydrophobic interaction chromatography (HIC) and ammonium sulfate precipitation (the lyotropic effect). The interaction is termed thiophilic because it involves the binding of proteins to a sulfone group in close proximity to a thioether. In contrast to strict HIC, thiophilic adsorption depends upon a high concentration of lyotropic salt (e.g., potassium sulfate as opposed to sodium chloride). With typical antibody samples that have been equilibrated with potassium sulfate, binding is quite specific to antibodies. After non-bound components are washed away, the antibodies are easily recovered with gentle elution conditions (e.g., 50mM sodium phosphate buffer, pH 7 to 8). Thiophilic Adsorbent (also called T-Gel) is 6% beaded agarose modified to contain the sulfone-thioether ligand. The adsorbent has a high binding capacity and broad specificity toward imunoglobulins from various animal species. Notably, it is one of few affinity methods that is effective for chicken IgY purification.

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Melon Gel chromatography

Melon Gel is a proprietary resin chemistry (and optimized buffer system) for purifying antibodies by chemical-based fractionation. In the specified mild buffer condition, Melon Gel resin binds most non-IgG proteins found in serum, ascites fluid and culture supernatants, while allowing purified IgG to be collected in the flow-through fraction.

The various Melon Gel kits are optimized for rapid, convenient and gentle purification of IgG. The Melon Gel kit for purification of monoclonal antibodies illustrates the benefits of combining two purification techniques. Ammonium sulfate precipitation is recommended for cell culture supernatant samples before performing the final Melon Gel purification. Treatment of ascites fluid samples with a conditioning reagent is recommended before Melon Gel purification to decrease the co-purification of transferrin with the antibody.

Because the Melon Gel system uses negative selection and requires no elution steps, it also provides a convenient and effective method for removing bovine serum albumin (BSA) or gelatin from antibody stock solutions so that these stabilizing proteins will not interfere with antibody labeling procedures. This is the basis of our Antibody Clean-Up Kit.

If the specific removal of one particular undesirable serum component can be considered a form of antibody purification, then it is appropriate here to mention albumin removal. Albumin accounts for approx. 60% of human serum protein. Cibacron* Blue Dye binds selectively to human serum albumin and can be used as an affinity ligand to prepare albumin-free serum samples for 2D electrophoretic analysis.

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MATERIALES Y MÉTODOS

The methods for determining which protein sequences in the PDB contain antibody VH and VL domains and for assigning IMGT V-region germlines to these sequences are described in the Supplemental Methods.

Determining antibody CDR cluster

For each PDB structure with an identified antibody VH or VL domain, we determine the CDR sequences and their lengths, which represents the first level of our classification system (e.g. L1-11, L2-8, etc.). For CDRs with complete backbone coordinates, we calculate the ω, ϕ and ψ dihedral angles of the residues in each CDR with in-house scripts.

The next level of classification is by the cistrans pattern of the residues in the loop. Some CDR–length combinations commonly have cis-proline residues (e.g. L3-9 at position 7) while a surprising number of CDRs have cis-non-proline residues, probably due to low resolution and poor refinement of the structures (see the Results section). If the length was new (13 cases) or the cistrans pattern was new (53 new cases), we labeled the loop with a generic cluster identifier (e.g. L3-5-* for CDR L3 of length 5 which did not appear in the curated 2011 data set or L1-11-cis4-* for CDR L1 length 11 with a cis-residue at position 4). None of these clusters had more than seven non-redundant sequences (H2-11-*), and 47 of 66 (71%) had only one sequence. In the 2011 analysis, we excluded CDRs with cis-non-proline residues. The current database covers all antibody structures without a priorifiltering.

Databases and web site

The internal and ‘downloadable’ databases for PyIgClassify are SQlite (http://www.sqlite.org) relational databases due to its support and straightforward integration in a variety of computational languages and molecular modeling suites including R, Python, C++, BioPython and Rosetta (https://www.rosettacommons.org). Tab-delimited text versions of each database are also available. Each database contains at least four tables: cdr_data, SpeciesNames, GermlineAssignments and CdrClusterSum. The cdr_data table holds various pieces of information about the cluster, sequence, structure and germline for each CDR and framework of each identified antibody structure. The SpeciesNames table lists the species and their short names used in the databases and web site, while the GermlineAssignments table has the germline assignments for both CDRs and frameworks by comparing each antibody sequence to the IMGT (http://www.imgt.org/) germline sequences.

Databases are updated monthly to reflect the current state of the PDB. In addition, all antibodies identified are renumbered in the Honegger–Plückthun Numbering Scheme ( 29) and can be downloaded from the website.


Servicios

Humanized antibody mainly refers to the re-expressed mouse monoclonal antibody modified by gene cloning and DNA recombination technology. Most of its amino acid sequence is replaced by human sequence, which basically retains the affinity and specificity of the parent mouse monoclonal antibody, but reduces Because of its heterogeneity, it can be applied to the human body. Humanized antibody means that the constant region of the antibody (ie, CH and CL regions) or all of the antibody is encoded by human antibody genes. Humanized antibodies can greatly reduce the immune side effects caused by heterologous antibodies to the human body. Humanized antibodies include chimeric antibodies, modified antibodies and fully humanized antibodies.

Figure 1. Antibody humanization.

Our method

The current general computational antibody design method starts with the modeling of antibodies and antibody-antigen complexes. We select antibody sequences for antigen binding experiments, for example, bind to soluble antigens or antigens expressed by cells, and further optimize conjugates through affinity maturation methods. However, this method usually requires modeling the entire structure, which requires a lot of calculations and takes a long time. Therefore, MedAI proposes an antibody design based on the CDR of the specific binding site of the antibody and the antigen. This method simplifies the calculation and design of antibodies, simplifies the modeling and design of antibody CDRs, and greatly reduces the calculation requirements.

Overall solutions

MedAI uses computer-aided structural simulation design to humanize mouse monoclonal antibodies and rabbit monoclonal antibodies.

Antibody sequence annotation: annotation of antibody heavy and light chain variable regions, constant regions and CDR regions, recognition of antibody germline genes.

Antibody sequence analysis: predict antibody post-translational modification sites (such as glycosylation sites, etc.) and predict antigen linear epitopes.

Antibody structure prediction and optimization: predict the structure of full-length antibodies, antibody Fab regions, and scFv.

Humanized antibody design, immunogenicity prediction.

Antibody-antigen interaction prediction: Identify the conformational epitope of the antigen and determine the hapten connection site.

Design and modification of antibody molecules: antibody affinity maturation, antibody stability optimization, bispecific antibody design, antibody aggregation effect analysis.

Services items

  • Project experience: A number of antibody humanization projects have been completed, and a number of modified antibodies have been delivered to customers.
  • Humanization of antibodies from multiple species: including dogs, monkeys, mice, camels, alpacas, chickens, etc.
  • Using the means of bioinformatics and structural biology, computer-aided design of antibody modification.
  • The degree of humanization is relatively high. After the transformation, after the affinity maturation process, the affinity can reach nM and pM levels.

MedAI's antibody humanization service can reduce the cost of subsequent experiments. Antibody humanization service is a personalized and customized innovative scientific research service. Before determining the corresponding analysis plan and price, each project needs to be evaluated. If you want to know more about service prices or technical details, please feel free to contact us. If you want to know more about service prices or technical details, please feel free to contact us.


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