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Midiendo la densidad de los antígenos de superficie

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Estoy tratando de tener una idea de la variedad de métodos que se utilizan para determinar la cantidad de antígenos y receptores de la superficie celular. Esto es notablemente diferente de determinar la afinidad de estos marcadores de superficie.


¿Quiere contar el número de antígenos y receptores en células vivas?

Posibles formas:

  1. FRET (poco probable que funcione)
  2. Imágenes de receptores con resolución de una sola molécula.
  3. Western blot para estimar aproximadamente la cantidad de receptores
  4. técnicas de proteómica unicelular (no muy adecuadas)

Universidad Roy J. Carver de Illinois Centro de biotecnología

La citometría de flujo cuantitativa (QCFM) se puede utilizar para analizar grandes cantidades de células en busca de múltiples antígenos y para cuantificar el número de sitios de unión por célula. La función lineal representa la relación entre la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las células que se marcaron con un fluorocromo unido a un ligando o anticuerpo monoclonal (mAb) y el número medio de receptores / células o el número medio de sitios de unión del mAb / célula. Se utilizan perlas calibradas especiales para generar una curva estándar que convierte MFI en equivalentes moleculares de fluorocromo soluble (MESF) uniendo una cantidad cuantificable de anticuerpo (capacidad de unión de anticuerpos - ABC). El siguiente ejemplo muestra la cuantificación de EGFR antihumano en la superficie celular de la línea celular de carcinoma escamoso humano SQCCY1 con DAKO QIFFIT® - imagen obtenida de U.T.M.D. Anderson Cancer Center Science Park - sitio web de la División de Investigación. Las diferentes poblaciones de perlas mostradas en la imagen se unen a cantidades calibradas de anticuerpo CD5-FITC. Este kit mide la inmunofluorescencia indirectamente.

Puede utilizar series de cinco poblaciones de microesferas fluorescentes etiquetadas con cantidades variables de FITC u otros fluoróforos conocidos como Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 647, APC, Cy ™ 5, PE-Cy ™ 5, R-PE para medir los niveles de expresión de células. La intensidad de la fluorescencia se cuantifica mediante la comparación directa de las mediciones de fluorescencia de los fluorocromos puros con las de las microesferas marcadas en la superficie con el mismo fluorocromo.

Se proporciona un programa de análisis GRATUITO (QuickCal® v.2.3) con cada kit para ayudarlo a determinar los niveles de expresión de las células y también para evaluar la linealidad del instrumento y el umbral de detección. El programa de análisis se puede obtener AQUÍ y utilizar ingresando el Número de acceso que se le proporcionó con sus estándares.

Enlaces e información útil

Todo el trabajo realizado por el Centro de Biotecnología Roy J. Carver (CBC) debe ser reconocido en publicaciones académicas, carteles y presentaciones. El reconocimiento adecuado nos permite medir el impacto de nuestro trabajo y respalda nuestras iniciativas para obtener fondos patrocinados. Además, cualquier personal de CBC que haga una contribución intelectual o experimental sustancial merece un mayor reconocimiento como coautor.


Abstracto

La adsorción interfacial de un anticuerpo monoclonal de ratón (tipo IgG1, anti-β-hCG) en la interfaz hidrófila de óxido de silicio / agua se ha estudiado mediante elipsometría espectroscópica y reflexión de neutrones, seguida de la evaluación de la unión de un antígeno hormonal, la gonadotropina coriónica humana (hCG). ), sobre las moléculas de anticuerpo adsorbidas. La cantidad de adsorción alcanzó un máximo alrededor del pH isoeléctrico (IP) de 6 para el anticuerpo, este patrón dependiente del pH podría alterarse aumentando la concentración de sal, una tendencia también observada para otras proteínas. La reflexión de neutrones reveló la formación de una capa uniforme de 40 Å a partir del anticuerpo adsorbido, lo que indica una orientación plana. La subsiguiente unión de hCG mostró que la proporción molar de hCG unida al anticuerpo en la interfaz era tan alta como 0,7 con una cobertura de superficie baja del anticuerpo y disminuía al aumentar la concentración de anticuerpo en la superficie. Los resultados apuntan a un grado creciente de impedimento estérico para el acceso de hCG con el aumento de la densidad de empaquetamiento de las moléculas de anticuerpo en la superficie. La comparación con estudios de estructura cristalina publicados anteriormente sugiere una torsión de la región variable para permitir el acceso del antígeno. También se encontró que la unión de hCG dependía del pH con su máximo alrededor del IP, si la fuerza iónica de la solución era baja (20 mM). Sin embargo, si la fuerza iónica se incrementó a 200 mM, entonces la unión de hCG se vio influenciada por una combinación de impedimento estérico e interacción electrostática entre el antígeno y la superficie. Estos resultados son muy relevantes para la mejora del rendimiento de biotecnologías como las almohadillas de prueba de fertilidad y los biosensores basados ​​en la inmovilización de anticuerpos.

Autor a quien debe dirigirse la correspondencia. Teléfono: 44-161-2003926. Correo electrónico [email & # 160protected]


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Discusión

En este estudio, hemos descrito un receptor de antígeno diseñado que proporciona control óptico sobre la señalización intracelular en células T mientras se conjuga con células presentadoras de antígeno. Hemos utilizado esta nueva herramienta para interrogar directamente la capacidad de la red intracelular para la integración de la señal del receptor de antígeno mediante la cuantificación de la persistencia de estímulos en varios puntos dentro de esta red. El principal hallazgo de este trabajo es que en todas las partes de la red de señalización intracelular probada, la interrupción de la señalización del receptor de antígeno provocó que esencialmente toda la información residual dentro de la red se disipara en 10-15 min. Esto refuerza la opinión de que la señalización proximal del TCR, y probablemente muchos otros receptores de células inmunitarias, debe mantenerse durante muchas horas para impulsar una activación eficiente, como se sugirió anteriormente (Huppa et al, 2003), y probablemente requiera la presencia de señales coestimuladoras (Trendel et al, 2019). Sin embargo, pudimos observar directamente la persistencia de esta señal bioquímica dentro de la red a nivel de expresión génica utilizando trenes pulsátiles de señalización. También demostramos que se requiere una señalización proximal sostenida para mantener los factores de transcripción en un estado activo y, por lo tanto, la expresión génica continua, siendo la desintegración del ARNm el intermedio de señalización de mayor duración que tiene vidas medias aproximadas de entre 15 y 30 minutos para las transcripciones medidas. aquí. Luego demostramos que esta persistencia de señal limitada podría explotarse para aumentar la producción efectiva de las células T cuando se estimulan con un CAR anti-CD19 clínicamente relevante a través de la señalización pulsátil.

Nuestros resultados implican que las células T solo pueden integrar directamente señales de TCR a través de múltiples interacciones APC dentro de una ventana temporal corta. Como se señaló anteriormente, el intervalo entre las interacciones secuenciales de células T / APC puede ser de 1,5 a 2 h (Gunzer et al, 2000), que es incompatible incluso en las escalas de tiempo que hemos medido para la persistencia del ARNm. Sin embargo, existe buena evidencia de que las células T acumulan el resultado de la expresión génica en múltiples interacciones (Faroudi et al, 2003 Munitic et al, 2005 Clark et al, 2011), lo que sugiere que debe existir un umbral de expresión de proteínas más allá del cual se produce la especificación de la función de las células T. Al valorar la magnitud de la intensidad de la señal que emana del OptoCAR utilizando iluminación graduada, pudimos demostrar que se requiere un nivel mínimo de señalización para impulsar la salida descendente de manera digital, de acuerdo con esto. El estudio de Bousso y colegas (Clark et al, 2011) sugirieron que la acumulación de FOS activado era un mecanismo potencial para integrar múltiples eventos de señalización de células T, donde encontraron que el fosfo-FOS T325 aumentaba incluso cuando la señalización del receptor se interrumpe. Sin embargo, este resultado no concuerda con la rápida pérdida de esta modificación cuando se inhibe la actividad de ERK (Murphy et al, 2002), de acuerdo con nuestro hallazgo de que la actividad de FOS se pierde rápidamente al cesar la señalización (Fig. 4F). Esta discrepancia puede residir en cómo se detectó el FOS activado o en el uso de perlas recubiertas de anticuerpos para activar las células T. Una limitación de nuestro enfoque OptoCAR, y para los CAR en general, es que puede haber algunas otras interacciones proteicas gobernadas por las cadenas CD3 accesorias que no están presentes en estos receptores quiméricos que podrían ayudar a mantener la señalización incluso cuando se disocian del ligando.

Hubo una clara correlación entre la distancia del intermedio de la red desde el receptor de activación y la velocidad disminuida a la que se disiparon las señales al interrumpir la señalización, en parte explicable por la transición de reacciones de quinasa basadas en Tyr a Ser / Thr. Esto sugiere que la duración de la señalización podría estar codificada por la persistencia de la señal diferencial dentro de la red, siendo la expresión de proteínas el único estado que puede persistir en la escala de tiempo de una hora. Dado que muchas redes de señalización se construyen a partir de pasos secuenciales, una mejor "memoria" de la activación del receptor quedaría impresa cuando se estimulan pasos más distales. Esto también tendría el efecto de filtrar más pulsos de señalización espurios, que serían incapaces de superar de manera eficiente varios pasos y, por lo tanto, se disiparían de manera más eficiente (Altan-Bonnet y Germain, 2005). Un corolario importante de estas conclusiones es que, al menos para las que hemos investigado, las reacciones opuestas dentro de la red de señalización que buscan restablecer el nivel basal de señalización deben ser eficientes y potentes, requiriendo un flujo de señalización continuo para superarlas. .

Estudios anteriores han investigado cómo la inhibición transitoria de la señalización de TCR afecta el nivel de flujo de Ca 2+ y la velocidad de su disminución en la interrupción de la señal (Valitutti et al, 1995 Varma et al, 2006 Yousefi et al, 2019). Estos informes encontraron una fuerte dependencia de la señalización de TCR proximal para mantener el nivel aumentado de iones Ca 2+ de acuerdo con nuestros hallazgos. Sin embargo, medimos una disminución mucho más rápida en esta lectura (Fig. 2L), que atribuimos a que la forma en que interrumpimos la señalización del receptor es más directa y eficiente. La rápida disminución de ERK fosforilada en la interrupción de la señalización que observamos (Fig 3E) también se ha encontrado en otro estudio optogenético reciente en células NIH3T3 (Bugaj et al, 2018), lo que sugiere que es probable que los resultados que hemos encontrado sean aplicables de manera más general más allá de la señalización de células T. Nuestro hallazgo de que el estado activo del factor de transcripción FOS, como ERK, requería una señalización proximal continua implica que solo su salida descendente de expresión génica aumentada puede constituir un estado persistente significativo de señalización previa para estos TF. Sin embargo, no implicamos que no puedan existir otros estados persistentes, como la migración o la actividad citotóxica a través de otros mecanismos. Esto significa que la codificación de la dinámica de señalización a través de TF también debería estar en este nivel, y estudios previos han proporcionado evidencia de este resultado (Murphy et al, 2002 Locasale, 2007 Clark et al, 2011 Marangoni et al, 2013 ).

Se han realizado varios otros estudios que emplean optogenética para investigar cómo la dinámica de señalización influye en la activación celular descendente, lo que ha llevado a algunos resultados nuevos e interesantes (Toettcher et al, 2013 Graziano et al, 2017 Wilson et al, 2017 Bugaj et al, 2018). Estos estudios invariablemente utilizaron la translocación mediada por luz de una enzima constitutivamente activa a la membrana plasmática como medio para controlar la señalización aguas abajo. Si bien es muy eficaz, este enfoque "cortocircuita" la señalización del receptor aguas arriba, evitando potencialmente partes clave de la red y eliminando cualquier información espacio-temporal que pueda estar codificada en la activación fisiológica del receptor dentro de los conjugados celulares. En nuestro enfoque, la luz controla el inicio mismo de la transducción de la señal del receptor sin alterar la arquitectura de la red, y la activación del receptor ocurre dentro del contexto fisiológico de una interfaz conjugada de células T / células presentadoras. Creemos que este enfoque proporciona el control más realista sobre la activación del receptor, sin interrumpir la señalización de otros receptores de la superficie celular que podrían modular la entrada de TCR, como la coestimulación a través de la participación de CD28. También hemos investigado los componentes de señalización endógenos en lugar de los sensores de proteínas de sobreexpresión, que deberían informar con mayor fidelidad la dinámica de la red.

El OptoCAR que hemos desarrollado en este trabajo contiene tres motivos de señalización ITAM. Si bien es capaz de iniciar una señalización descendente muy eficiente, no se puede esperar que reproduzca completamente todos los aspectos del complejo TCR completo. Anteriormente hemos demostrado que el par ortogonal receptor / ligando utilizado en OptoCAR puede impulsar la segregación equivalente de la fosfatasa CD45 que se cree que inicia la señalización del receptor como se observa para el TCR (James & Vale, 2012) y también impulsa la señalización descendente (James, 2018). También hemos demostrado que el mayor número de ITAM presentes en el TCR le permite ser altamente eficiente en la transducción de la unión del ligando en una señal incluso con una baja ocupación del receptor (James, 2018). Sin embargo, para todos los experimentos realizados en este trabajo, hemos trabajado en un régimen de alta ocupación saturando con el dimerizador, por lo que esperamos que el OptoCAR, al igual que las construcciones CAR similares, proporcione un estímulo ampliamente equivalente al esperado del propio TCR.

Hemos utilizado la línea celular Jurkat para la mayoría de nuestros ensayos, que es un modelo muy utilizado para estudios de células T (Abraham & Weiss, 2004) pero no puede replicar por completo las funciones de las células T CD4 + primarias (Bartelt et al, 2009). Sin embargo, la mutación conocida en las células Jurkat en la señalización de PI3K debido a la inactivación de PTEN (Shan et al, 2000) no se esperaría que tuvieran ningún efecto directo sobre la dinámica de las vías de señalización investigadas en este estudio. Por lo tanto, confiamos en que es probable que las conclusiones que hemos extraído de nuestros conjuntos de datos se generalicen a otras redes de señalización de receptores que dependen de las mismas vías de transducción.

En resumen, hemos desarrollado un receptor de antígeno ópticamente controlable para cuantificar la ventana temporal sobre la que las células T pueden integrar señales de TCR entre interacciones APC sucesivas y reforzar la opinión de que se requiere una señalización proximal sostenida para una activación celular potente.


Herramientas para mejorar el diseño de su panel: determinación de la densidad de antígeno

Cuando un investigador opta por utilizar la citometría de flujo para responder a una pregunta científica, primero debe construir un panel policromático que aproveche el poder de la tecnología y el diseño experimental.

Cuando nos preparamos para utilizar la citometría de flujo para responder una pregunta científica, tenemos que diseñar un panel policromático que nos permitirá identificar las células de interés, el objetivo de la investigación. Para identificar estas células, necesitamos construir un panel que aproveche el brillo relativo de los fluorocromos, el nivel de expresión de las diferentes proteínas en la célula y el rendimiento del instrumento, entre otras cosas.

En su forma más básica, el objetivo es maximizar la sensibilidad de la medición en las células objetivo. Logramos esto emparejando fluorocromos más brillantes con objetivos expresados ​​más bajos, mientras minimizamos la pérdida de resolución en los canales objetivo.

Uno de los primeros pasos en el proceso es clasificar el nivel de expresión de los objetivos en las células desde los principales marcadores de subconjunto (CD3, CD4, CD19, etc.) hasta los objetivos de nuestra investigación. Para determinar la respuesta a estas preguntas, necesitamos investigar la literatura. Afortunadamente, hay varios recursos disponibles para ayudar con este trabajo.

El primero es el sitio web Benchsci.com. Este sitio web utiliza IA para seleccionar artículos publicados, identificar objetivos, clones, células, ensayos y más. Cuando busca un objetivo determinado, puede ver los datos donde se utilizó, lo que le permite tomar una decisión más informada sobre la utilidad del objetivo. Benchsci.com también presentó una herramienta que aprovecha su IA para ayudar a seleccionar los reactivos para su investigación.

El segundo recurso es una publicación de Kalina y colegas (2019). En este artículo, los autores midieron los niveles de expresión de antígenos CD de 1 a 100 en 47 subconjuntos de células inmunes. Utilizaron anticuerpos marcados con PE para calcular los niveles de expresión. Todos los datos están disponibles en www.hcdm.com. En la Figura 1 se muestran datos de ejemplo que brindan una descripción general de los niveles de expresión.

Figura 1: Patrón de expresión de 29 antígenos CD en la superficie de subconjuntos de células inmunes (en la parte superior). El color indica la intensidad de la expresión, mientras que el tamaño de los círculos representa la frecuencia de la población en el subconjunto dado.

El tercer recurso es un artículo de Amir y colegas (2019). Utilizaron citometría de masas para hacer lo mismo que hicieron Kalina y sus colegas con etiquetas fluorescentes. En este artículo, los autores seleccionaron 350 anticuerpos y utilizaron la plataforma de análisis automatizada Astrolabe. Los datos, que permitirán al investigador explorar sus antígenos diana, están disponibles en este sitio.

Figura 2: Patrón de expresión de diferentes antígenos en varios subconjuntos celulares (horizontal). El color representa la intensidad de la señal y el tamaño del círculo representa el porcentaje de población positiva.

Anteriormente, determinar el nivel de expresión de diferentes antígenos era una combinación de conjeturas y trabajo de detective. Había que leer varias revistas para tener una idea de lo que otros habían publicado, esto solo se volvió más complejo y consumió más tiempo cuando los antígenos comenzaron a tener múltiples clones. Ingrese a la automatización y la inteligencia artificial bajo la apariencia de Benchsci.com. Esta herramienta es un recurso excelente para ayudar a los investigadores a identificar el clon adecuado para su trabajo.

Además, dos grupos utilizaron enfoques diferentes para proporcionar a la comunidad de investigadores las herramientas para determinar la densidad de antígenos en diferentes subconjuntos celulares. Ambos han puesto sus datos a disposición del público para que la comunidad de investigadores pueda aprovechar al máximo estos recursos.

Por lo tanto, el primer paso del diseño del panel ha pasado de ser frustrante y molesto a una simple cuestión de convertir su navegador web en tres sitios para obtener toda la información que necesita. En el próximo blog sobre el diseño de paneles, discutiremos las similitudes y diferencias entre el diseño de paneles para la citometría de flujo fluorescente tradicional y la citometría espectral, con una pizca de citometría de masa en una buena medida.

Tim Bushnell tiene un doctorado en Biología del Instituto Politécnico Rensselaer. Es cofundador de ExCyte, la empresa líder mundial en capacitación en citometría de flujo, y la mente didáctica detrás de esta organización, cuya organización cuenta con una verdadera biblioteca de recursos en el laboratorio sobre secuenciación, microscopía y temas relacionados en las ciencias de la vida.


Discusión

Se ha reconocido desde hace mucho tiempo que el reconocimiento diferencial de antígenos por BCR desempeña un papel clave en dos fases específicas de las respuestas de las células B dependientes de T. La primera es cuando se seleccionan células B en reposo para entrar en la respuesta porque esto requiere que la interacción del BCR con el antígeno extraño exceda un umbral crítico. Posteriormente, las células B somáticamente mutadas generadas dentro de los GC solo se propagan si adquieren una mayor afinidad por el antígeno presentado en los complejos inmunes de las células dendríticas foliculares. Sin embargo, entre estos dos puntos de control, las células B que responden deben decidir si entran en la reacción de GC o se someten a una diferenciación rápida de células plasmáticas en focos proliferativos extrafoliculares. En este estudio, demostramos que esta decisión también está controlada por la naturaleza de la interacción entre el BCR y el antígeno. Por lo tanto, mostramos que solo los clones que responden y que experimentan una fuerte interacción inicial con el antígeno pueden diferenciarse de manera eficiente en células plasmáticas extrafoliculares y contribuir a la rápida respuesta temprana de anticuerpos T-dependiente.

Los estudios realizados aquí requirieron la producción y purificación de cantidades de miligramos de las diversas proteínas HEL recombinantes. Esto se logró usando la expresión de levadura y produjo preparaciones de proteínas que eran & gt95% puras. Sin embargo, existía la posibilidad de que pequeñas cantidades de productos derivados de levaduras con posibles efectos inmunomoduladores pudieran influir en los resultados. Consideramos que esto es muy poco probable por varias razones. En primer lugar, la respuesta observada aquí después del desafío con HEL WT -SRBC es indistinguible de la obtenida cuando el HEL nativo derivado de huevo de gallina se conjuga con SRBC (6). En segundo lugar, las respuestas características obtenidas para cada uno de los mutantes HEL fueron consistentes entre lotes de la misma proteína purificada (datos no publicados). Finalmente, cuando las células B de afinidad alta e intermedia respondieron competitivamente al mismo antígeno en el mismo huésped, se observaron todavía las diferencias previstas en la producción de células plasmáticas (Fig. 7). Juntas, estas observaciones indican que nuestros resultados no se vieron afectados por la presencia de ningún contaminante potencial de levadura.

La existencia de un umbral dependiente de antígeno para la producción temprana de células plasmáticas fue inicialmente evidente en este estudio a partir de la ausencia selectiva de la respuesta extrafolicular cuando SWHEL Las células B fueron desafiadas con baja afinidad (Ka de ∼1,5 × 10 6 M −1) HEL 3X-antígeno SRBC (Figs. 1, 3 y 4). Este resultado contrasta con los hallazgos de estudios previos sobre las respuestas de las células B dependientes de T utilizando el hapteno químico NP conjugado con la proteína transportadora de γ-globulina (CGG) de pollo (NP-CGG). En este sistema, las células B con un rango de afinidades anti-NP iniciales no mostraron una localización diferencial de los focos extrafoliculares frente a los GC tempranos (11, 30, 31). De hecho, las afinidades tan bajas como 10 5 M-1 están representadas por igual tanto en los focos extrafoliculares como en los GC tempranos generados después de la inmunización con NP-CGG (11). Los resultados del sistema anti-NP han llevado a la teoría de que la diferenciación de las células B que responden por las dos vías de respuesta temprana es esencialmente un proceso estocástico que opera independientemente de las diferencias en el reconocimiento de antígenos (11, 32). Este modelo predice que el estallido inicial de producción de anticuerpos por las células plasmáticas extrafoliculares refleja las especificidades de todos los clones de células B reclutados en la respuesta y, por lo tanto, es predominantemente de baja afinidad. Aunque este es de hecho el caso de las respuestas anti-NP (5, 7), el análisis de las respuestas a virus y epítopos de proteínas naturales indica que el estallido inicial de producción de anticuerpos contra el antígeno dependiente de T es a menudo de afinidad relativamente alta (& gt10 7 M - 1 referencias 13-15).

Los requisitos dispares para una alta afinidad antigénica en diferentes respuestas de anticuerpos dependientes de T pueden conciliarse reconociendo que es la fuerza de la interacción entre el antígeno y BCR lo que es crucial para regular este proceso, más que la afinidad antigénica per se. Esta noción se confirmó en el presente estudio al mostrar que SWHEL Las células B podrían producir respuestas rápidas de células plasmáticas y anticuerpos al antígeno HEL 3X -SRBC de baja afinidad cuando se incrementa la densidad de HEL 3X en la superficie de SRBC (Fig. 6). Por lo tanto, la presencia de clones de baja afinidad en la respuesta de foco extrafolicular a NP-CGG se explica fácilmente por la alta densidad de epítopos en este antígeno proteico haptenado, que típicamente lleva 16 grupos NP por monómero CGG (31). Nuestros resultados sugieren, por lo tanto, que las células B que reconocen epítopos de baja afinidad aún pueden interactuar de manera suficientemente fuerte con el antígeno para entrar en la respuesta de foco extrafolicular, pero solo si el epítopo está presente en una densidad relativamente alta.

Cuando la densidad del epítopo se mantiene constante, es evidente que una reducción de 50 veces en la afinidad del antígeno (es decir, HEL 2X -SRBC a HEL 3X -SRBC) puede eliminar la respuesta extrafolicular de células plasmáticas montada por SWHEL Células B (Figs. 3-5, 4 5). Los cambios cuantitativos más pequeños en la fuerza de la interacción entre el antígeno y el BCR, ya sea disminuyendo la densidad de HEL 2X o aumentando la densidad de HEL 3X en la superficie del SRBC, tuvieron efectos significativos pero menos absolutos sobre la respuesta temprana de las células plasmáticas (Fig.6 ). Del mismo modo, SWHEL (H) Las células B que se unían a HEL WT con afinidad intermedia eran capaces de provocar una respuesta de células plasmáticas reducida pero aún claramente evidente en el día 5 (Fig. 7). En conjunto, estos resultados demuestran que no existe un umbral definido de interacción entre el antígeno y la BCR que determine si se producirá o no una diferenciación temprana de las células plasmáticas. Más bien, dentro de un cierto rango de fuerzas de interacción, el tamaño relativo de la respuesta temprana de las células plasmáticas está directamente relacionado con la fuerza de esa interacción antigénica inicial.

Es difícil evaluar si se requiere universalmente una fuerte interacción entre BCR y antígeno para la formación de focos extrafoliculares sin estudiar esta cuestión directamente utilizando otros antígenos modelo. La afinidad relativamente alta de la respuesta temprana de anticuerpos a varios antígenos dependientes de T (13-15) es ciertamente consistente con la regulación dependiente de BCR de la producción de células plasmáticas extrafoliculares que también ocurre en estos casos. No obstante, es posible que el adyuvante u otros factores modificadores alteren la cantidad o calidad de las señales independientes de BCR entregadas a las células B que responden por las células T y / o las células dendríticas y que estas, a su vez, puedan anular los controles dependientes de BCR descritos en la publicación actual. estudio. Será interesante probar esta posibilidad en el futuro desafiando SWHEL Células B con las diferentes proteínas HEL mutantes en formas inmunogénicas alternativas.

A diferencia de los antígenos dependientes de T, los antígenos de tipo 2 independientes de T (TI-2) como NP-Ficoll generan típicamente una respuesta extrafolicular únicamente. Se pueden generar GC abortivos, pero solo si la dosis de antígeno y la frecuencia de precursores son suficientemente altas (33). Este sesgo de las respuestas de TI-2 hacia la formación de focos extrafoliculares también es evidente en el SWHEL sistema. Por lo tanto, cuando 10 4 HEL-binding SWHEL Las células B se estimulan con HEL WT -Ficoll, se generan células plasmáticas extrafoliculares de vida corta pero no GC (datos no publicados). Si las observaciones de las respuestas dependientes de T en el estudio actual también se pueden aplicar a las respuestas de TI-2, es posible atribuir la capacidad de los antígenos de TI-2 para provocar una fuerte respuesta de foco extrafolicular al hecho de que estos antígenos son típicamente altamente entrecruzamiento (34, 35) y, por lo tanto, es probable que interactúe fuertemente con el BCR. En este caso, el hecho de que los antígenos TI-2 no generen GC de manera eficiente probablemente refleje la importancia de la ayuda de las células T para potenciar la formación de GC. Alternativamente, la fuerza de la participación de BCR puede afectar las respuestas T-dependiente y TI-2 de manera diferente, potencialmente debido a la modulación en el último caso por coestímulos administrados a través de moléculas receptoras CD21 / 35 o Toll-like (36).

El hallazgo de que las diferencias cuantitativas en el reconocimiento de antígenos regulan el destino de las células durante las primeras respuestas de las células B dependientes de T revela un sofisticado nivel de control que presumiblemente ha evolucionado para optimizar el despliegue de los clones de células B que responden. Vincular la diferenciación rápida de las células plasmáticas con una fuerte interacción inicial con el antígeno significa que los recursos sustanciales necesarios para respaldar la diferenciación de las células plasmáticas y la posterior producción de anticuerpos de alto nivel (37) se dedican solo a aquellos clones con una buena probabilidad de secretar anticuerpos biológicamente efectivos (38). En el caso de los epítopos paucivalentes, esto significa que sólo se producen anticuerpos de afinidad relativamente alta (figs. 2-4, 3 4). Sin embargo, los epítopos presentes en alta densidad pueden ser neutralizados eficazmente por anticuerpos de menor afinidad (39-41). En estas condiciones específicas (p. Ej., HEL 3X -SRBC de alta densidad), tiene sentido biológico permitir que las células B de baja afinidad entren en la respuesta extrafolicular de las células plasmáticas (figura 6). La regulación mediada por BCR de las respuestas tempranas dependientes de T también asegura que las especificidades específicas de antígeno que hacen una contribución mínima a la respuesta inicial de anticuerpos no se descartan sino que se dirigen específicamente a los GC. Aquí pueden experimentar SHM y maduración de afinidad y pueden aportar nuevas especificidades efectivas en una etapa posterior de la respuesta. Esto se ejemplifica cuando SWHEL Las células B son desafiadas con HEL 3X -SRBC de densidad intermedia, donde la ausencia de una respuesta de anticuerpos temprana (día 5) (Fig.5 C) es seguida por la acumulación subsecuente de anticuerpos anti-HEL 3X de alta afinidad producidos por post- Células plasmáticas GC (datos no publicados).

El papel fundamental de una fuerte interacción antígeno-BCR en la diferenciación temprana de células plasmáticas in vivo es intrigante, dado que las células B estimuladas con señales derivadas de células T in vitro se someten a una diferenciación eficaz de células plasmáticas ligada a la proliferación sin necesidad de ligación con BCR (32). Esta dicotomía sugiere que la diferenciación de células B in vivo está influenciada por señales adicionales que, en ausencia de un fuerte reconocimiento de antígenos, suprimen la vía de diferenciación de células plasmáticas predeterminada. Debido a que las células B que responden pueden proliferar y entrar en la respuesta de GC sin sufrir una diferenciación significativa de células plasmáticas (p. Ej., Respuesta HEL 3X -SRBC), es posible que el microambiente de GC inhiba este proceso. Si esto es cierto, una fuerte interacción inicial entre BCR y el antígeno puede permitir que al menos una proporción de las células hijas de un clon que responda evite el GC y experimente la diferenciación de células plasmáticas. El mecanismo específico involucrado no está claro, pero puede basarse en alteraciones mediadas por BCR en la expresión de receptores quimiotácticos que facilitan la migración extrafolicular (1). Alternativamente, una presentación más eficiente de péptidos derivados de antígenos facilitada por un reconocimiento de antígeno más fuerte puede dar como resultado diferencias cuantitativas o cualitativas en la entrega de la ayuda de las células T que influyen en la respuesta de las células B. Una pista potencial puede residir en el hecho de que la disminución progresiva de la afinidad inicial del antígeno redujo la tasa de proliferación de las células B anti-HEL durante las primeras 64 h de la respuesta (Fig. 2). Por lo tanto, es posible que la respuesta proliferativa inicial pueda influir en la capacidad de las células que responden para experimentar una rápida diferenciación de células plasmáticas. En este caso, es posible que las señales enviadas independientemente de la interacción antígeno-BCR, pero con el potencial de modificar la proliferación de células B (p. Ej., Ligandos del receptor tipo Toll) también puedan afectar el tamaño de la respuesta extrafolicular de las células plasmáticas. Los estudios que utilizan el modelo descrito aquí ayudarán a resolver los mecanismos específicos involucrados y caracterizarán aún más las señales que dan forma a las respuestas de las células B in vivo. Esta información es muy prometedora para el futuro desarrollo de nuevas terapias para enfermedades autoinmunes, así como para la optimización de las estrategias de vacunación.


Evaluación comparativa de la expresión de CD19 y CD20 de superficie en linfomas de células B a partir de biopsias clínicas: implicaciones para terapias dirigidas

Pedro Horna, Grzegorz Nowakowski, Jan Endell, Rainer Boxhammer Evaluación comparativa de la expresión de CD19 y CD20 de superficie en linfomas de células B de biopsias clínicas: implicaciones para terapias dirigidas. Sangre 2019134 (Suplemento_1): 5345. doi: https://doi.org/10.1182/blood-2019-129600

Fondo: CD19 y CD20 son antígenos específicos del linaje de células B expresados ​​en la superficie celular de la mayoría de los linfomas de células B. Mientras que CD20 se adquiere durante las últimas etapas de la linfogénesis de las células B y luego se pierde con la diferenciación en células plasmáticas, la expresión de CD19 cubre todo el espectro de la génesis y maduración de las células B tempranas. CD20-targeting agents have been broadly integrated into the therapeutic armamentarium for B-cell lymphomas. More recently, CD19-targeting agents have emerged as promising alternatives with demonstrated therapeutic value. Given the imminent availability of both CD19 and CD20 targeted therapies, and potential for combinational approaches, we studied the surface expression of these antigens at the single-cell level on lymphoma cells and benign background lymphoid subsets from biopsy specimens.

Métodos: Flow cytometric analysis (seven-color) was performed on biopsy specimens from 47 patients with newly diagnosed B-cell lymphomas, including diffuse large B-cell lymphoma (n=15), follicular lymphoma (n=15), marginal zone lymphoma (n=9), mantle cell lymphoma (n=9), Burkitt lymphoma (n=2), and unclassifiable low-grade B-cell lymphoma (n=2). Small lymphocytic lymphoma was intentionally excluded, given its well-described loss of CD20 expression. Biopsies from eight additional patients with persistent/recurrent B-cell lymphomas after anti-CD20 therapy (greater than 6 months after last dose) were also evaluated. Thresholds for CD19 or CD20 antigen positivity were defined for each case, based on the 95th percentile fluorescence intensity of the respective marker on tumor-infiltrating T-cells (internal negative control). In addition, CD19 or CD20 fluorescence intensities of tumor cells were normalized to background benign B-cells (internal positive control) using the median fluorescence ratio (MFR).

Resultados: Both CD19 and CD20 were highly expressed on CD20 treatment naïve tumor cells, with a slightly higher median percentage of positive tumor cells for CD19 (98%) compared with CD20 (93%) (p=0.003), and one case lacking CD20 expression. When compared with background benign B-cells, CD20 was frequently overexpressed on tumor cells (mean MFR=1.8), while CD19 expression was overall similar to background benign B-cells (mean MFR=0.9) (p=0.001). As the surface density of CD20 on benign B-cells is reportedly higher than CD19 (

20,000 molecules per cell, respectively), these findings are consistent with a higher density of surface CD20 than CD19 on most B-cell lymphomas. However, CD20 expression was more heterogeneous (within individual patient samples and across patients), with a higher median percentage of CD20-negative tumor events (median=0.5%, range=0-98%) compared with CD19-negative events (median=0%, range=0-28%) (p=0.003). Interestingly, expression of CD19 within the CD20-negative tumor subsets was largely preserved (mean % CD19-positive events=97.86%, min=40%). In addition, percentages of CD19/CD20 double-negative tumor events were very small (median=0%, range=0-4.9%), and only detectable in 15 cases (32%). Of eight additional cases studied post-anti-CD20 immunotherapy (6-84 months after last dose), the percentage of antigen-positive events by tumor cells was largely preserved for both CD19 (median=99.6%, range=93.5-100%) and CD20 (median=95.7%, range=55.6-100%), similar to the pre-therapy cohort.

Conclusiones: CD19 and CD20 are both highly and consistently expressed in B-cell lymphomas. While CD20 has a higher average density of surface molecules per tumor cell, CD19 expression is more homogenous and is preserved in small CD20-negative tumor subsets and after anti-CD20 targeted therapy. These findings support the clinical evaluation of anti-CD19 immunotherapies and combinational therapies targeting both surface antigens.

Horna:MorphoSys AG: Research Funding. Nowakowski:Selvita: Membership on an entity's Board of Directors or advisory committees Celgene: Consultancy, Research Funding Bayer: Consultancy, Research Funding Curis: Research Funding F. Hoffmann-La Roche Ltd: Research Funding Genentech, Inc.: Research Funding MorphoSys: Consultancy, Research Funding NanoString: Research Funding. Endell:MorphoSys AG: Employment, Patents & Royalties. Boxhammer:MorphoSys AG: Employment, Patents & Royalties.


Discusión

In this paper we have introduced a coarse-grained model of immunoglobulin G (IgG) molecules, realized by fastening three ellipsoids with the proper aspect ratio together around a common hinge. The purpose of our study is to shed light on the role of the IgG flexibility and large size on its ability to bind to surface-absorbed antigens. Our coarse-grained (CG) model is conceived explicitly so as to reproduce the distributions of inter-domain angles measured by cryo-ET.

In our simulations, a large number of IgGs diffuse in a given volume and a binding equilibrium is reached with antigens adsorbed at a given density on the bottom surface. The equilibrium profiles of the surface concentrations of IgGs bound with one Fab and with both Fabs to the antigen-covered surface highlight the crucial role played by flexibility. When compared with antibodies frozen in an equilateral triangular configuration, fully flexible molecules demonstrate a much higher ability to bind with both Fabs. This is a direct result of a dynamic buscar process performed by the dangling second Fab of IgGs already bound with one arm. This capability of adapting to irregular antigen configurations is quenched in the rigid molecules, which are only able to bind bivalently when they happen to find two antigens lying at the appropriate distance matching their fixed Fab-Fab angular aperture.

In order to shed light on the observed binding equilibrium, we formulate a two-step kinetic model, where IgGs first bind from the bulk to the surface with one Fab (equilibrium dissociation constant ) and then double with the second Fab (equilibrium dissociation constant ). Importantly, our model not only includes the information on the sobre y apagado rates, but also accounts explicitly for an important geometrical constraint, namely surface poner en pantalla. IgGs are large molecules and excluded-volume interactions, especially in the proximity of the antigen-covered surface, prove extremely important. This effect is two-fold. On the one side, (i) IgGs diffusing in the bulk ver a number of available epitopes on the surface which is reduced with respect to the bare number of sites that are already occupied. In fact, a substantial number of non-bound antigens are nonetheless de facto unavailable as a result of the large size of IgGs bound in their proximity, which make them invisible to other antibodies in the bulk. Moreover, (ii) as a result of the IgG-IgG excluded-volume interactions at the surface, it turns out that the second Fab of a single-arm bound IgG always sees the face-value antigen concentration around, as it never gets to probe already occupied sites. These are too far away on average as a result of the effective repulsion among bound IgG molecules on the surface.

We conclude that the large and extremely flexible three-lobe conformation of IgGs is accurately designed to afford bivalent binding and at the same time take advantage of excluded-volume interactions to a maximum. This is probably the result of concurrent evolutive pressures towards smart antigen chasers capable of (i) bind strongly, es decir. with two binding sites (ii) bind differentially, es decir. bind to antigens of widely different sizes and (iii) bind optimally, es decir. maximize the number of bound molecules at a given concentration of target density.

Our model is in excellent agreement with surface plasmon resonance experiments of IgGs binding to surface-adsorbed haptens. We establish very clearly that flexibility is essential to reproduce the experiments (see Fig 6(a)). Furthermore, our theory allows us to isolate the second binding as the key factor that makes flexible IgGs much more powerful antigen binders. In fact, the dissociation constant measured from our simulations for rigid IgGs is five times larger than for the flexible ones.

A striking confirmation that the equilibrium constant for the second binding is the key factor can be gained by studying the equilibrium fraction of bivalently bound molecules (or, equivalently, sites). Once plotted against the antigen surface concentration rescaled by the dissociation constant (see Fig 6(b)), the three models, flexible, rigid and ghost fall on the same curve as the experimental data (where we have used the experimental dissociation constant). This remarkable fact proves very neatly that such relativo measure conceals a great deal of the physics underlying the binding process.

The concealed information is instead conspicuous when one looks separately at the binding profiles, es decir. the average number of single-Fab (norte1) and double-Fab bound (norte2) IgGs against antigen concentration σ. More precisely, the low-concentration regime turns out to be the same in the three models, namely norte1σ, norte2σ 2. At low antigen coverage, it makes no difference at all whether IgGs are able to stretch their second arm to get hold of neighboring haptens or whether they repel each other on the surface. Importantly, the low-σ regime fixes the two equilibrium constants and , but obviously bears no sign of the screening effect. At increasing values of σ, the telltale signs of surface screening emerge clearly. Fully flexible molecules take advantage of the combined effects of their flexibility and mutual repulsion, which essentially makes haptens within reach of the second Fab always unoccupied on average. On the contrary, rigid IgGs remain largely unable to bind with both arms, despite their mutual exclusion, while ghost molecules take full advantage of their invisibility to bind with two Fabs, unphysically outperforming fully flexible antibodies at high densities.

We stress that our model includes in a natural way the kinetic parameters (sobre y apagado rates for the two binding events) and the key geometrical parameters. This is at variance with an existing model of IgGs binding to antigen-covered surfaces [33], which conceals the thermodynamic and geometrical information in one and the same parameter, namely an effective screening area. As such, our model provides a more accurate and valuable theoretical framework to interpret experimental profiles of antibodies binding to multi-valent surfaces in different contexts.


Measuring cell fluorescence using ImageJ¶

Repeat this step for the other cells in the field of view that you want to measure.

NB: Size is not important. If you want to be super accurate here take 3+ selections from around the cell.

  • Once you have finished, select all the data in the Results window and copy and paste into a new spreadsheet (or similar program)
  • Use this formula to calculate the corrected total cell fluorescence (CTCF).

CTCF = Integrated Density – (Area of selected cell X Mean fluorescence of background readings)

Notice that rounded up mitotic cells appear to have a much higher level of staining due to its smaller size concentrating the staining in a smaller space. If you used the raw integrated density you would have data suggesting that the flattened cell has less staining then the rounded up one, when in reality they have a similar level of fluorescence.

This method is based, with permission, on an original protocol from QBI, The University of Queensland, Australia.


Ver el vídeo: Densidad - 1er año (Noviembre 2022).