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Esqueletización en el espacio

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Una cápsula espacial que contiene un astronauta se desplaza hacia el espacio y no puede ser rescatada. La cápsula espacial no contiene insectos y las únicas bacterias presentes son las que trajo originalmente el astronauta. Hay mucho oxígeno (suponga un 20%) y el interior se calienta a largo plazo a 20 grados C mediante un calentador de radioisótopos.

El astronauta finalmente muere por falta de comida o agua. Su cuerpo se encuentra muchos años después. ¿Qué encontrarán los rescatistas? ¿Un cuerpo o un esqueleto?


Primero, asumo que muchos años equivalen a 10 años o más, aunque la presencia de oxígeno puede acelerar drásticamente esto o puede interferir, es difícil de decir. Nadie intentó averiguar cómo se pudrirá algo en un recipiente sellado pero conscientemente oxigenado, ya que básicamente no existe sin una cámara hecha a medida.

Su factor principal es la humedad, es decir, si la vaina tiene control de humedad, si mantiene una humedad cómoda para los humanos, tendrá una momia esquelética, ya que la piel y el cabello sobrevivirán, pero gran parte del cuerpo se secará. Si solo lo trata como un recipiente sellado, los fluidos corporales que se descomponen aumentarán la humedad y solo tendrá un montón de huesos y una sopa bastante repugnante. Un recipiente sellado es una forma de descomponer el cadáver de un animal para obtener huesos, se llama maceración y es algo que ha sido bien estudiado. Lo he hecho muchas veces y unos años es más que suficiente para reducir un cadáver a un esqueleto. Tenga en cuenta que, dependiendo de cuánto tiempo espere, incluso el hueso puede dañarse o destruirse, aunque la biota restringida puede evitar que las etapas finales de esto le dejen con restos de esqueleto extremadamente frágiles.

Debo enfatizar que el olor será repugnante, ya que incluso los investigadores experimentados arrojarán sus galletas si lo huelen. Casi nada puede describir el disgusto del olor de un cuerpo humano pudriéndose en un recipiente sellado. Nuestros cerebros han evolucionado para encontrar la carne podrida humana lo más repugnante posible.

para comparación adicional, un documento que compara la descomposición de varias canales de cerdo selladas en hormigón.

Direcciones de enlace de origen https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2738563/

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9781118953358.ch33

https://journals.lww.com/amjforensicmedicine/Abstract/2013/03000/Burial_of_Piglet_Carcasses_in_Cement__A_Study_of.13.aspx


RRT informado mejorado * usando esqueletización de mapa de cuadrícula para la planificación de rutas de robots móviles

Se propuso un algoritmo mejorado de RRT * informado para reducir el tiempo de cálculo, incluso en entornos complejos. A diferencia de RRT * utilizado por Informed RRT * para encontrar una solución inicial para todo el espacio de configuración, el enfoque de esqueletización del mapa de cuadrícula se aplica para generar la solución inicial. Debido a que el proceso de esqueletización se puede realizar de forma más rápida y robusta que un proceso en el que el árbol se construye mediante muestreo aleatorio de RRT *, la solución inicial se obtiene de manera eficiente y se optimiza antes en comparación con los algoritmos convencionales de RRT * informados. Los resultados de la simulación del algoritmo de RRT informado mejorado propuesto * muestran que el tiempo de cálculo es más corto, con una desviación estándar menor que la del RRT informado * convencional.

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Las etapas de la descomposición

La descomposición es un proceso normal y completamente natural. Al morir, el corazón y los pulmones dejan de funcionar y con eso la sangre deja de bombear, el oxígeno deja de fluir y los tejidos de todo el cuerpo comienzan a descomponerse. Hay cuatro etapas de descomposición, la velocidad por la que pasa el cuerpo será diferente, dependiendo de varios factores como el clima, la humedad, la temperatura e incluso la posición del cuerpo. Todos estos tienen un impacto en la velocidad de la descomposición, pero las cuatro etapas aún ocurren.

¿Cuáles son las cuatro etapas de la descomposición?

Para ser específicos, estamos hablando de descomposición humana aquí. Si bien somos expertos en limpieza de peligros biológicos, no somos expertos en las formas todo decae y se descompone por lo que debería mencionarse. Las cuatro etapas de descomposición son: autólisis, hinchazón, descomposición activa y esqueletización.

Esto es lo que abarcan esas etapas.

Autolisis

La autólisis es la primera etapa de la descomposición y tiene lugar inmediatamente después de la muerte, generalmente aproximadamente a los 4 minutos aproximadamente. La autólisis es cuando los tejidos comienzan a ser destruidos y degradados por sus propias enzimas. Esto ocurre porque la respiración y la circulación sanguínea se han detenido, el cuerpo ya no está eliminando desechos y proporcionando nuevo oxígeno. El dióuro de carbono se acumula, creando una atmósfera ácida, las membranas celulares (las paredes de la célula) se rompen y dejan salir enzimas que luego digieren las células desde el interior.

El rigor mortis también comienza en esta etapa. Un montón de reacciones químicas diferentes ocurren en los músculos, lo que hace que se pongan rígidos.

Inflar

Los gases comienzan a acumularse debido a la fuga de enzimas y material durante la autolisis. Las bacterias producen un compuesto que contiene azufre que también conduce a la decoloración. Durante la etapa de hinchazón, el cuerpo humano puede duplicar su tamaño. Todo esto conduce a la putrefacción y extremadamente malos olores. Con frecuencia, este olor es lo que atraerá la atención de los demás. Estos olores también pueden persistir mucho después de que se haya retirado el cuerpo.

Decaimiento activo

Después de la hinchazón, comienza la caries activa. Cuando todos los tejidos blandos del cuerpo se descomponen, los órganos, los músculos y la piel se licuan. Quedan cabello, huesos, cartílagos y algunos otros materiales. Durante la etapa de descomposición activa, el cuerpo pierde la mayor parte de la masa.

Esqueletización

Después de la etapa de descomposición activa, se produce la esqueletización. Aquí es cuando toda la materia se desintegra dejando nada más que huesos. No hay un marco de tiempo establecido para cuando ocurrirá la esqueletización, ya que se basa en gran medida en la pérdida de las otras partes.


Resultados

Nuestro método consta de una serie de pasos separados que describimos aquí individualmente.

Procesando imagen digital

Se utilizan diferentes técnicas de imagen para generar películas de células móviles: fluorescente, contraste de fase y contraste de interferencia diferencial (DIC). Antes de un análisis de imagen adicional, se realizan dos pasos para procesar las películas de la celda original. El primer paso es segmentación, en el que las áreas de las celdas se extraen de su fondo y se adquieren las formas de las celdas en cada fotograma. Con base en las características de la imagen, se han diseñado diferentes algoritmos específicamente para las tres técnicas de microscopía mencionadas (Apéndice A). El segundo paso es suavizado de límites, cuyo objetivo es eliminar las fluctuaciones espaciales de alta frecuencia del límite de la celda causadas por el ruido de la imagen. Las curvas B-spline cuadráticas uniformes, que son curvas suaves con derivadas continuas de primer orden y se aplican ampliamente en el diseño geométrico asistido por computadora, se utilizan para ajustar los límites de las celdas [13]. El algoritmo de ajuste se basa en el modelo de espacio de forma y estimaciones recursivas de mínimos cuadrados [14] (Apéndice B).

Esqueletización

El esqueleto de una forma se define basándose en el concepto de bola máxima en el contexto del espacio euclidiano 2D. Las extensiones sencillas son posibles en el espacio 3D [8]. Se dice que una bola que está dentro de una curva límite cerrada definida por una forma plana es máxima si no puede estar contenida en ninguna otra bola más grande que también esté totalmente incluida en la misma curva. El esqueleto de una forma plana se define como el eje medial de la forma, que es el lugar de los centros de las bolas máximas en esa forma. Tenga en cuenta que dondequiera que haya una protuberancia de la membrana celular, al menos una rama se produce en el esqueleto (Figura 1A-C).

En la práctica, debido a que las formas se adquieren a partir de imágenes digitales, los esqueletos calculados son solo aproximaciones del eje medial continuo. Se han propuesto múltiples algoritmos que determinan el esqueleto de una forma definida por una curva discretizada [15-20]. El eje medial descrito anteriormente se puede determinar basándose en mapas de distancia, simulaciones de "fuego de pasto" o diagramas de Voronoi. En el mapa de distancias, se asigna un valor a cada punto dentro de la forma correspondiente a la distancia desde este punto hasta el límite [16,17]. Los puntos del esqueleto se definen como las crestas en el gráfico de contorno construido. En las simulaciones de incendios de pasto, cada punto en el límite de la forma sirve como la fuente de una onda que se propaga hacia adentro con velocidad constante [18, 19]. El esqueleto se determina como los puntos singulares generados cuando las ondas chocan. Se considera que estas dos clases de algoritmos proporcionan resultados equivalentes. Por último, los algoritmos basados ​​en diagramas de Voronoi utilizan el hecho de que el esqueleto de una forma con puntos límite discretos puede aproximarse mediante un subgráfico del diagrama de Voronoi [20]. La carga computacional para esta clase de algoritmos suele ser mayor. Sin más procesamiento, los esqueletos generados por estos algoritmos son bastante sensibles a las variaciones de forma, ya que pequeñas perturbaciones en la curva límite pueden resultar en cambios significativos en el eje medial. Para adquirir una representación más significativa de la forma, generalmente es necesario suavizar los límites (descritos anteriormente) y podar las ramas (que se describen a continuación).

Otra clase de algoritmos que crean esqueletos que se ven similares, pero que no necesariamente corresponden al eje medial, utiliza un enfoque llamado adelgazamiento. En estos algoritmos, los píxeles de los límites de una región se eliminan progresivamente sin cambiar la topología de la región, hasta que sólo queda una estructura esquelética [12]. Aunque este método se prefiere en algunas aplicaciones, ya que es más resistente a las variaciones de los límites, podría perderse la información de interés sobre la forma de la celda. Por esta razón, usamos esqueletos del eje medial y los adquirimos usando la función bwmorph en Matlab Image Processing Toolbox, cuyo algoritmo subyacente es la simulación Grassfire (Mathworks, Natick, MA).

Poda de ramas

El suavizado de límites ayuda a eliminar las ramas falsas que surgen de imágenes ruidosas (Figura & # x200B (Figura 2). 2). Sin embargo, otra rama poda Es necesario mapear cada pseudópodo percibido por los ojos humanos con exactamente una rama del esqueleto. Como su nombre lo indica, la poda de ramas ayuda a minimizar el número de elementos distintos en la descripción del esqueleto de la célula. Se han desarrollado muchos métodos de poda diferentes [20-24]. Todas estas técnicas funcionan definiendo una métrica de importancia para los puntos del esqueleto. En el caso de cambios en la forma celular inducidos por la motilidad, se diseñan dos criterios para podar ramas espúreas (Figura & # x200B (Figura3 3).

Suavizado de límites. A. Imagen fluorescente de una célula de quimiotaxis. B. La curva cerrada muestra el borde de la forma segmentada antes de suavizar los segmentos de línea que forman el esqueleto obtenido de esta forma. C. Límite suavizado y esqueleto resultante. D. Comparación de los esqueletos original (gris) y posterior al suavizado de límites (negro). Tenga en cuenta que han desaparecido varias ramas que se considera que surgen de las fluctuaciones del ruido en la imagen.

Poda de ramas. A. Imagen DIC de un movimiento Dictyostelium Celda en la que el esqueleto (B) muestra tres ramas principales distintas. Cerca del límite, estas ramas pueden bifurcarse y formar ramas más pequeñas más cortas que el umbral de longitud. pagumbral (recuadros). Si la rama es independiente, es decir, no comparte raíz con ninguna otra rama exterior (inserción media, rama verde), la quitamos del esqueleto. De lo contrario, si la rama comparte una raíz con otra rama (ramas azules en los tres recuadros), combinamos las dos ramas (si tienen aproximadamente la misma longitud, es decir, la longitud de la rama más larga dividida por la más corta es menor que el umbral de la relación r, tres pares de ramas azules en tres recuadros) o elimine la rama más corta (cuando tienen longitudes significativamente diferentes, es decir, la relación de longitud no es inferior a r, no mostrado). C. Esqueleto después de la poda de ramas. D. La protuberancia o retracción real suele ocurrir cuando la terminal de la rama está cerca del límite (rojo). Si el límite se redondea localmente (azul), la rama estará lejos y es poco probable que ocurra una actividad pseudopodial allí.

Primero, las ramas cortas del esqueleto corresponden a variaciones relativamente pequeñas en la forma, a la inversa, las ramas largas surgen de características de forma más significativas. Así, el esqueleto se poda quitando pequeñas ramas. los ramas exteriores de un esqueleto se definen como los segmentos de línea con al menos un terminal que no está conectado a ninguna otra parte del esqueleto. El punto que une una rama exterior con la parte interior del esqueleto se denota como el raíz de esta rama (Figura & # x200B (Figura3B, 3B, rojo). Con un umbral de longitud preestablecido de pagumbral píxeles y una relación de longitud r & # x0003e 1 (valores empíricos dados en la Tabla & # x200B Tabla1), 1), cada rama exterior más corta que pagumbral se considera:

Tabla 1

Valores de parámetros preestablecidos en algoritmos 1.

VariableDefiniciónValor utilizado
Poda de ramaspagumbralUmbral de longitud para identificar una rama exterior corta1/10 de la longitud del cuerpo celular 2
rUmbral de relación para decidir si combinar dos ramas o eliminar la más corta1.5
PrDistumbralUmbral de distancia para eliminar una rama alejada del límite1/6 de la longitud del cuerpo celular
Seguimiento hacia atrásTEl tiempo máximo de separación por el cual dos actividades pueden considerarse como del mismo pseudópodo 3 50 s
& # x003b1Peso en la diferencia de primer orden al calcular la función de costo en el seguimiento0.5
& # x003b2Peso de la distancia espacial al calcular la puntuación de distancia0.5
RRadio de celda5 & ​​# x003bcm
DistumbralUmbral en la puntuación de distancia para agrupar dos actividades en el mismo pseudópodo1/10 del perímetro del límite de la celda

1 Estos valores se eligen para minimizar la discrepancia entre el método automatizado y los juicios manuales. Para el algoritmo de poda de ramas, se seleccionan células representativas con diferentes tamaños y formas, y sus pseudópodos durante el movimiento son identificados por biólogos celulares experimentados. Para el algoritmo de seguimiento hacia atrás, los resultados del seguimiento manual de películas representativas se adquieren de forma independiente. A continuación, se prueban diferentes valores de parámetros en algoritmos y se seleccionan las mejores combinaciones como se indica.

2 La "longitud del cuerpo celular" se calcula como la longitud corporal promedio entre todas las células del mismo experimento. Por lo tanto, es una constante al analizar películas de un mismo experimento, pero puede variar para diferentes experimentos.

3 Este parámetro debe configurarse empíricamente de acuerdo con la velocidad de fotogramas específica utilizada durante la captura de imágenes; el valor aquí se eligió para películas muestreadas a 10 s / fotograma. Para todos los demás parámetros, los valores dados aquí se aplican a todas nuestras películas, que incluyen diferentes tipos de celdas, velocidad de fotogramas y aumento de la imagen.

1. Si la rama es independiente, es decir, no comparte una raíz con ninguna otra rama externa, entonces se elimina del esqueleto (Figura & # x200B (Figura3B, 3B, verde).

2. De lo contrario, si la rama comparte una raíz con otra rama, se comparan sus longitudes respectivas:

& # x025aa Si la longitud de la rama más larga es menor que r veces de la longitud del más corto, o el más largo en sí es más corto que pagumbral, luego las dos ramas se combinan en una sola que surge de la raíz (Figura & # x200B (Figura3B, 3B, azul).

& # x025aa Si la rama más larga es más larga que pagumbral y más largo que r veces de la más corta, entonces se quita la rama más corta y se retiene la más larga.

Si más de dos ramas externas comparten una raíz común, se comparan y, si es necesario, se combinan secuencialmente. Para combinar dos ramas, el punto en la posición promedio de los dos terminales distintos de la raíz se identifica y se vincula a la raíz. Al hacer esto, no solo se evita el acortamiento de las ramas simplemente eliminando las dos ramas cortas, sino que también se garantiza que la rama combinada representa la línea central aproximada de un pseudópodo (Figura & # x200B (Figura3C 3C).

El segundo criterio para la poda se basa en la curvatura local de la curva límite, que puede ser determinada por el recíproco del radio del círculo osculante [25]. Por lo general, cada protuberancia o retracción ocurre cerca de un punto donde la curvatura local es relativamente alta en comparación con otras partes del límite (Figura & # x200B (Figura3D, 3D, rojo). Debido a que el punto terminal de una rama externa es el centro de la círculo asociado con este punto límite, la distancia desde el punto terminal al límite da una medida de la curvatura local. Cuando esta distancia es grande, el límite tiene una curvatura pequeña localmente. Por lo tanto, es poco probable que la rama correspondiente apunte a un saliente o región de retracción de la celda (Figura & # x200B (Figura3D, 3D, azul). Para eliminar estas ramas, un umbral de distancia (PrDistumbral Table & # x200B Table1) 1) se establece y se eliminan todas las ramas con terminales (que no sean sus raíces) más alejadas de la membrana celular.

Detectando actividad pseudopodial

A medida que las células se mueven, sus formas se deforman y provocan cambios temporales en los esqueletos correspondientes (Figura & # x200B (Figura 4). 4). Buscamos describir este proceso dinámico y establecer un algoritmo para determinar si los cambios en la forma celular corresponden a protuberancias o retracciones. Las diferencias de forma se refieren a las regiones donde la forma cambia durante la motilidad de un fotograma al siguiente [26]. Pueden ser de flujo "positivo" o "negativo", dependiendo de si las áreas están creciendo o disminuyendo. Sin embargo, debido al ruido de la imagen y las perturbaciones aleatorias de la forma de la membrana, las diferencias no siempre están bien definidas. Por lo tanto, las diferencias de forma se combinan con los esqueletos para detectar actividades de protrusión y retracción.

Esqueletos dinámicos. A. Dos imágenes consecutivas de una quimiotaxis. Dictyostelium celda A2 muestra el último fotograma. Las imágenes están separadas por 30 segundos. B. Límites celulares y sus respectivos esqueletos podados: Snortepara el fotograma anterior y Snorte+1 para el último. C. Al comparar las regiones en las dos imágenes, se obtiene un mapa de diferencias que describe la deformación de la celda de una imagen a la otra. Las regiones blancas () están creciendo, mientras que las regiones negras () se están retirando. D.Las ramas del esqueleto en el último cuadro (líneas rojas) señalan actividades de protrusión si apuntan a regiones adentro, y las ramas del esqueleto en el cuadro anterior (líneas azules) señalan retracciones si apuntan a regiones adentro. Las posiciones de partida de estas actividades se deciden por los puntos donde Snorte+1 o Snorteinterseca la curva límite del fotograma anterior (puntos rojos para protuberancias y puntos azules para retracciones). El tamaño de una actividad se calcula como la longitud de la parte de la rama asociada que reside en el cultivo (L1 en D1) o retirarse (L2 en D2) zona. E. El ángulo relativo de una protuberancia (& # x003b83) o retracción (& # x003b84) se define cuando la celda se mueve en respuesta a un gradiente de quimioatrayente, basado en el centro de la celda en el marco anterior (el punto negro) y el punto de inicio de la actividad (punto rojo para protuberancia y punto azul para retracción) .

El proceso se inicia segmentando imágenes sucesivas de una celda en movimiento (Figura & # x200B (Figura 4A). 4A). Asumir que Inortey Inorte+1 son las segmentaciones binarias en el norte th y (norte+1) st fotogramas respectivamente, donde los píxeles dentro de la celda se establecen en 1 y los del fondo en 0. Denote los esqueletos podados en fotogramas norte y (norte + 1) por Snortey Snorte+1 respectivamente (Figura & # x200B (Figura 4B). 4B). Dejar D ser el espacio 2D donde se definen todos los fotogramas de imagen de una película, y pag ser un píxel dado en D. Definir por

las regiones de expansión y retracción de la celda, respectivamente, de la norte th al (norte+1) primer marco (Figura & # x200B (Figura 4C). 4C). Tenga en cuenta que las ramas del esqueleto del (norte+1) st marco se extienden desde su raíz hacia adentro y los de la norte El marco se extiende desde su raíz hacia adentro (Figura & # x200B (Figura4D 4D).

A saliente se define como una región que incluye una rama de Snorte+1 (Figura 4D1). La posición inicial de una protuberancia en la membrana en el marco. norte está establecido por la intersección de Snorte+1 y el límite de Inorte, y la longitud de la protuberancia entre los marcos norte y (norte +1) viene dado por la longitud de la rama que reside en (L1 en la Figura 4D1). Del mismo modo, un retracción se define como una región que incluye una rama de Snorte(Figura 4D2). La posición inicial en la membrana en el marco. norte y la longitud de la contracción se definen de la misma manera.

Puede haber situaciones en las que una rama del esqueleto no toque el límite de la celda. En estos casos, extendemos la rama a la membrana y calculamos la longitud extendida como el tamaño del paso de la actividad.

Si la célula se mueve en respuesta a una señal externa, por ejemplo durante la quimiotaxis, también estamos interesados ​​en cómo la protuberancia o retracción se alinea con el gradiente de quimioatrayente. Para calcular esto, la línea 0 & # x000b0 se define como el rayo que comienza desde el centroide de la célula a lo largo del cual la concentración de quimioatrayente aumenta más rápidamente. El ángulo de una actividad se calcula como el ángulo desde la línea 0 & # x000b0 previamente definida hasta la línea que une el centroide de la célula y el punto de partida de esta actividad en la membrana (Figura & # x200B (Figura 4E 4E).

El tiempo de las ocurrencias, las posiciones espaciales en los fotogramas inicial y final y los ángulos desde el centro de la celda se registran para todas las protuberancias y retracciones detectadas. Estos datos se utilizan para describir la dinámica de estas actividades.

Seguimiento hacia atrás para la clasificación del linaje de pseudópodos

Se ha argumentado que las diferentes cepas celulares exhiben una motilidad y cambios morfológicos diferentes porque extienden, retraen o dividen los pseudópodos de diferentes maneras [27, 28]. Para analizar los patrones cambiantes de los pseudópodos, es necesario determinar el linaje de todas las protuberancias y retracciones detectadas. Con este fin, desarrollamos un algoritmo de seguimiento automatizado que agrupa las actividades en grupos distintos, cada uno de los cuales representa la historia que sobresale y se retrae de un solo pseudópodo.

La idea básica del algoritmo es modelar la dinámica del pseudópodo utilizando un proceso autorregresivo de segundo orden [29]. Más específicamente, se realizan las siguientes suposiciones:

1. Los cambios en la posición espacial y el ángulo en las actividades del mismo pseudópodo de un fotograma al siguiente son mucho menores que la distancia entre dos pseudópodos diferentes.

2. Cuando cambia la posición o el ángulo de la actividad, la tasa de cambio tiende a ser constante.

3. Si no se observa ninguna otra protuberancia o retracción en un intervalo de tiempo después de la última actividad registrada para un pseudópodo existente, un pseudópodo ha terminado. Esto tiene en cuenta el hecho de que los pseudópodos tienen una vida útil limitada.

Debido a que se cree que los pseudópodos se dividen con frecuencia durante el movimiento, se rastrean hacia atrás en el tiempo [30]. Es necesario decidir si cada protuberancia o retracción detectada en un momento determinado es parte de un pseudópodo en curso o de un nuevo pseudópodo. Para lograr esto, una métrica de distancia ponderada entre actividades que toma en cuenta las diferencias en la ubicación espacial (X, y), el ángulo (& # x003b8) y la hora (t) se define. Más específicamente, suponga que dos actividades pag1 = (X1, y1, & # x003b81, t1) y pag2 = (X2, y2, & # x003b82, t2), con t2& # x0003et1 han sido identificados y se ha considerado que pag2 está asociado con la actividad pag3 = (X3, y3, & # x003b83, t3), con t3& # x0003et2. La puntuación de distancia entre pag1 y pag2 se calcula como

Los términos & # x003941,2 ((X1, y1), (X2, y2), (X3, y3)) y & # x003941,2(& # x003b81, & # x003b82, & # x003b83) son las distancias espaciales y angulares, respectivamente, calculadas a partir de la ecuación basada en las diferencias de primer y segundo orden (Apéndice C). Los valores & # x003b2 y 1-& # x003b2 sopesar estas dos distancias, y R es el radio de la celda. El término para la diferencia de tiempo dentro del signo de la raíz cuadrada considera que la probabilidad de dos actividades del mismo pseudópodo disminuye con la distancia de tiempo entre ellos. Valores utilizados para & # x003b2 y R se dan en la Tabla & # x200B Tabla1. 1. Después de que esta puntuación de distancia se calcula de cada actividad no asignada a todas las asignadas hasta T segundos, se ordenan las puntuaciones y se selecciona la mínima. Si está por debajo de un umbral determinado, Distumbral, se considera que las actividades provienen del mismo pseudópodo; de lo contrario, la actividad no asignada se etiqueta como la última actividad detectada de un nuevo pseudópodo. Por último, se registra una división cuando dos actividades encuentran la misma actividad anterior que su "antepasado" común durante el seguimiento hacia atrás.

Utilizando los métodos descritos anteriormente, calculamos una serie de cantidades para pseudópodos individuales y celdas individuales (Tabla & # x200B (Tabla2). 2). Los resultados computacionales para estos parámetros y las comparaciones entre diferentes cepas celulares se presentan en detalle a continuación.

Tabla 2

Cantidades utilizadas para describir comportamientos morfológicos.

ClasificaciónNombreDescripción
Seudópodos individuales
& # x02003GeneralToda la vidaEl período de tiempo en el que el pseudópodo tiene actividad de protrusión o retracción.
Número de actividades detectadasEl número total de actividades detectadas durante la vida
Velocidad de redEl desplazamiento neto de la membrana local durante la vida útil dividido por la duración del tiempo
& # x02003Dinámica del estadoRelación de protrusión / retracciónRelación de actividades de protrusión / retracción de todas las actividades detectadas
Velocidad de protrusión / retracciónLongitud total del desplazamiento de protrusión / retracción dividida por la duración total del tiempo de protrusión / retracción
Persistencia de protrusión / retracciónEl tiempo de ejecución más largo de protuberancias / retracciones consistentes dividido por la vida útil
Persistencia del estadoEl tiempo de ejecución más largo del estado consistente (ya sea de protrusión o retracción) dividido por la vida útil
& # x02003Dinámica de ángulosÁngulo inicialEl ángulo en el que se detecta la primera actividad del pseudópodo.
Ángulo medioEl ángulo promediado sobre todas las actividades en el pseudópodo
Tasa de cambio de ángulo linealLa pendiente de la línea que mejor se adapta al ángulo de actividad cambia
Varianza de ángulo sin tendenciaLa varianza de los ángulos de actividad después de eliminar la tasa de cambio lineal
& # x02003Comportamiento de divisiónOrigenEl pseudópodo se genera de nuevo o se divide de los existentes.
Número de divisiones¿Cuántas divisiones se generan a partir del pseudópodo durante su vida?
Nivel celular
& # x02003Comportamiento de grupoNúmero medio de pseudópodosEl número medio de pseudópodos activos que coexisten en la membrana celular en un momento determinado.
Proporción de pseudópodos por divisiónNúmero de pseudópodos generados a partir de la división dividido por el número total de pseudópodos
Tasa de división promedioNúmero total de divisiones ocurridas dividido por la duración del período de movimiento
& # x02003Comportamiento promedioPersistencia promedio de protrusión / retracciónCalculado promediando las cantidades correspondientes de pseudópodos individuales sobre todos los pseudópodos de la celda.
Persistencia de estado promedio
Velocidad promedio de protrusión / retracción
Velocidad neta media

Análisis de correlación

Puede usarse microscopía de fluorescencia para obtener una descripción cuantitativa de la localización celular de especies moleculares que se cree que contribuyen a la dinámica de los pseudópodos. La correlación espacial de estos datos con las ubicaciones de las actividades de los pseudópodos puede proporcionar información sobre cómo las diferentes proteínas contribuyen a la motilidad celular.

Para una celda dada durante un período de tiempo dado, una variable de actividad, A(k, & # x003b8), se define como la duración de la actividad si se detecta una actividad en el número de cuadro k, que representa el tiempo y el ángulo & # x003b8 de la actividad de protrusión o retracción en la membrana. Si no se detecta actividad, entonces A(k, & # x003b8) = 0. Una variable de intensidad, I(k, & # x003b8), se define correspondiente al valor de intensidad relativa en el ángulo & # x003b8 y marco k en la membrana. La función de correlación cruzada entre estas dos señales viene dada por

Tenga en cuenta que las definiciones anteriores no son válidas si varios puntos de la membrana corresponden al mismo & # x003b8. La situación suele ser rara para la quimiotaxis. Dictyostelium Células en nuestras películas ninguna célula exhibió tal forma en ningún cuadro. Además, incluso si esta situación estuviera presente, no influiría en el método de detección y seguimiento de pseudópodos descrito anteriormente, ya que estos puntos de membrana son partes de diferentes ramas del esqueleto, y cada actividad se define no solo por el ángulo desde el centro, sino también por la ubicación espacial (X, y). Por lo tanto, si representan diferentes actividades de pseudópodos, se identificarán y analizarán por separado.

Suponiendo que la membrana celular se muestrea cada & # x00394& # x003b8 grados, midiendo la actividad pseudopodial y las variables de intensidad en una película de norte fotogramas, la correlación cruzada calculada a partir de la Ecuación 1 es una matriz del tamaño (360 / & # x00394& # x003b8) & # x000d7 (2norte-1), donde cada fila corresponde a un valor de ángulo de - (180 - & # x00394& # x003b8) / & # x00394& # x003b8& # x000b0 a 180 / & # x00394& # x003b8& # x000b0, y cada columna corresponde a una longitud de cambio de tiempo de - (norte-1 a norte-1 fotogramas. Un valor absoluto alto en (& # x00394k, & # x00394& # x003b8) significa que existe una relación lineal, positiva o negativa, entre las actividades y las intensidades localizadas (& # x00394k, & # x00394& # x003b8) lejos. Esta correlación también se ha utilizado para analizar los patrones ordenados de migración celular espontánea [5].

Ilustrando el método

Para demostrar la capacidad de nuestros métodos para caracterizar los cambios en la forma celular durante la motilidad ameboide, implementamos los pasos descritos anteriormente en imágenes de quimiotaxis. Dictyostelium células. Desarrollado AX3 Dictyostelium las células, una cepa axénica de laboratorio, se colocan en un gradiente poco profundo de AMPc, y las imágenes DIC se adquieren a 1 s / fotograma [Archivo adicional 1]. En esta célula representativa, se detectan 58 pseudópodos. La mayoría (60%, norte = 58) son efímero, durando no más de 7 s el resto longevo los pseudópodos duran al menos 9 sy representan más del 80% del total de actividades detectadas.

De nuestro análisis, está claro que los comportamientos de los pseudópodos individuales de larga vida varían drásticamente [Archivo adicional 2]. Los pseudópodos emergen a lo largo de la membrana, además, el ángulo de deriva de los pseudópodos también es notable [Archivo adicional 3]. Mientras que algunos (22%, norte = 23) los pseudópodos de larga vida permanecen cerca de la parte delantera o trasera de la celda, la mayoría (70%) se alejan de la parte delantera durante al menos la mitad de su vida. Cuando un pseudópodo se desplaza desde el frente hacia el costado o hacia atrás de la celda, generalmente pasa de la protrusión a la retracción. El tamaño de los pseudópodos también varía considerablemente, además, la duración de las actividades individuales de los mismos pseudópodos cambia con el tiempo [Archivo adicional 1].

A pesar de las enormes diferencias en posiciones y tamaños entre los pseudópodos longevos, la dinámica de su estado de protrusión / retracción se divide en tres patrones de actividad principales: protuberancias consistentes, retracciones consistentes o períodos alternos de protuberancias y retracciones (Figura & # x200B (Figura 5 y Adicional) archivo 4). La persistencia de estado promedio para esta celda es 0.80, lo que significa que los pseudópodos tienden a sobresalir o retraerse durante la mayor parte de su vida. Observamos que si un pseudópodo se extiende o se retrae depende del ángulo del pseudópodo en relación con el gradiente de quimioatrayentes. Los pseudópodos cerca del frente tienen una mayor probabilidad de mantener un crecimiento rápido (Figuras 5D, G). Esta probabilidad disminuye si el pseudópodo se aleja del frente (Figuras 5F, I). De manera similar, la probabilidad de retracción es baja en el frente de la célula, pero aumenta a medida que el pseudópodo se acerca a la espalda (Figuras 5E, H) Estas observaciones son consistentes con los resultados anteriores [27, 31].

Análisis de pseudópodos individuales. C.A. Dinámica de estado y ángulo para pseudópodos con protuberancias consistentes (A), retracciones consistentes (B) y protuberancias seguidas de retracciones (C). La película fue obtenida por cortesía de N. Andrew y R. H. Insall. Las imágenes muestran formas celulares superpuestas (desde el comienzo de cada pseudópodo) y trayectorias de actividad (rojo para protuberancias, azul para retracciones). Los números representan el tiempo (en segundos) desde el comienzo de la película. Los perfiles de actividad correspondientes en relación con el gradiente de quimioatrayentes se representan en D-F. En estos gráficos, los puntos rojos y azules representan protuberancias y retracciones, respectivamente, y las líneas verdes unen actividades provenientes del mismo pseudópodo. G-J. La dinámica del ángulo de todos los pseudópodos superpuestos por las direcciones del centroide de la celda (puntos celestes). Los pseudópodos con patrón de protrusión consistente, patrón de retracción consistente, protrusión seguida de patrón de retracción se destacan en el cuadro G-I, respectivamente. Todos los pseudópodos de vida corta se destacan en J.

Se ha informado que en Dictyostelium células quimiotácticas en gradientes poco profundos o que se mueven en ausencia de señales externas, las protuberancias recién generadas generalmente se separan de los pseudópodos existentes [4, 27]. Usando nuestro método, tanto el origen de un pseudópodo como el número de divisiones durante su vida se adquieren automáticamente [Archivo adicional 2]. Encontramos que el 74% de todos los pseudópodos se generan a partir de la división a una tasa promedio de una vez cada 2,3 segundos. Para los pseudópodos de larga vida, el 78% se genera a partir de la división, con una tasa promedio de una vez cada 5,6 segundos.

Los resultados publicados anteriormente sobre la cuantificación de las tasas de producción de pseudópodos han mostrado diferencias significativas. Utilizando la identificación manual, en promedio, se produce un nuevo pseudópodo cada 23 s para las células AX3 que se mueven en gradiente poco profundo [27]. Utilizando métodos automatizados basados ​​en las curvaturas locales de los límites muestreados, este número se reduce a alrededor de 14 s para las células AX3 en gradiente poco profundo y 13 s en ausencia de quimioatrayente [28, 32]. Aunque las condiciones experimentales pueden influir, es posible que esta discrepancia provenga de las diferentes formas de identificar pseudópodos. Para investigar esto, se examina la dinámica de pseudópodos de la misma célula AX3 en diferentes niveles (Figura & # x200B (Figura 6). 6). Primero, se selecciona el número más pequeño de pseudópodos que cubren no menos del 50% de todas las actividades de protrusión y retracción. Usando este criterio, solo se identifican siete pseudópodos de larga duración, de los cuales cinco contenían procesos de protrusión significativos. Estos pseudópodos dan una tasa de producción de

20 s por pseudópodo que sobresale, un número similar al obtenido mediante la identificación manual [27]. Cuando el nivel de porcentaje de actividad se establece en 60%, el número de pseudópodos detectados con protuberancias significativas aumenta a ocho. Estos tienen un intervalo medio de

Jerarquía de actividades de pseudópodos. Actividades de pseudópodos en función del tiempo, jerarquizadas. Los paneles muestran todos los pseudópodos que contribuyen del 50 al 100% de la actividad pseudópodo total de la célula. El esquema de color de la Figura 5D-F se aplica a todos los pseudópodos no incluidos en los paneles anteriores. Estos pseudópodos también se identifican con puntas de flecha.

Estadísticas para la caracterización de fenotipos

Para mostrar cómo se pueden utilizar nuestros métodos para distinguir diferentes cepas de células, películas de dos Dictyostelium cepas: se analizan AX3 y AX3: mutante tsuA. AX3: cepa tsuA, en la que el Dictyostelium homólogo de la quinasa fusionada TsuA se elimina de la línea parental AX3, se construye como se describió anteriormente [33]. Las células no desarrolladas de ambas cepas se colocan en el gradiente de ácido fólico liberado por una micropipeta que contiene ácido fólico 1 M. Las imágenes se capturan utilizando un objetivo de 60 & # x000d7 a 10 s / fotograma con una resolución espacial de 0,1852 & # x003bcm / píxel. Los comportamientos pseudópodos de las células individuales se calculan y comparan entre las dos cepas (Tabla & # x200B (Tabla3). 3). Las células AX3: tsuA muestran varios defectos de quimiotaxis cuando responden al ácido fólico. Uno de los más significativos (pag & # x0003c 0.05, prueba t de Student) el defecto es la capacidad de dividir pseudópodos: la proporción de pseudópodos recién generados que surgen de divisiones disminuye un 27% y la tasa de división disminuye un 36%. La otra discrepancia es la persistencia del estado. La persistencia de la protuberancia disminuye un 15% y la persistencia del estado general disminuye un 10% en las células AX3: tsuA. Estos datos sugieren que estas células tienen dificultades para generar protuberancias consistentes.La velocidad neta de los pseudópodos, que disminuye un 27%, también puede estar relacionada con la menor persistencia de protuberancias: los pseudópodos tienden a deambular en lugar de sacar la membrana muy lejos.

Tabla 3

Estadísticas de pseudópodos para diferentes cepas celulares.

Cepa celular(número de celdas / marcos)Promedio # de pseudo-vainas% de la divisiónPromedio tasa de división (# / min)Promedio persistenciaPromedio persistencia del estadoVelocidad media (& # x003bcm / min)
protr.recuperar. protr.recuperar.neto
AX3 (14/1075)significar4.2421.540.520.390.8210.89.37.8
ETS0.9100.670.060.040.062.22.52.2
AX3: tsuA
(8/756)
significar3.6310.990.440.390.749.37.45.7
ETS0.3100.310.050.040.081.81.31.1
pag-valor 0.070.020.040.010.940.010.120.050.02
AX2 (17/1043)significar2.9341.670.400.360.6716.811.38.5
ETS0.7141.090.090.080.138.44.23.1
AX2: dynhp ​​(9/869)significar2.8311.660.420.360.7210.28.66.6
ETS0.9151.070.070.050.102.21.51.5
pag-valor 0.670.560.980.540.910.350.030.080.095

Los comportamientos quimiotácticos de los desarrollados Dictyostelium También se comparan las células AX2, una cepa axénica de laboratorio, y las células AX2: dynhp, en las que la dinacortina, una proteína de reticulación de actina, es agotada por ARNi (Tabla & # x200B (Tabla3). 3). La cepa mutante se construye como se describió anteriormente [34]. Las células se colocan en el gradiente de AMPc liberado de una micropipeta que contiene AMPc 1 & # x003bcM. Las imágenes se capturan utilizando un objetivo de 40 & # x000d7 a 5 s / fotograma con una resolución espacial de 0,3077 & # x003bcm / píxel. Las células AX2: dynhp ​​no muestran una deficiencia de división obvia. La persistencia del estado también es comparable a la de las células de tipo salvaje. Sin embargo, esta cepa produce pseudópodos que sobresalen y se retraen más lentamente: la velocidad de protrusión disminuye un 39% (pag & # x0003c 0.05, prueba t de Student) y la velocidad de retracción disminuye un 24% (pag & # x0003c 0,1, prueba t de Student). La velocidad neta de los pseudópodos disminuye en consecuencia (pag & # x0003c 0,1, prueba t de Student).

Para contrastar la eficiencia del movimiento durante la quimiotaxis, es útil observar la distribución de ángulos de los pseudópodos. Se traza un histograma de ángulos de protrusión para cada una de las cuatro deformaciones descritas anteriormente y se ajusta una curva gaussiana para caracterizar la distribución (Figura & # x200B (Figura 7). 7). El ángulo medio de actividades indica si las células pueden detectar las señales externas y generar diferentes respuestas en la parte delantera y trasera, mientras que la varianza mide la eficiencia con la que se producen las actividades para permitir el movimiento dirigido del cuerpo celular. Los datos revelan que las células vegetativas AX3: tsuA no alinean sus protuberancias con el gradiente de quimioatrayentes. Por otro lado, las células AX2: dynhp ​​desarrolladas orientan sus protuberancias hacia arriba del gradiente, pero no tan eficientemente como sus respectivas células de control.

Distribuciones del ángulo de protrusión para diferentes cepas durante la quimiotaxis. Histograma del ángulo de protrusión (verde) ajustado por una curva gaussiana (línea roja) para las células AX3 vegetativas (A) y las células AX3: tsuA (B), tanto en el gradiente de ácido fólico liberado por una aguja [33] como en las para las células AX2 desarrolladas (C) y las células AX2: dynhp ​​desarrolladas (D), ambas en el gradiente de cAMP liberado por una aguja [34]. Los accesorios gaussianos producen diferentes valores de & # x000b1 STD promedio: -15,5 & # x000b0 & # x000b1 90,3 & # x000b0 para células AX3 vegetativas (A), 0,0 & # x000b0 & # x000b1 29,1 & # x000b0 para células AX2 desarrolladas (C ), -2,3 & # x000b0 & # x000b1 62,8 & # x000b0 para celdas desarrolladas AX2: dynhp ​​(D). El ajuste gaussiano para las células vegetativas AX3: tsuA no converge (B). Las comparaciones de otras estadísticas de pseudópodos entre estas cepas se resumen en la Tabla 3.

Correlación entre pseudópodos y localizaciones moleculares

Para investigar los impulsores moleculares de la formación de pseudópodos, se calcula la correlación entre el tiempo y la ubicación de las actividades de los pseudópodos con proteínas marcadas con fluorescencia. Se crea una cepa celular basada en AX3 donde la miosina-II se etiqueta con GFP y, simultáneamente, la dinacortina se etiqueta con mCherry. Al mismo tiempo, se confirma que ambas expresiones endógenas están completamente agotadas. Se acepta comúnmente que la miosina II se enriqueció en la parte posterior durante la quimiotaxis, generando fuerza contráctil en la espalda y presionando el cuerpo celular hacia adelante [7,35]. Por otro lado, la dinacortina se concentra normalmente en el borde de ataque donde se cree que coopera con la actina para influir en la viscoelasticidad cortical [34]. En nuestro estudio, las células desarrolladas se colocan en un gradiente de quimioatrayente y las imágenes de las células quimiotácticas se obtienen utilizando un microscopio de emisión dual (Figura & # x200B (Figura 8A). 8A). Las respectivas concentraciones fluorescentes se detectan alrededor de la membrana celular (Figuras 8B, D), y los pseudópodos se identifican y clasifican según se estén expandiendo o contrayendo (Figura & # x200B (Figura 8C). 8C). La mCherry-dinacortina se encuentra consistentemente en la parte frontal de la célula, alineada con el gradiente de quimioatrayentes. Por el contrario, la GFP-miosina-II se encuentra principalmente en el lateral.

Localizaciones de miosina y dinacortina en células quimiotácticas. Imágenes fluorescentes de una quimiotaxis. Dictyostelium célula que expresa mCherry-dinacortina y GFP-miosina-II. Se creó un gradiente de quimioatrayente utilizando una aguja de micropipeta a la izquierda, como se describió anteriormente [34]. Pequeñas flechas colocadas cerca de la membrana celular señalan las actividades pseudópodos. Los números en la esquina superior derecha representan el tiempo (en segundos) desde el comienzo de la película. La barra de escala representa 5 & # x003bcm. B, D. Intensidad fluorescente de mCherry-dinacortina (B) o GFP-miosina-II (D) en función del tiempo alrededor del perímetro celular para la celda en el panel A. Los datos se normalizan entre mínimo (0) y máximo ( 1). C. Actividad de pseudópodo en función del tiempo para la celda en el panel A usando el mismo esquema de color que en la Figura 5D-F. E. Correlaciones cruzadas entre las dos proteínas marcadas con fluorescencia y las actividades de protrusión o retracción en función del tiempo y el ángulo. Paneles izquierdos: promediados sobre 37 celdas Paneles derechos: promediados sobre 100 celdas. F. Cambios de la longitud de la protrusión o retracción local en un fotograma en función de la intensidad local de GFP-miosina-II (100 células, 4254 fotogramas) o mCherry-dinacortina (37 células, 1533 fotogramas). Las barras de error representan errores estándar.

Para determinar cómo estas localizaciones de proteínas se alinean con las actividades pseudópodos, se calculan las funciones de correlación cruzada (Ecuación 1) entre las dos intensidades fluorescentes y las actividades de protrusión o retracción (Figura & # x200B (Figura 8E). 8E). En casi todas las células que muestran buenas expresiones de mCherry, los picos en la concentración de dinacortina se produjeron al mismo tiempo y en el mismo lugar que las protuberancias. Por otro lado, las retracciones y las regiones de alta concentración de dinacortina tienen una correlación muy negativa. Para sondear aún más estas correlaciones, calculamos el coeficiente de correlación entre la fluorescencia de la dinacortina y la longitud de la actividad en 0,623 con un intervalo de confianza del 99% de 0,595 a 0,649 (Figura & # x200B (Figura9A). 9A). Por otro lado, cuando se compara con la fluorescencia en el otro lado de la celda (180 & # x000b0 de distancia), la correlación es negativa: -0,577 con un intervalo de confianza del 99% de -0,606 a -0,577 (Figura & # x200B (Figura 9B). 9B). Cuando se mide celda a celda, todas las celdas (norte = 37) tienen correlaciones positivas entre la duración de la actividad y la fluorescencia en el lugar de la actividad, y una correlación negativa con la actividad (180 & # x000b0 de distancia) (Figura & # x200B (Figura9C). 9C). La intensidad media de mCherry en el sitio de las protuberancias es significativamente mayor que en las retracciones (1,06 frente a -0,72 desviaciones estándar por encima de la intensidad media de fluorescencia en la periferia celular pag & # x0003c 10 -6, prueba t de Student).

Análisis de correlación entre actividades pseudopodiales y localización de proteínas. Gráfico de dispersión entre la duración de la actividad (la longitud positiva implica una protuberancia, la longitud negativa una retracción, medida en píxeles) y la dinacortina-mCherry (número de desviaciones estándar por encima de la fluorescencia media alrededor de cada célula) para todas las actividades tanto en el sitio de la actividad (A ) y 180 & # x000b0 de distancia (B). Se proporciona el coeficiente de correlación (& # x003c1) para cada parcela. Estos datos representan 3333 actividades en 37 celdas. C. Histograma para los coeficientes de correlación para cada celda en el sitio de la actividad (rojo) y 180 & # x000b0 de distancia (azul). D. Fluorescencia media de dinacortina-mCherry en los sitios de protuberancias y retracciones (las barras de error son SEM). E-H. Gráficos similares para miosina-II-GFP. Estos datos representan 9019 actividades en 100 celdas.

Un análisis similar de GFP-miosina-II revela que las concentraciones de miosina-II a lo largo de la membrana celular se correlacionan negativamente con las actividades de protrusión (Figura 9E-G). Sin embargo, la relación entre la miosina II y las retracciones es más compleja. En algunos casos (20%, norte = 100), la miosina II y las retracciones están altamente correlacionadas. Sin embargo, en la mayoría de los casos (60%), dos picos de alta correlación de miosina-II aparecen casi simétricamente con respecto a la línea 0 & # x000b0. En las celdas restantes se observan patrones irregulares, sin mostrar máximos o mínimos obvios. El promedio de GFP-miosina-II es significativamente mayor a 90 & # x000b0 de una retracción que en la retracción real (0,283 frente a -0,034 desviaciones estándar por encima de la intensidad media de fluorescencia en la periferia celular pag & # x0003c 10 -6, prueba t de Student) (Figura & # x200B (Figura9H). 9H). Por tanto, la relación entre la concentración de miosina-II y las actividades de retracción no puede describirse simplemente como correlacionada positiva o negativamente, sino que otros factores además de la contracción de la miosina-II, como la tensión cortical, pueden contribuir a la retracción del pseudópodo [7]. Para sondear más esta conexión, los cambios de longitud para todas las actividades de protrusión o retracción detectadas se representan gráficamente como una función de las intensidades de fluorescencia local (Figura & # x200B (Figura 8F). 8F). Se observa un rango de intensidades donde la longitud de las protuberancias disminuye casi linealmente con el aumento de la intensidad de GFP-miosina-II. Por otro lado, las longitudes de las retracciones aumentaron con la intensidad de la miosina-II, pero con una pendiente mucho menor (Figura & # x200B (Figura 8F). 8F). Juntos, estos datos sugieren que el papel de la miosina-II no es solo crear retracciones, sino suprimir las protuberancias laterales. Curiosamente, aunque la velocidad de protrusión en las células AX2: dynhp ​​es considerablemente menor que la de las células de control (Tabla & # x200B (Tabla3), 3), la presencia localizada de mCherry-dinacortina no contribuyó en gran medida a la longitud de la protuberancia, pero la longitud de retracción disminuyó con el aumento de la concentración de dinacortina en la membrana.


Detección y esqueletización de neuronas individuales e inyecciones de trazadores mediante métodos topológicos

El análisis de datos neurocientíficos se ha basado tradicionalmente en el álgebra lineal y la teoría de procesos estocásticos. Sin embargo, las formas arbóreas de las neuronas no se pueden describir fácilmente como puntos en un espacio vectorial (la sustracción de dos formas neuronales no es una operación significativa), y los métodos de topología computacional se adaptan mejor a su análisis. Aquí presentamos métodos de la teoría de Morse discreto (DM) para extraer los esqueletos de árbol de neuronas individuales a partir de datos de imágenes cerebrales volumétricas y para resumir colecciones de neuronas marcadas por inyecciones de trazadores. Dado que las neuronas individuales son topológicamente árboles, es sensato resumir la colección de neuronas utilizando una forma de árbol de consenso que proporcione un resumen de información más rico que el enfoque tradicional de "matriz de conectividad" regional. El enfoque de DM conceptualmente elegante carece de parámetros ajustados a mano y captura las propiedades globales de los datos a diferencia de los enfoques anteriores que son inherentemente locales. Para la esqueletización individual de neuronas escasamente etiquetadas, obtenemos ganancias sustanciales de rendimiento sobre los métodos no topológicos de última generación (más del 10% de mejoras en precisión y corrección de pruebas más rápida). El resumen del árbol de consenso de las inyecciones de trazador incorpora la información de la matriz de conectividad regional, pero además captura los patrones de ramificación colaterales colectivos del conjunto de neuronas conectadas al sitio de inyección y proporciona un puente entre la morfología de una sola neurona y los datos de inyección de trazador.


Creación de perfiles y redes de científicos (SNAP)

Científico Principal
Jefe - Laboratorio de Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa (TERM)
Director científico - Núcleo de servicios de investigación clínica
Presidente - Comités Institucionales de Bioseguridad de Nemours
Director de desarrollo profesional del programa ACCEL de investigación clínica y traslacional de Delaware
Director de Investigación, Delaware INBRE

Científico Principal
Director, Centro de Ped Clin Res and Develop
Jefe de Investigación de Medicina Regenerativa y Ingeniería de Tejidos
Profesor adjunto, Univ of DE

Tengo más de 25 años de experiencia en investigación en el Hospital de Niños Nemours - Alfred I. duPont, la institución de origen del PNT. Actualmente, soy Científico Principal (Profesor Titular), Jefe de Ingeniería de Tejidos e Investigación en Medicina Regenerativa y Director del Centro de Investigación y Desarrollo Clínico Pediátrico. Mi investigación se centra en la medicina regenerativa y el desarrollo de terapias de precisión con un énfasis particular en biomateriales instructivos y receptivos que pueden ajustarse individualmente para uso terapéutico. También tengo una experiencia significativa en el desarrollo e implementación de diagnósticos biomoleculares y ndash, incluido el uso clínico de niveles de péptidos natriuréticos de tipo b en pacientes de cirugía cardiovascular y, más recientemente, el uso potencial de biomarcadores epigenéticos para identificar niños con encefalopatía estática y espasticidad asociada con enfermedades cerebrales. parálisis.

Mi trabajo como Director del Centro de Investigación y Desarrollo Clínico Pediátrico se centra en la integración de la investigación en el entorno clínico-académico y en el desarrollo de científicos clínicos y traslacionales. Tengo una experiencia significativa en la creación de programas de premios piloto, desarrollo profesional y mentores exitosos en Delaware, y actualmente me desempeño como Director del Núcleo de Desarrollo Profesional para el Programa CTR ACCEL de Delaware financiado por IDeA (CTR U54 GM104941). También ocupo puestos de liderazgo o asesoría en INBRE, ECHO y tres programas COBRE en el estado. En conjunto, mis funciones con los programas respaldados por CTR, INBRE, ECHO y COBRE han permitido el desarrollo de infraestructura de apoyo para la ciencia clínica y traslacional en las principales instituciones de investigación y educación del estado. Estos puestos y programas proporcionarán a los investigadores del PNT conexiones sustanciales con recursos y oportunidades.

También tengo un interés de larga data en terapias de precisión y enfoques teranósticos para pacientes de cirugía pediátrica, especialmente para ayudar a niños con enfermedades congénitas y adquiridas que requieren múltiples procedimientos quirúrgicos. Este esfuerzo ha abarcado múltiples disciplinas clínicas y básicas que incluyen ingeniería de materiales, ciencias biológicas, cirugía, ciencia cardiovascular, imágenes avanzadas y diseño de estudios preclínicos. Tengo una amplia experiencia en fisiología celular y biología molecular, metodologías de mono y cocultivo 3D, análisis biomoleculares, modalidades de imágenes de células y tejidos y el uso de biomateriales. Además, mis puestos en Nemours y dentro de DE-INBRE y CTR me brindan numerosas oportunidades para asociarme con médicos e investigadores básicos. Entre estas fructíferas colaboraciones, mi grupo ha podido desarrollar y comenzar las pruebas preclínicas de materiales avanzados a base de hidrogel para mejorar la curación posquirúrgica. Estos estudios están representados en los siguientes manuscritos:

  1. Mahadevaiah, S., Robinson, K.G., Kharkar, P.M., Kiick, K.L., Akins, R.E. La disminución del módulo de matriz de los hidrogeles de PEG induce un fenotipo vascular en las células madre de la sangre del cordón umbilical humano. Biomateriales (2015) 62: 24-34. PMID: 26016692 PMCID: PMC4470844.
  2. Scott, R.A., Kharkar, P.M., Kiick, K.L. y Akins R.E. La sensibilidad de los fibroblastos de la adventicia aórtica a los inhibidores de la proteína quinasa activada por mitógenos depende de la rigidez del sustrato. Biomateriales (2017) 137: 1-10. PMID: 28527302 PMCID: PMC5554066.
  3. Robinson, K.G., Scott, R.A., Hesek, A.M., Woodford, E.J., Amir, W., Planchon, T.A., Kiick, K.L. y Akins, R.E. La elasticidad arterial reducida debido a la esqueletización quirúrgica mejora con el hidrogel abluminal de PEG. Bioingeniería y Medicina Traslacional (2017). 2 (2): 222-232. PMID: 28932820 PubMed Central PMCID: PMC5579730.
  4. Greco, C.T., Akins, R.E., Epps, T.H. y Sullivan M.O .. Atenuación de respuestas desadaptativas en fibroblastos adventicios aórticos a través de la liberación de ARNip activada por estímulos a partir de nanocomplejos de lípidos y polímeros. Biosistemas avanzados. (2017). PMCID: pendiente.

1992 & ndash & rsquo95 Investigador asociado postdoctoral, Departamento de Cirugía Ortopédica, Universidad Thomas Jefferson, Filadelfia, PA y Departamento de Investigación Médica, Nemours & ndash Alfred I. duPont Hospital for Children, Wilmington, DE.

1993 Científico visitante, Departamentos de Investigación en Cardiología y Farmacología, Hospital Nacional Chubu, Obu-shi, Aichi-ken, Japón.

1995 & ndash & lsquo97 Investigador científico asistente (profesor asistente), Departamento de Investigación Médica, Hospital Nemours & ndash Alfred I. duPont para Niños, Wilmington, DE.

1996 & ndash & lsquo97 Jefe interino de Investigación de Regeneración Muscular, Departamento de Investigación Médica, Clínica Nemours Children & rsquos / Hospital de Niños Alfred I. duPont, Wilmington, DE.

1997 & ndash & lsquo03 Investigador científico (profesor asociado)

1997 y ndash pres. Jefe de Investigación en Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa, Nemours & ndash Alfred I. DuPont Hospital for Children, Wilmington, DE.

1998 & ndash & lsquo04 Facultad, Programa de Ingeniería Celular y de Tejidos, Facultad de Estudios de Posgrado, Universidad Thomas Jefferson, Filadelfia, PA.

2004 y ndash pres. Profesor adjunto adjunto, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Delaware, Newark, DE.

2005 & ndash & lsquo12 Investigador científico sénior (profesor titular), Nemours & ndash Alfred I. DuPont Hospital for Children, Wilmington, DE.

2007 y ndash pres. Profesor adjunto, Departamento de Ingeniería en Ciencia de Materiales, Universidad de Delaware, Newark, DE.

2007 & ndash & lsquo14 Jefe de Investigación de Diagnóstico Cardíaco (CLIA ID 08D1071151).

2009 y ndash pres. Director, Centro de Investigación y Desarrollo Clínico Pediátrico, Investigación Biomédica Nemours, Hospital de Niños Alfred I. duPont, Wilmington, DE.

2013 y ndash pres. Profesor adjunto, Ingeniería Biomédica, Universidad de Delaware, Newark, DE.

2013 y ndash pres. Investigador científico principal (profesor titular), Nemours & ndash Alfred I. DuPont Hospital for Children, Wilmington, DE.

2002- Miembro de la American Heart Association, Council on Cardio-Thoracic and Vascular Surgery. 2004- Consejo editorial, ADN y biología celular, Mary-Ann Liebert, Inc. 2007- Consejo editorial, Medicina clínica: Pediatría, Libertas Academica Press.2008- Consejo científico asesor, Fundación Pelizaeus-Merzbacher. 2009- Consejo Asesor Científico, Univ. of Dela., Programa de Biología Cuantitativa. 2010- Comité Editorial, Revista Internacional de Ingeniería de Tejidos, Hindawi Press. 2011-2012 Sección de estudios de los NIH: Biomateriales y biointerfaces (BMBI) 2011-2012 Sección de estudios de los NIH: Sistemas microfisiológicos (ZRG1 BST-N (50)) 2011-2012 Sección de estudios de VA: Investigación de rehabilitación y desarrollo de amplificadores: Medicina regenerativa (RRD0) 2012 NIH Sección de estudio: Transformative R01s (BCMB-A & ndash mail reviewer) 2012- Junta asesora externa, Premio COBRE del Centro de Investigación en Neurociencia de Delaware.

Consejo de la Asociación Estadounidense del Corazón sobre Ciencias Cardiovasculares Básicas

Consejo de la Asociación Estadounidense del Corazón sobre Cirugía Cardio-Torácica y Vascular

Consejo de la Asociación Estadounidense del Corazón sobre Enfermedades Cardiovasculares en los Jóvenes

Sociedad de Ingeniería Biomédica

Sociedad de Ingeniería de Tejidos Sociedad Internacional de Neurociencia

Honores recientes y becas profesionales

2002-pres. Miembro de la Asociación Estadounidense del Corazón, Consejo de Cirugía Cardiovascular y Anestesia (Miembro inaugural).

2008-pres. Consejo Asesor Científico, Fundación Pelizaeus-Merzbacher.

2009-pres. Consejo Asesor Científico, Univ. of Dela., Programa de Biología Cuantitativa.

2012-pres. Consejo Asesor Externo, Premio COBRE del Centro de Investigación en Neurociencia de Delaware.

Premio 2012 de la Cumbre de Investigación Delaware INBRE.

2013-pres. Miembro de la Academia Estadounidense de Parálisis Cerebral y Medicina del Desarrollo.

2013 Neurocientífico del año, Sociedad de Neurociencia de Delaware.

2014 Nemours - Premio al Investigador del Año del Valle de Delaware.

2017 Session Chair for Cardiovascular Engineering: Cardiovascular Devices en la reunión anual de la National Biomedical Engineering Society. Phoenix, AZ.

PRINCIPALES INTERESES DE INVESTIGACIÓN

Terapias regenerativas para enfermedades adquiridas y congénitas en niños.

Tejidos biosintéticos para investigación, pruebas farmacológicas e implantación.

Biomateriales instructivos celulares.

Administración de fármacos con materiales diseñados para mejorar la adherencia a largo plazo.

Diagnóstico, biomarcadores y cribado avanzados.

  1. Wee J, Rahman T, Seliktar R, Akins R, Levine D, Richardson D, Dodge GR, Thabet AM, Holmes L, Mackenzie WG. (2010) Force feedback en el alargamiento de extremidades. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1:5109-12.
  2. Robert E. Akins Jr., Danielle Rockwood, Karyn G. Robinson, Daniel Sandusky, John Rabolt, Christian Pizarro. (2010) El cultivo tridimensional altera el fenotipo de células cardíacas primarias. Ingeniería de tejidos Parte A. 16(2): 629-641.
  3. Modla S, Mendonca J, Czymmek KJ, Akins RE. (2010) Identificación de uniones neuromusculares mediante microscopía electrónica confocal y de transmisión correlativa. Métodos de J Neurosci. 30 de agosto de 2010, 191 (2): 158-65.
  4. Wee J, Rahman T, Akins RE, Seliktar R, Levine DG, Richardson DW, Dodge GR, Thabet AM, Holmes L, Mackenzie WG. (2010) Uso de fuerzas de distracción para impulsar un autodistractor durante el alargamiento de la extremidad. Med Ing Phys. 2011 Oct33 (8): 1001-7
  5. Rahman, T., Akins, RE, Wee, J. y Mackenzie, W. (2011), Medición continua de la fuerza en el alargamiento de las extremidades. J Bioingeniero. & amp biomédico. Ciencia. 1 (2): dx.doi.org/10.4172/2155-9538.1000104.
  6. Akins, R. y Rabolt, J. (2011) Fundamentos y aplicaciones del electrohilado. en Ciencia de los biomateriales: una introducción a los materiales en medicina. Ed: Ratner, Hoffman, Schoen y Lemons.
  7. Baldwin, A., Robinson, KG, Militar, JL, Derby, CD, Kiick, KL y Akins, RE. (2012) Hidrogeles de poli (etilenglicol) que contienen heparina reticulables in situ para la liberación sostenida de anticoagulantes J. Biomed. Mater. Res - A.
  8. Robinson, KG, Nie, T., Baldwin, A., Yang, E., Kiick, KL y Akins, RE. (2012) Efectos diferenciales del módulo de sustrato en células endoteliales vasculares, músculo liso y fibroblásticas humanas. J. Biomed. Mater. Res - A.
  9. Barthold, JS, Wang, Y, Reilly, A, Robbins, A, Figueroa, TE, BaniHani, A, Hagerty, J y Akins, RE (2012) Expresión reducida del receptor de andrógenos y el ARNm de cadena pesada de miosina en el músculo cremaster de niños con criptorquidia no sindrómica. J. Urología.
  10. Robinson, KG, Mendonca, J, Militar, J, Theroux, M, Dabney, K, Shah, S, Miller, F y Akins, RE. (en revisión) Alteración de los componentes de la lámina basal en las sinapsis neuromotoras de niños con parálisis cerebral cuadripléjica espástica. Más uno.

2013 & ndash & rsquo18 Institutos Nacionales de Salud (NIGMS). Responsable de actividad de componente clave en U54-GM104941 (PI: Binder-Macleod) Centro de Delaware para la investigación clínica y traslacional Investigador principal en KCA 3.2 & ndash Mentoring, Education, and Career Development Core.

2013 & ndash & rsquo17 (nce) Institutos Nacionales de Salud (NHLBI). Investigador principal en R01-HL108110: Materiales instructivos celulares para la ingeniería de injertos vasculares.

2014 & ndash & rsquo19 Institutos Nacionales de Salud (NIGMS). Director de Investigación y Desarrollo Profesional para el Programa de Proyectos de Investigación del Desarrollo en P20-GM103446 (IP general: Stanhope) Red IDeA de Delaware de Excelencia en Investigación Biomédica. Se trata de una subvención de infraestructura para apoyar el desarrollo de la investigación en el estado de Delaware.

2016 & ndash & rsquo21 Institutos Nacionales de Salud (NIGMS). Miembro del Consejo de Resultados que Importan y del Comité Directivo del sitio Delaware Nemours - duPont Hospital for Children para la red de ensayos clínicos pediátricos de los estados IDeA, que forma parte del Programa NIH-Environmental Influences on Child Health Outcomes (ECHO) (Nemours PI: Judith Ross).

2016 & ndash & rsquo18 Delaware Bio Center for Applied Technologies. CoPI (con Erin Crowgey) para trabajar en conjunto con Genome Profiling LLC para desarrollar biomarcadores que puedan identificar a pacientes con parálisis cerebral espástica.

2017 & ndash & rsquo18 PI de la Academia Estadounidense de Parálisis Cerebral y Medicina del Desarrollo (AACPDM) en subvención para evaluar biomarcadores en pacientes con parálisis cerebral discinética o atáxica.

1993 & ndash & lsquo95 Premio Asociado de Investigación en Biología Espacial de la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio. SBRA93-15: & ldquoLos ​​efectos de la microgravedad simulada en las funciones contráctiles de los miocitos cardíacos cultivados. & Rdquo Subvención total de $ 42,000 (2 años).

1994 & ndash & lsquo95 American Heart Association, filial de Delaware, Beginning Grant in Aid. Investigador principal de la subvención 9406244S: & ldquoLos ​​efectos de la ferriprotoporfirina IX en las funciones contráctiles de los cardiomiocitos cultivados. & Rdquo Subvención total de $ 27,747 (por año).

1997 y ndash y lsquo99. Premio RPG de la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio, co-investigador principal (con Charles Hartzell) en NAG9-656: & ldquoAssembly of cardiac structure in microgravity using the shuttle mid-deck locker BSTC. & Rdquo Grant general of $ 226,600 (over 3 years).

2000 & ndash & rsquo01 Premio de la Fundación Nemours. Co-investigador (PI fue Randy Brenn) en W20.8655: & ldquoTEG, parámetros de coagulación y volumen de sangre en niños con escoliosis durante la PSF. & Rdquo Subvención total para PI de $ 15,396 (por año).

2000 & ndash & rsquo01 Premio de la Fundación Nemours. Co-investigador principal (con Kirk Dabney) en el documento W20.8651: & ldquoUn modelo in vitro para la muerte neuronal tardía después de una lesión mecánica & rdquo Subvención total de $ 24,991 (por año).

2000 & ndash & lsquo01 Premio de la Fundación Nemours. Co-investigador principal (con Marshall Schwartz y Richard Mainwaring) en W20.8639: & ldquoIngeniería tisular de construcciones cardíacas implantables & rdquo Subvención total de $ 119,635 (durante 2 años).

2000 & ndash & rsquo01 Premio de la Fundación Nemours. Co-investigador principal (los IP fueron Robert Akins y Mary Theroux) en W20.8642: & ldquoReceptores de acetilcolina extrauncionales en la parálisis cerebral & rdquo Subvención total de $ 54,856 (durante 2 años).

2001 & ndash & lsquo03 Premio de la Fundación Nemours. Co-investigador (PI fue Jim Sylvester) en C20.8854: & ldquoThe papel de la síntesis de proteínas mitocondriales en el desarrollo del corazón humano. & Rdquo Subvención total otorgada a PI $ 193,894 (durante 2 años).

2001 & ndash & lsquo03 Premio de la Fundación Nemours: Co-investigador principal (los investigadores principales fueron Robert Akins y Vicky Funanage) en el documento W20.8679: & quot; Factores de transcripción y malformaciones cardíacas humanas & quot.

2001 & ndash & lsquo05 Premio RPG de la Administración Nacional de Aeronáutica y del Espacio. Investigador principal en subvención para NRA00-HEDS03: & ldquoCell: ensamblaje de tejido cardíaco mediado por células en entornos de microgravedad. & Rdquo Subvención total de $ 499,000 (más de 3.5 años).

2003 & ndash & rsquo05 Premio de la Fundación Nemours: Co-investigador principal (los investigadores principales fueron Robert Akins y Christian Pizarro) sobre & ldquofactores neurohormonales en pacientes con Fontan & rdquo. Beca total de $ 24,000 (por año).

2003 & ndash & lsquo05 Premio de la Fundación Nemours: Co-investigador principal (los investigadores principales fueron Robert Akins y Mary Theroux) en & ldquoNeuromuscular Junctions in Cerebral Palsy & rdquo. Beca total de $ 129,000 (durante 2 años).

2003 - & rsquo05 Premio de la Fundación Nemours: Co-investigador (con William Mackenzie) sobre & ldquoFuerza-control de alargamiento de extremidades & rdquo Subvención total de $ 23,300 (por año).

2004 & ndash & rsquo09 Institutos Nacionales de Salud (NCRR). Co-Investigador, mentor y personal administrativo en 1P20 RR020173-01: Una subvención del Centro de Excelencia en Investigación Biomédica titulada & ldquoCenter for Pediatric Research & rdquo (los PI fueron Thomas Shaffer y Carolyn Schanen PI). Subvención total otorgada a PI de $ 9,8 millones (durante 5 años).

2006 & ndash & rsquo08 Afiliado de PA / DE de la American Heart Association. Co-investigador en 0665433U: El papel de la fibulina-2 en la transición de la hipertrofia compensadora al remodelado ventricular. (Andy Tsuda era PI). Subvención total otorgada a PI de $ 100,000 (durante 2 años).

2007 & ndash & rsquo12 Institutos Nacionales de Salud (NICHD). Co-investigador en 1R01 HD-037874: Investigación dirigida de MeCP2 en el síndrome de Rett (Carolyn Schanen era IP). Subvención total otorgada a PI de $ 200,000 (por año).

2007 & ndash & rsquo10 Institutos Nacionales de Salud (NICHD). Investigador principal en 1R03 HD-051738 Uniones neuromusculares en parálisis cerebral (IP fue Robert Akins). Concesión de subvención total de $ 100,000 (durante 2 años).

2008 & ndash & lsquo10 Premio de la Fundación Nemours: Co-investigador principal (los investigadores principales fueron Robert Akins y Christopher Derby) en & ldquoTime-liberada LMWH para terapia de anticoagulación & rdquo Beca total de $ 129,000 (durante 2 años).

2009 & ndash & lsquo14 Institutos Nacionales de Salud (NCRR). Investigador principal en el subproyecto cubierto por P20 RR016472-10 una subvención INBRE de Delaware (el IP objetivo fue Robert Akins el IP general fue David Weir). Subvención total otorgada a PI de $ 20 millones (durante 5 años).

2010 & ndash & lsquo15 Institutos Nacionales de Salud (NCRR / NIGMS). Co-Investigador, mentor y Director Científico del Centro de Servicios de Investigación Clínica en 1P20 RR020173-01: Una subvención del Centro de Excelencia en Investigación Biomédica titulada & ldquoCenter for Pediatric Research & rdquo (Thomas Shaffer y Carolyn Schanen eran IPs). Subvención total otorgada a PI de $ 10 millones (durante 5 años).

2010 & ndash & rsquo15 Institutos Nacionales de Salud (NICHD). Co-investigador en R01 HD060769-01A1: Bases genéticas de la criptorquidia. (Julia Barthold era investigadora privada). Subvención total otorgada a PI de $ 1.25 millones (durante 5 años).

2011 & ndash & rsquo14 Delaware Health Science Alliance. Co-investigador en un premio educativo para desarrollar e implementar un curso de inmersión clínica para estudiantes de ingeniería biomédica.

2012 y ndash & rsquo17 Swank Foundation. Investigador principal en 32-02669-011: Depósito de tejidos neuro-ortopédicos. Subvención total de $ 500,000.

2012 & ndash & rsquo17 Institutos Nacionales de Salud (NIGMS). Miembro de la Junta Asesora Externa de P20 GM103653: Centro de Investigación en Neurociencia de Delaware.

Red de ensayos pediátricos 2013 & ndash & lsquo17 (NICHD & ndash Duke University Centered Network). Investigador principal del sitio.


Esqueletización en el espacio - Biología

Espacio de orientación de resolución adaptable

Las imágenes microscópicas de estructuras citoesqueléticas, nucleoesqueléticas y otras estructuras filamentosas contienen uniones complejas en las que se superponen múltiples filamentos con orientaciones distintas; sin embargo, el software de última generación generalmente utiliza análisis de orientación única para segmentar estas estructuras. Describimos un enfoque de análisis de imágenes para segmentar simultáneamente las estructuras filamentosas y sus intersecciones (de geometría arbitraria) en imágenes de microscopía, basado en la resolución analítica de múltiples orientaciones coincidentes en el filtrado de imágenes de una manera que equilibre la resolución de la orientación y la localización espacial.

"Análisis adaptativo de resolución de orientación múltiple de imágenes de redes filamentosas complejas"

Mark Kittisopikul 1,2, Amir Vahabikashi 2, Takeshi Shimi 2,3, Robert D. Goldman 2 y Khuloud Jaqaman 1,4

  1. Departamento de Biofísica, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX 75390
  2. Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Facultad de Medicina Feinberg, Universidad Northwestern, Chicago, IL 60611
  3. Instituto de Investigación Innovadora, Instituto de Tecnología de Tokio, Yokohama, Japón
  4. Departamento de Bioinformática, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX 75390
  • Caja de herramientas de optimización
  • Caja de herramientas de procesamiento de señales
  • Caja de herramientas de procesamiento de imágenes
  • Caja de herramientas de estadísticas y aprendizaje automático
  • Caja de herramientas de ajuste de curvas
  • Caja de herramientas de bioinformática
  • Caja de herramientas de computación paralela
  • Servidor de computación distribuida MATLAB

Git (versión 2.2 o posterior) para la instalación (como alternativa, descargue un archivo zip)

Tiempo de instalación típico: 5 minutos

Hay varias opciones para instalar el software.

Instalación de la interfaz gráfica de usuario en MATLAB:

Los siguientes métodos no requieren una instalación de MATLAB existente.

Instalador ejecutable independiente

  1. Descarga AROS_Installer_web.exe
  2. Ejecute el instalador que descargará MATLAB Compiler Runtime 2017a (

Archivo ZIP ejecutable independiente

  1. Descarga standaloneAROS.zip
  2. Descomprime los archivos
  3. Descargue e instale MATLAB Compiler Runtime 2017a desde http://www.mathworks.com/products/compiler/mcr/index.html

Una interfaz gráfica de usuario ahora permite el análisis de fotogramas individuales de cualquier bioimagen compatible con Bio-Formatos 5.9.2

  1. Primero seleccione un archivo de bioimagen seleccionando el botón "Buscar archivo de imagen".
  2. Si hay varias imágenes dentro del archivo, use los controles giratorios z, cyt para seleccionar el plano deseado del archivo de imagen para analizar.
  3. Presione el botón "Vista previa de la máscara" para mostrar la máscara que utilizará el software de análisis.
  4. Si la máscara es más pequeña que el área de análisis deseada, realice una o más de las siguientes acciones para aumentar el radio del disco de dilatación de la máscara para aumentar el área de análisis y / o seleccionar la casilla de verificación "Rellenar agujeros en la máscara".
  5. Seleccione "Ejecutar análisis" para iniciar el proceso de análisis.
  6. Los datos se guardarán en AROS_Output.mat

  1. Ajuste el orden para seleccionar la resolución de orientación más alta. Una resolución de orientación más alta permitirá que los ángulos se separen más claramente con el costo potencial de la localización espacial. Una resolución de orientación más baja ayudará a confinar espacialmente el análisis.
  2. Ajuste sigma para ajustar el ancho del filtro. Un ancho menor permitirá que el análisis descubra líneas más finas. Un ancho mayor enfocará el análisis en líneas más largas.
  3. Cambiar el método de umbral a Rosin producirá mejores umbrales para imágenes con histogramas unimodales.
  4. Cambiar el tipo de máscara permite un control explícito sobre la máscara: 4a. Seleccione el tipo de máscara "Máscara de ROI" y luego seleccione "Buscar máscara" para restringir el análisis a un área en particular utilizando una imagen binaria externa donde los píxeles blancos indican el área de interés. 4b. Seleccione el tipo de máscara "Máscara NLMS" para establecer directamente el área de análisis utilizando una imagen binaria externa donde los píxeles blancos indican el área a analizar. 4c. Seleccione el tipo de máscara "Sin máscara" para analizar la imagen completa. Esto puede ralentizarse si la imagen es grande.

Realice una segmentación espacial de orientación de resolución adaptativa. Esta es la función principal del controlador que realiza la segmentación completa como se describe en la Sección S6 y se ilustra en la Figura S4.

ENTRADA BÁSICA (ARGUMENTOS ORDENADOS)

La única entrada requerida es una imagen 2D. Las otras dos entradas básicas, que son opcionales, permiten la personalización del análisis.

ENTRADAS AVANZADAS (PARÁMETROS CON NOMBRE)

MÁS ENTRADAS AVANZADAS: ENTRADAS DE NO SERIALIZACIÓN (PARÁMETROS NOMBRADOS)

Estos parámetros permiten parte de la salida en la estructura otro, a continuación, para retroalimentar la función para obtener el resultado completo de la función. El propósito de esto es que la salida completa se pueda regenerar a partir de un subconjunto de la salida que se haya guardado en el disco, o serializado de otra manera, sin la necesidad de un recálculo completo.

Consulte SALIDA para obtener descripciones detalladas de lo anterior.

También tenga en cuenta que el StructExpand opción de la incorporada inputParser se establece en verdadero, lo que significa que los parámetros nombrados se pueden pasar usando una estructura.

El resultado principal de la función es la segmentación ponderada por respuesta como se describe en la Sección S6. Esta es la tercera salida, nms, como se describe abajo. Para una segmentación binaria, el mapa 2D nms se puede establecer como umbral mediante un único umbral (p. ej., nms & gt 0) o mediante un mapa de umbrales como meanResponse o atenuadoMeanResponse en la estructura de salida otro.

Junto con esto, las orientaciones, theta, y correspondiente respuesta valores en K = Kmetro se proporcionan como la segunda y la primera salida, respectivamente. Estos facilitan el uso de la función como detector de orientación. Esto pretende imitar las salidas proporcionadas por la función SteerableDetector MATLAB disponible de François Aguet o como parte del software de análisis de filamentos.

La cuarta salida, angularResponse, son las respuestas de orientación muestreadas en K = Kh y nuevamente está destinado a ser compatible con steerableDetector. los angularResponse se puede utilizar para construir un OrientationSpaceResponse debajo. Esto se puede utilizar para realizar un análisis más detallado del espacio de orientación, incluso para resoluciones más bajas (K & lt Kh).

La quinta salida, otro, es una estructura que contiene campos que hacen referencia a resultados intermedios creados a lo largo del proceso de análisis. Es importante destacar que contiene información sobre las tres ramas de AR-NLMS empleadas para la segmentación. Debido a las proyecciones de respuesta máxima realizadas en varias etapas del algoritmo, esta información no se extrae fácilmente de los resultados anteriores. La información en otro se puede utilizar para determinar en qué paso del procedimiento se agregó o excluyó un píxel del resultado final. Además, la información de orientación podría usarse para operaciones de localización más precisas.

En resumen, las salidas permiten un uso básico como esquema de segmentación (nms) y detector de orientación (respuesta, theta, angularResponse), y para uso avanzado como rutina intermedia para un análisis más detallado de las características de resolución múltiple identificadas (otro).

OrientationSpaceFilter representa un filtro polar separable en el dominio de Fourier. SteerableAdaptiveResolutionOrientationSpaceDetector lo usa internamente, pero se puede usar de forma independiente.

  • f_c es la frecuencia central del filtro
  • b_f es el ancho de banda de frecuencia
  • K es el orden del filtro que determina la resolución de orientación
  • K_f es el orden de frecuencia radial, f_c ^ 2 / b_f ^ 2. Este es 1 en este trabajo.

Los siguientes dos ejemplos son equivalentes con f_c = b_f = 1 / (4 * pi), K_f = 1 y K = 8

R es un OrientationSpaceResponse instancia de objeto

Configuración y visualización sin imagen

OrientationSpaceResponse representa una respuesta de filtro. SteerableAdaptiveResolutionOrientationSpaceDetector lo usa internamente, pero se puede usar de forma independiente para examinar la respuesta del filtro.

Un objeto de respuesta es normalmente creado por un OrientationSpaceFilter como arriba.

Obtenga los máximos locales de orientación de la cresta, la respuesta y la supresión de máximos no locales

Obtener respuesta en K = 3 y supresión máxima no local

Obtener la derivada de la respuesta con respecto a la orientación.

Copyright (C) 2019, Jaqaman Lab - UT Southwestern, Goldman Lab - Northwestern

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Debería haber recibido una copia de la Licencia Pública General GNU junto con AdaptiveResolutionOrientationSpace. De lo contrario, consulte http://www.gnu.org/licenses/.


Esqueletización en el espacio - Biología

En este artículo veremos cómo podemos hacer la esqueletización de la imagen mediante el adelgazamiento en mahotas. La esqueletización es un proceso para reducir las regiones de primer plano en una imagen binaria a un remanente esquelético que preserva en gran medida la extensión y conectividad de la región original mientras desecha la mayoría de los píxeles de primer plano originales. El adelgazamiento es una operación morfológica que se utiliza para eliminar píxeles de primer plano seleccionados de imágenes binarias, algo así como erosión o apertura.

En este tutorial usaremos la imagen “lena”, a continuación se muestra el comando para cargarla.

Para hacer esto usaremos el método mahotas.thin

Sintaxis: mahotas.thin (img)

Argumento : Toma el objeto de imagen como argumento

Regreso : Devuelve objeto de imagen

Nota : La imagen de entrada debe filtrarse o cargarse en gris


Abstracto

Una de las películas de Langmuir-Blodgett más simples es una pila de capas de ácidos grasos unidas por cationes divalentes. Una cierta fracción de ácidos grasos permanece protonada, una cantidad dictada por las condiciones de la subfase acuosa durante la deposición de la película, estas películas están compuestas por dos componentes con diferentes solubilidades en disolventes orgánicos. Investigamos el llamado proceso de esqueletización que ocurre cuando las multicapas de ácido behénico se sumergen en benceno. En particular, utilizamos una microbalanza de cristal de cuarzo para medir la pérdida de masa de la película y descubrimos que concuerda bien con la cantidad de ácido protonado en la película original. También utilizamos la microbalanza de cristal de cuarzo para investigar las propiedades de absorción de vapor en equilibrio de las películas no modificadas y las comparamos con las de las películas esqueletizadas. Ambos tipos de películas absorben casi la misma cantidad de agua pero absorben cantidades claramente diferentes de vapores orgánicos seleccionados.


Contenido

Los ejemplos de entrenamiento son vectores en un espacio de características multidimensional, cada uno con una etiqueta de clase. La fase de entrenamiento del algoritmo consiste solo en almacenar los vectores de características y las etiquetas de clase de las muestras de entrenamiento.

En la fase de clasificación, k es una constante definida por el usuario, y un vector sin etiqueta (una consulta o punto de prueba) se clasifica asignando la etiqueta que es más frecuente entre los k muestras de entrenamiento más cercanas a ese punto de consulta.

Una métrica de distancia comúnmente utilizada para variables continuas es la distancia euclidiana. Para variables discretas, como para la clasificación de texto, se puede utilizar otra métrica, como la métrica superpuesta (o distancia de Hamming). En el contexto de los datos de microarrays de expresión génica, por ejemplo, k-NN se ha empleado con coeficientes de correlación, como Pearson y Spearman, como métrica. [6] A menudo, la precisión de clasificación de k-NN se puede mejorar significativamente si la métrica de distancia se aprende con algoritmos especializados como el análisis de componentes de vecindario más cercano de gran margen o vecindario.

Un inconveniente de la clasificación básica de "votación por mayoría" ocurre cuando la distribución de clases está sesgada. Es decir, los ejemplos de una clase más frecuente tienden a dominar la predicción del nuevo ejemplo, porque tienden a ser comunes entre los k vecinos más cercanos debido a su gran número. [7] Una forma de superar este problema es ponderar la clasificación, teniendo en cuenta la distancia desde el punto de prueba a cada uno de sus k vecinos más cercanos. La clase (o valor, en problemas de regresión) de cada uno de los k los puntos más cercanos se multiplica por un peso proporcional a la inversa de la distancia desde ese punto hasta el punto de prueba. Otra forma de superar el sesgo es mediante la abstracción en la representación de datos. Por ejemplo, en un mapa autoorganizado (SOM), cada nodo es un representante (un centro) de un grupo de puntos similares, independientemente de su densidad en los datos de entrenamiento originales. K-NN se puede aplicar al SOM.

La mejor eleccion de k depende de los datos en general, valores mayores de k reduce el efecto del ruido en la clasificación, [8] pero hace que los límites entre clases sean menos distintos. Un bien k se puede seleccionar mediante varias técnicas heurísticas (ver optimización de hiperparámetros). El caso especial en el que se predice que la clase será la clase de la muestra de entrenamiento más cercana (es decir, cuando k = 1) se denomina algoritmo de vecino más cercano.

La exactitud de la k-El algoritmo NN puede verse gravemente degradado por la presencia de características ruidosas o irrelevantes, o si las escalas de características no son consistentes con su importancia. Se ha realizado un gran esfuerzo de investigación para seleccionar o escalar características para mejorar la clasificación. Un [ cita necesaria ] enfoque es el uso de algoritmos evolutivos para optimizar el escalado de características. [9] Otro enfoque popular es escalar características mediante la información mutua de los datos de entrenamiento con las clases de entrenamiento. [ cita necesaria ]

En problemas de clasificación binaria (dos clases), es útil elegir k sea ​​un número impar ya que esto evita votos empatados. Una forma popular de elegir lo empíricamente óptimo k en esta configuración es mediante el método bootstrap. [10]

El clasificador de tipo de vecino más cercano más intuitivo es el clasificador de vecino más cercano que asigna un punto x a la clase de su vecino más cercano en el espacio de características, es decir, C n 1 n n (x) = Y (1) < displaystyle C_^ <1nn> (x) = Y _ <(1) >>.

A medida que el tamaño del conjunto de datos de entrenamiento se acerca al infinito, el clasificador vecino más cercano garantiza una tasa de error no peor que el doble de la tasa de error de Bayes (la tasa de error mínima alcanzable dada la distribución de los datos).

La versión ingenua del algoritmo es fácil de implementar calculando las distancias desde el ejemplo de prueba a todos los ejemplos almacenados, pero es computacionalmente intensivo para grandes conjuntos de entrenamiento. El uso de un algoritmo de búsqueda de vecino más cercano aproximado hace k-NN computacionalmente manejable incluso para grandes conjuntos de datos. A lo largo de los años, se han propuesto muchos algoritmos de búsqueda de vecinos más cercanos, que generalmente buscan reducir el número de evaluaciones de distancia realmente realizadas.

k-NN tiene unos resultados de gran consistencia. A medida que la cantidad de datos se acerca al infinito, las dos clases k-Se garantiza que el algoritmo NN producirá una tasa de error no peor que el doble de la tasa de error de Bayes (la tasa de error mínima alcanzable dada la distribución de los datos). [15] Varias mejoras en el k-La velocidad NN es posible mediante el uso de gráficos de proximidad. [dieciséis]

Para clases múltiples k-La clasificación NN, Cover y Hart (1967) demuestran una tasa de error de límite superior de

Hay muchos resultados sobre la tasa de error de los k clasificadores vecinos más cercanos. [17] [18] El clasificador k-vecino más cercano es fuertemente (es decir, para cualquier distribución conjunta en (X, Y) < displaystyle (X, Y)>) consistente siempre que k: = k n < displaystyle k: = k_> diverge y k n / n < displaystyle k_/ n> converge a cero cuando n → ∞ < displaystyle n to infty>.

El rendimiento de la clasificación de vecino más cercano K a menudo se puede mejorar significativamente a través del aprendizaje métrico (supervisado). Los algoritmos populares son el análisis de componentes de vecindad y el vecino más cercano de gran margen. Los algoritmos de aprendizaje de métricas supervisadas utilizan la información de la etiqueta para aprender una nueva métrica o pseudométrica.

Cuando los datos de entrada a un algoritmo son demasiado grandes para ser procesados ​​y se sospecha que son redundantes (por ejemplo, la misma medida en pies y metros), los datos de entrada se transformarán en un conjunto de características de representación reducida (también llamado vector de características ). La transformación de los datos de entrada en el conjunto de características se denomina extracción de características. Si las características extraídas se eligen cuidadosamente, se espera que el conjunto de características extraiga la información relevante de los datos de entrada para realizar la tarea deseada utilizando esta representación reducida en lugar de la entrada de tamaño completo. La extracción de características se realiza en datos sin procesar antes de aplicar k-Algoritmo NN sobre los datos transformados en el espacio de características.

Un ejemplo de una canalización típica de computación de visión por computadora para el reconocimiento facial usando k-NN, incluidos los pasos de preprocesamiento de extracción de características y reducción de dimensiones (generalmente implementados con OpenCV):

    análisis de seguimiento de detección de rostros o proyección Fisher LDA en el espacio de características, seguido de k-Clasificación NN

Para datos de alta dimensión (p. Ej., Con un número de dimensiones superior a 10), la reducción de dimensión se realiza generalmente antes de aplicar el k-Algoritmo NN para evitar los efectos de la maldición de la dimensionalidad. [19]

La maldición de la dimensionalidad en el k-El contexto NN básicamente significa que la distancia euclidiana no es útil en dimensiones altas porque todos los vectores son casi equidistantes al vector de consulta de búsqueda (imagine varios puntos que se encuentran más o menos en un círculo con el punto de consulta en el centro, la distancia desde la consulta a todos los datos puntos en el espacio de búsqueda es casi el mismo).

La extracción de características y la reducción de dimensiones se pueden combinar en un paso utilizando técnicas de análisis de componentes principales (PCA), análisis discriminante lineal (LDA) o análisis de correlación canónica (CCA) como paso previo al procesamiento, seguido de la agrupación por k-NN en vectores de características en un espacio de dimensión reducida. Este proceso también se denomina incrustación de baja dimensión. [20]

Para conjuntos de datos de muy alta dimensión (por ejemplo, cuando se realiza una búsqueda de similitud en transmisiones de video en vivo, datos de ADN o series de tiempo de alta dimensión) aproximado k-La búsqueda NN usando hash sensible a la localidad, "proyecciones aleatorias", [21] "bocetos" [22] u otras técnicas de búsqueda de similitud de alta dimensión de la caja de herramientas VLDB podría ser la única opción factible.

En efecto, las reglas del vecino más cercano calculan implícitamente el límite de decisión. También es posible calcular el límite de decisión explícitamente y hacerlo de manera eficiente, de modo que la complejidad computacional sea una función de la complejidad del límite. [23]

La reducción de datos es uno de los problemas más importantes para trabajar con grandes conjuntos de datos. Por lo general, solo se necesitan algunos de los puntos de datos para una clasificación precisa. Esos datos se denominan prototipos y se puede encontrar de la siguiente manera:

  1. Selecciona el valores atípicos de clase, es decir, datos de entrenamiento clasificados incorrectamente por k-NN (para un k)
  2. Separe el resto de los datos en dos conjuntos: (i) los prototipos que se utilizan para las decisiones de clasificación y (ii) el puntos absorbidos que se puede clasificar correctamente por k-NN usando prototipos. Los puntos absorbidos se pueden eliminar del conjunto de entrenamiento.

Selección de valores atípicos de clase Editar

Un ejemplo de formación rodeado de ejemplos de otras clases se denomina valor atípico de clase. Las causas de los valores atípicos de la clase incluyen:

  • error al azar
  • ejemplos de entrenamiento insuficientes de esta clase (aparece un ejemplo aislado en lugar de un grupo)
  • faltan características importantes (las clases están separadas en otras dimensiones que no conocemos)
  • demasiados ejemplos de entrenamiento de otras clases (clases no balanceadas) que crean un trasfondo "hostil" para la clase pequeña dada

Valores atípicos de clase con k-NN produce ruido. Pueden detectarse y separarse para análisis futuros. Dados dos números naturales, k & gtr & gt0, un ejemplo de formación se llama (k, r)NN clase-valor atípico si su k vecinos más cercanos incluyen más de r ejemplos de otras clases.

Vecino más cercano condensado para la reducción de datos Editar

Vecino más cercano condensado (CNN, el Algoritmo de Hart) es un algoritmo diseñado para reducir el conjunto de datos para k-Clasificación NN. [24] Selecciona el conjunto de prototipos U de los datos de entrenamiento, de modo que 1NN con U puede clasificar los ejemplos casi con tanta precisión como lo hace 1NN con todo el conjunto de datos.

Dado un conjunto de entrenamiento X, CNN funciona de forma iterativa:

  1. Escanee todos los elementos de X, buscando un elemento X cuyo prototipo más cercano de U tiene una etiqueta diferente a la X.
  2. Eliminar X de X y agregarlo a U
  3. Repita el escaneo hasta que no se agreguen más prototipos a U.

Usar U en lugar de X para clasificación. Los ejemplos que no son prototipos se denominan puntos "absorbidos".

Es eficaz escanear los ejemplos de entrenamiento en orden de proporción de borde decreciente. [25] El coeficiente de frontera de un ejemplo de formación X Se define como

a(X) = | | x'-y | | / | | x-y | |

donde | | x-y | | es la distancia al ejemplo más cercano y tener un color diferente al Xy | | x'-y | | es la distancia desde y a su ejemplo más cercano X' con la misma etiqueta que X.

La relación de borde está en el intervalo [0,1] porque | | x'-y | | nunca excede | | x-y | | . Este orden da preferencia a los bordes de las clases para su inclusión en el conjunto de prototipos. U. Un punto de una etiqueta diferente a X se llama externo a X. El cálculo de la relación de la frontera se ilustra en la figura de la derecha. Los puntos de datos están etiquetados por colores: el punto inicial es X y su etiqueta es roja. Los puntos externos son azul y verde. Lo mas cercano a X el punto externo es y. Lo mas cercano a y el punto rojo es X' . La proporción de la frontera a(X) = | | x'-y | | / | | x-y | | es el atributo del punto inicial X.

A continuación se muestra una ilustración de CNN en una serie de figuras. Hay tres clases (rojo, verde y azul). Fig. 1: inicialmente hay 60 puntos en cada clase. La figura 2 muestra el mapa de clasificación 1NN: cada píxel se clasifica por 1NN utilizando todos los datos. La figura 3 muestra el mapa de clasificación 5NN. Las áreas blancas corresponden a las regiones no clasificadas, donde la votación 5NN está empatada (por ejemplo, si hay dos puntos verdes, dos rojos y uno azul entre los 5 vecinos más cercanos). La figura 4 muestra el conjunto de datos reducido. Los cruces son los valores atípicos de clase seleccionados por la regla (3,2) NN (los tres vecinos más cercanos de estas instancias pertenecen a otras clases) los cuadrados son los prototipos y los círculos vacíos son los puntos absorbidos. La esquina inferior izquierda muestra los números de los valores atípicos de la clase, los prototipos y los puntos absorbidos para las tres clases. El número de prototipos varía del 15% al ​​20% para diferentes clases en este ejemplo. La figura 5 muestra que el mapa de clasificación 1NN con los prototipos es muy similar al del conjunto de datos inicial. Las figuras se produjeron utilizando el subprograma Mirkes. [25]


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