Información

¿Cómo conduce el 2-mercaptoetanol al cambio de la banda a un peso molecular más alto?

¿Cómo conduce el 2-mercaptoetanol al cambio de la banda a un peso molecular más alto?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tengo un proyecto para aislar una proteína con propiedades biológicas de una planta. La proteína purificada forma cuatro bandas con peso molecular similar en SDS-PAGE (30-35 kDa) en presencia de 2-mercaptoetanol al 5%, y dos bandas con PM más bajo (27-30 kDa) cuando se omite el 2-mercaptoetanol.

¿Cómo se pueden explicar estos resultados? ¿Cuál es el método más fácil y de menor costo para separar proteínas estrechamente relacionadas (si eso es lo que son, y no solo subunidades de una sola proteína)?


El 2-mercaptoetanol (2ME) reduce los enlaces disulfuro en las proteínas. Si los enlaces disulfuro conectan dos cadenas polipeptídicas ("intermoleculares"), entonces 2ME haría que se separaran y, por lo tanto, en lugar de una banda de mayor peso molecular (MW), obtendría una o más bandas de menor MW.

Sin embargo, si hay enlaces disulfuro en la misma cadena polipeptídica, pueden hacer que la cadena se pliegue. Esto da como resultado que la cadena polipeptídica tenga efectivamente un radio hidrodinámico más pequeño en comparación con la cadena completamente desnaturalizada. En tales casos, la reducción de los enlaces disulfuro usando 2ME haría que la banda cambiara a un MW más alto.

¿Cuál es el método más fácil y de menor costo para separar proteínas estrechamente relacionadas?

Esta es una pregunta completamente diferente y hay varias técnicas dependiendo de cuán "diferentes" o "similares" sean las proteínas estrechamente relacionadas. PAGE 2D (con enfoque isoeléctrico) es una técnica que puede ofrecer una resolución más alta en comparación con un SDS-PAGE normal. Hay muchos otros métodos cromatográficos.


Resolución de problemas: ¿Por qué el peso molecular de la proteína observado difiere del calculado?

El primer paso de WB es la electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), seguida de la transferencia de proteínas en una membrana y la posterior detección con anticuerpos específicos. Debido a que la SDS-PAGE se realiza en condiciones de desnaturalización, las proteínas migran de acuerdo con sus pesos moleculares independientemente de su estructura secundaria / terciaria, carga o interacciones proteína-proteína. Esto significa que las proteínas más pequeñas migran más rápido que las más grandes.

El peso molecular predicho (MW) de la proteína es la suma de los pesos moleculares de todos los aminoácidos de la proteína. Es fácil de calcular, por ejemplo, utilizando la herramienta gratuita ExPASy en línea. A menudo, el MW calculado es diferente al observado en el WB. Aquí intentamos resumir las razones más comunes por las que esto puede ocurrir (Figura 1).

Tamaño inusual o inesperado de las bandas de WB
1. El péptido señal (y un propéptido) se escinde

Muchas proteínas que se transportan a través de la vía secretora tienen péptidos señal de 15 a 35 aa. longitud localizada predominantemente en sus N-terminales. A menudo son escindidas por varias proteasas durante su transporte subcelular. Esto da como resultado que la proteína madura se ejecute a un peso molecular inferior al previsto. La presencia de péptidos señal se puede predecir mediante varias herramientas en línea o basándose en datos publicados previamente. Por lo general, están bien anotados en bases de datos de proteínas, por ejemplo, UniProt. Además, un subconjunto de proteínas tiene propéptidos, dominios de proteínas que están presentes en los precursores de proteínas. Los precursores de proteínas deben ser procesados ​​por proteasas para generar un producto funcional (sin propéptido).

Figura 2: PINK1 (23274-1-AP) es una serina / treonina-proteína quinasa mitocondrial que protege a las células de la disfunción mitocondrial inducida por estrés. El precursor de PINK1 (65 kDa) se sintetiza en el citosol y se importa a la membrana externa de las mitocondrias. PINK1 se transfiere más a la membrana interna donde se escinde en una forma madura de 52 kDa.

Las caspasas, una familia de endoproteasas, son actores críticos en las redes reguladoras de células que controlan la inflamación y la muerte celular. La caspasa 3 (19677-1-AP) existe como una forma de proenzima inactiva de 32 kDa (p32), que tras la señalización apoptótica se escinde en dos subunidades activas (p19 / 17 y p12) que se ensamblan en una enzima tetramérica funcional (PMID: 7596430 ).

Las proteínas de la familia de las metaloproteinasas de la matriz (MMP) están implicadas en la degradación de la matriz extracelular en muchos procesos fisiológicos, incluido el desarrollo embrionario, la reproducción, la remodelación tisular y procesos patológicos como la artritis o la metástasis. La mayoría de las MMP se secretan como proproteínas inactivas que se activan cuando se escinden mediante proteinasas extracelulares. El pro-MMP9 inactivo (10375-2-AP) es de 92 kDa. Se escinde secuencialmente por MMP3 en una forma procesada de 68 kDa a través de una forma intermedia: 78/82 kDa (PMID: 1371271). Además, MMP9 también puede existir como un dímero de 180 kDa (PMID: 7492685).

2. Modificaciones postraduccionales (PTM)
A) Glicosilación y glicación

La mayoría de las proteínas que se sintetizan en los ribosomas asociados con el retículo endoplásmico experimentan glicosilación. Eso significa que se agrega una unión covalente de restos de azúcar a la cadena polipeptídica. Los dos tipos más comunes de glicosilación en eucariotas son la glicosilación ligada a N, a asparagina, y la glicosilación ligada a O, a serina y treonina. La glicosilación extensa agrega peso molecular adicional, no incluido en la secuencia de proteína original, lo que hace que las proteínas migren más lentamente.

Figura 3: El ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1, CD274 o B7-H1) (66248-1-Ig) es una proteína transmembrana de tipo I, que actúa como un regulador clave de la respuesta inmune adaptativa. PD-L1 MW de longitud completa es 33 kDa. El péptido señal se escinde durante el transporte de proteínas a la membrana plasmática y la proteína se N-glicosila en gran medida con un peso molecular aparente de 45 a 70 kDa y la forma glicosilada principal de 45 a 50 kDa (PMID: 27572267).

Tenga en cuenta: Una desglicosilación enzimática es una técnica experimental comúnmente utilizada para verificar si una proteína estudiada está glicosilada. Antes de la WB, la muestra de proteína se incuba con una enzima que puede eliminar partes o cadenas completas de glucanos. Las especies de proteína WB de la muestra digerida se comparan luego con la muestra no digerida, y cualquier cambio observado en el peso molecular indica glicosilación de la proteína. Una enzima de uso común es PNGasa F, que elimina los glicanos ligados a N escindiendo el enlace entre la N-acetilglucosamina más interna de la cadena de glicano y el residuo de asparagina.

CD133, también conocido como PROM1 (prominina-1) (18470-1-AP), es una glicoproteína transmembrana con un dominio extracelular NH2-terminal, cinco bucles transmembrana y una cola citoplasmática. CD133 es una proteína altamente glicosilada con un peso molecular aparente de 115-120 kDa. Después del tratamiento de lisados ​​con PNGasa F, CD133 cambia a una proteína con un PM de 75 a 85 kDa. Eso corresponde al peso molecular calculado de CD133 desglicosilado (PMID: 23150174).

Los proteoglicanos son un grupo de casos especiales de glicoproteínas. Son proteínas de la matriz extracelular con largas cadenas de glicosaminoglicanos no ramificadas unidas covalentemente al núcleo de la cadena de aminoácidos. Normalmente, el peso molecular del grupo de los azúcares es incluso mayor que el del componente proteico.

Figura 4: La decorina (14667-1-AP) es un miembro de la pequeña familia de proteínas de proteoglicanos ricos en leucina. El precursor de decorina forma un rango de MW de 43 a 47 kDa. Contiene una señal peptídica N-terminal escindible y también puede glicosilarse. La unión de los glicosaminoglicanos (condroitín sulfato o dermatán sulfato) a la decorina se produce en el aparato de Golgi antes de la secreción de la forma glicantada madura de las células.

B) Fosforilación

Una de las modificaciones postraduccionales más comunes es la fosforilación de proteínas. Tiene lugar en residuos de serina, treonina y tirosina. La fosforilación regula la función de las proteínas, su actividad enzimática, las interacciones proteína-proteína y la localización de las proteínas. La fosforilación es catalizada por fosfatasas y puede ser reversible; las proteínas fosforiladas pueden ser desfosforiladas por proteínas defosfatasas. La adición de un solo grupo fosforilo agrega +/- 1 kDa al MW, que a menudo está más allá de la resolución de la SDS-PAGE estándar. Sin embargo, múltiples sitios de fosforilación pueden conducir a cambios de MW más prominentes.

Figura 5: La serina / treonina-proteína quinasa AKT juega un papel en muchos procesos celulares. Los factores de supervivencia pueden suprimir la apoptosis de una manera independiente de la transcripción activando la serina / treonina quinasa AKT1, que luego fosforila e inactiva componentes de la maquinaria apoptótica. (60203-2-Ig detecta todos los miembros de AKT con o sin fosforilación, 66444-1-Ig detecta el fosfo-Ser473 de AKT1 y el fosfo-S474 de AKT2 / fosfo-Ser472 de AKT3).

C) Ubiquitinación

La ubiquitinación de proteínas significa que se agrega una ubiquitina covalente a lisina, cisteína, serina, treonina o directamente al extremo N de la proteína. La ubiquitina es una proteína pequeña (+/- 8,6 kDa) expresada en casi todos los tipos de tejidos. La ubiquitinación es una reacción enzimática catalizada por una cascada de tres enzimas (E1, E2 y E3). Eso proporciona especificidad de sustrato y pasos de activación, conjugación y ligación. Las proteínas pueden ser monoubiquitinadas (con una molécula de ubiquitina) o poliubiquitinadas. La poliubiquitinación tiene lugar cuando se añaden moléculas de ubiquitina adicionales a la molécula de ubiquitina inicial. La ubiquitinación a través del proteoma puede marcar las proteínas para su degradación. También es importante para la señalización celular, la internalización de proteínas de membrana y el desarrollo y regulación de la transcripción. La ubiquitina se puede eliminar de las proteínas desubiquitinando enzimas, lo que reduce su PM.

Figura 6: La ubiquitina B (UBB) (10201-2-AP), un miembro de la familia de la ubiquitina, es necesaria para la degradación proteica intracelular no lisosomal dependiente de ATP de proteínas anormales y proteínas normales con un recambio rápido. Este gen consta de tres repeticiones directas de la secuencia codificante de ubiquitina sin secuencia espaciadora.

3. Complejos de proteínas

WB SDS-PAGE se realiza en condiciones reductoras. Eso significa que la mayoría de los complejos de proteínas compuestos por proteínas unidas a través de enlaces no covalentes se disocian durante la preparación de la muestra y la electroforesis, y las proteínas (individuales) funcionan como monómeros. Sin embargo, algunas proteínas permanecen parcial o totalmente presentes en complejos homo o heteroméricos, incluso en presencia de SDS y β-mercaptoetanol. En este caso, su peso molecular observado puede ser sustancialmente mayor que la forma monomérica calculada y predicha. Algunas proteínas, especialmente las proteínas transmembrana y las proteínas con dominios hidrófobos, pueden agregarse durante la lisis celular a medida que se liberan de sus complejos proteicos nativos y membranas lipídicas. Estos agregados tienen altos pesos moleculares y pueden no representar interacciones que ocurren en sus estados nativos.

Tenga en cuenta: 20% de β-mercaptoetanol (o DTT 100 mM) para el tampón de muestra 4X SDS podría ayudar a eliminar bandas inespecíficas debido a la disociación del complejo proteico.

Figura 7: NQO1 (11451-1-AP) es una enzima que actúa como quinona reductasa junto con reacciones de conjugación de las hidroquinonas involucradas en las vías de desintoxicación, así como en procesos biosintéticos como la gamma-carboxilación de residuos de glutamato dependiente de vitamina K en la síntesis de protrombina. NQO1 tiene tres isoformas de PM de 26, 27 y 31 kDa, y se necesita la formación de homodímeros (66-70 kDa) para su actividad enzimática.

La proteína que interactúa con Mlx (MLXIP, también conocida como MONDOA) (13614-1-AP) actúa como un factor de transcripción al formar un heterodímero con la proteína MLX. Este complejo se une y activa la transcripción de las cajas CACGTG E, desempeñando un papel en la activación transcripcional de la diana glucolítica y la regulación génica sensible a la glucosa. MLXIP tiene tres isoformas: 110, 57 y 69 kDa, y el peso molecular del heterodímero MLXIP-MLX es 130 kDa.

4. Isoformas de proteínas

Muchas proteínas codificadas por un solo gen existen en más de una variante de secuencia, llamadas isoformas de proteínas. Surgen de un empalme alternativo durante la maduración del ARNm. Los exones e intrones seleccionados se pueden incluir / excluir del producto de ARNm final. Las secuencias codificantes de proteínas adicionales incluidas pueden reflejarse en productos proteicos de mayor peso molecular. Por otro lado, la adición de secuencias puede introducir codones de parada alternativos (prematuros), lo que conduce a proteínas de pesos moleculares más bajos. Algunas proteínas tienen múltiples sitios de inicio de traducción, lo que da lugar a isoformas con diferentes N-terminales. Las isoformas de proteínas pueden tener una vida media y una localización subcelular diferente. Pueden interactuar con diferentes subconjuntos de proteínas, formar complejos de proteínas distintivos y tener funciones diferentes, incluso opuestas.

Figura 8: GLS, también conocido como GLS1 y KIAA0838, pertenece a la familia de las glutaminasas. Tres isoformas de GLS, denominadas KGA, GAM y GAC, varían en su MW y patrones de expresión tisular (PMID: 11015561). KGA, glutaminasa de tipo renal, tiene un PM de 65 kDa. GAC, glutaminasa C, es de 58 kDa, y es un producto del corte y empalme de genes que da como resultado la pérdida del dominio C-terminal que está presente en KGA. GAM es la isoforma más corta sin actividad catalítica y surge de la inclusión del intrón 2 y el codón de parada prematuro. (12855-1-AP detecta isoformas KGA y GAC, 20170-1-AP es específico para KGA, 23549-1-AP es específico para las tres isoformas (KGA, GAM, GAC) de GLS y 19958-1-AP es específico de GAC.)

PARD3 (también conocida como ASIP, Par3 o Bazooka) es una de las proteínas de la familia PARD implicadas en la división celular asimétrica y el crecimiento polarizado. PARD3 tiene múltiples isoformas de empalme con tres principales: 100 kDa, 150 kDa y 180 kDa. (11085-1-AP reconoce las tres principales isoformas de PARD3).

5. Obstáculos técnicos
A) Reactividad cruzada de anticuerpos

Es posible que el anticuerpo seleccionado reconozca no solo su proteína diana, sino también una reacción cruzada inespecífica con otras proteínas en la muestra analizada. Para evitar este problema, podríamos configurar un panel de control apropiado y una optimización del protocolo.

Controles sugeridos:

- una proteína diana purificada

- un lisado de una línea celular que se sabe que expresa la proteína diana

- un lisado de una línea celular que sobreexpresa la proteína diana.

- lisados ​​de líneas celulares con menor expresión de la proteína diana

- lisados ​​de líneas celulares con la proteína diana anulada (por ejemplo, por ARNip o ARNhc) o anulada (por ejemplo, por CRISPR).

Optimización experimental:
  • Tampones de extracción (p. Ej., Tampón RIPA)
  • Tampones de bloqueo (p. Ej., Leche desnatada al 5%, caseína o BSA)
  • Tiempos de incubación y lavado (por ejemplo, durante la noche a 4 ° C o 1,5 ha TA)
  • Anticuerpos secundarios utilizados para la detección (p. Ej., Factor de dilución)
  • Tipos de membranas (nitrocelulosa vs. PVDF).
B) Escisión proteolítica inespecífica y degradación de proteínas

Las proteínas pueden sufrir una digestión proteolítica inespecífica si la muestra de proteína no se manipula correctamente. Las proteasas liberadas durante la lisis celular o la extracción de tejidos pueden causar fragmentación de proteínas, lo que da como resultado fragmentos de pesos moleculares más bajos. Algunas proteínas son más susceptibles a la degradación que otras. La elección de los tampones de lisis celular / tisular y las condiciones de lisis, junto con la suplementación con inhibidores de proteasa, son elementos vitales para la extracción eficaz de proteínas.

Tabla de resumen

Peso molecular observado

Causas potenciales

Más alto de lo esperado

1. Modificaciones postraduccionales.

2. El anticuerpo detecta una isoforma de proteína con una secuencia más larga.

Más bajo de lo esperado

1. Escisión del péptido señal.

2. El anticuerpo detecta una isoforma de proteína con una secuencia más corta.

3. Escisión de proteínas inespecíficas.

Más de una banda observada

2. Un producto proteico pero con diferentes modificaciones postraduccionales.

3. El anticuerpo detecta proteínas con y sin propéptido.

5. Reactividad cruzada de anticuerpos, potencialmente debida a la homología de la secuencia inmunógena.


El ácaro del polvo doméstico Der p 1 regula negativamente las defensas del pulmón al inactivar los inhibidores de elastasa

Los ácaros del polvo doméstico (HDM) son la fuente más común de aeroalergenos y en individuos genéticamente susceptibles pueden causar síntomas que van desde dermatitis atópica hasta asma bronquial. Der p 1, un objetivo principal de las respuestas inmunitarias humanas a la HDM, a través de sus propiedades enzimáticas puede modular el sistema inmunológico adaptativo mediante la escisión de CD23 y CD25. Las consecuencias de esto serían promover respuestas inflamatorias alérgicas. Además, al interrumpir las uniones epiteliales estrechas, Der p 1 facilita el transporte de alérgenos a través del epitelio. Aquí, informamos que Der p 1 tiene efectos adicionales sobre los mecanismos de defensa innatos del pulmón, al inactivar in vitro y ex vivo los inhibidores de elastasa inhibidor de α1-proteinasa humano (h) (h-A1-Pi), ratón (m-), (pero no humano [h]) - SLPI y h-elafin. Confirmamos que Der p 1 contiene tanto cisteína como serina proteinasas, y ampliamos este hallazgo para demostrar por primera vez que la h-elafina es particularmente sensible a la actividad biológica de esta última. Debido a que estos inhibidores de elastasa tienen actividad antimicrobiana y antielastasa, nuestros resultados sugieren que la inactivación de estos componentes innatos del sistema de defensa pulmonar por Der p 1 puede aumentar la susceptibilidad de los pacientes con inflamación alérgica a la infección.

El asma es una enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias inferiores caracterizada por exacerbaciones intermitentes de obstrucción reversible de las vías respiratorias, inflamación de las vías respiratorias e hiperreactividad bronquial (1). La respuesta inmune crónica en el asma y otras enfermedades atópicas se caracteriza por una respuesta predominantemente de células T Th2, asociada con la producción de interleucina (IL) -4, IL-5, IL-13 e IgE (1). Aunque un tercio de todos los casos de asma pueden caracterizarse como no alérgicos intrínsecos, donde se desconoce el agente desencadenante (2), está claro que en la mayoría de los casos de asma (extrínseco) el factor desencadenante es de origen alérgeno, con un fuerte componente atópico. (3).

La prevalencia del asma varía en los estudios entre el 5 y el 25% (1) y se ha duplicado en el mundo industrializado durante los últimos 20 años (4). Los factores implicados en este aumento en la prevalencia incluyen un ambiente interior alterado, como una vivienda más cálida, un mayor uso de antibióticos de amplio espectro con perfiles de infección bacteriana alterados, cambios en la dieta y una mayor exposición a aeroalergenos.

Se ha demostrado que la exposición a una serie de aeroalergenos contribuye tanto a la hipersensibilidad inmediata como al asma crónica, entre ellos los alérgenos comunes de interior producidos por el ácaro del polvo doméstico (HDM). En la enfermedad atópica humana, las respuestas inflamatorias a los antígenos del grupo I de Dermatophagoides pteronyssinus y Dermatophagoides farinae (Der p 1 y Der f 1) están bien documentados (5-6).La cisteína proteasa Der p 1 es una glicoproteína de 25 kD presente en cantidades significativas en los sedimentos fecales de HDM y se sugiere que tiene un papel digestivo en el intestino del ácaro. Varios estudios recientes han demostrado que Der p 1 es capaz de escindir proteínas humanas con efectos potencialmente inmunomoduladores, incluido el inhibidor de proteinasa α1 (A1-Pi), (7), CD23 (el receptor de IgE de baja afinidad humana) (8), CD25 (la subunidad α del receptor de IL-2 humano) (9) y uniones estrechas del epitelio bronquial, lo que conduce a un aumento de la permeabilidad del epitelio bronquial (10). Además de A1-Pi (11-12), el pulmón también secreta antiproteasas de alarma mucosa / inhibidor de proteinasas leucocitarias secretoras (SLPI) y elafina, que contribuyen significativamente no solo a la actividad antielastasa sino también a la activación de la inmunidad innata (13– dieciséis). Por ejemplo, utilizando una estrategia de sobreexpresión de adenovirus, hemos informado recientemente que elafin tiene actividades quimiotácticas para los neutrófilos y protege el pulmón en una Pseudomonas aeruginosa modelo de inflamación aguda (17-18).

En consecuencia, buscamos investigar en el presente estudio si Der p 1 fue capaz de inactivar estas importantes antiproteasas y, en consecuencia, podría cambiar el "equilibrio elastasa-antielastasa" a favor de un ambiente proinflamatorio para facilitar tanto el inicio como el mantenimiento de la respuesta asmática.

Hemos demostrado aquí que las tres antiproteasas estudiadas pueden potencialmente ser degradadas por Der p 1 in vitro y ex vivo. Además, hemos investigado en detalle las propiedades enzimológicas de Der p 1 contra sustratos sintéticos e inhibidores selectivos para aclarar la naturaleza de las proteasas que inactivan las defensas antiproteasas innatas. Como consecuencia, hemos descubierto que además de la cisteína proteinasa bien caracterizada presente en Der p 1, una serina proteasa co-purificadora es extremadamente activa contra la elafina humana.

La A1-Pi humana (h) se adquirió de Sigma (Poole, Dorset, Reino Unido) y la elafina sintética humana (h) fue fabricada por Albachem (Edimburgo, Reino Unido) como se describió anteriormente (19). La SLPI humana recombinante (h) se adquirió de R & ampD Systems (Minneapolis, MN) y la (m) -SLPI murina recombinante fue un regalo del Dr. C. Wright (Amgen, Thousand Oaks, CA). La elastasa de neutrófilos humanos (HNE) se obtuvo de Elastin Products (Owensville, MO). E-64 (L-trans-epoxisuccinil-leucil-amido [4-guanidino] butano Sigma) es un inhibidor irreversible dirigido al sitio activo de cisteína proteasas que inhibe Der p 1 (20).

El líquido de lavado broncoalveolar humano (BALF) de seis pacientes con síndrome de dificultad respiratoria aguda establecido (21) fue un generoso obsequio del Dr. S. Donnelly. Las muestras se combinaron y se incubaron con Der p 1, como se describe a continuación.

Se disolvieron sesenta gramos de polvo de ácaros del polvo doméstico (obsequio del Dr. T. Wayne, Universidad de Perth, Perth, Australia) en 1 litro de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco (libre de calcio y magnesio) que contenía NaCl 0,5 M, 0,01% (peso / peso) de azida sódica, pH 7,4. Se acopló el anticuerpo monoclonal 4C1 anti-Der p1 de ratón (Indoor Biotechnologies, Clwyd, Reino Unido) a 5 g de Sepharose 4B activada con cianógeno (Amersham Biosciences UK Limited, Pollard's Wood, Buck, Reino Unido), se suspendió y se lavó en una columna de afinidad según según las instrucciones del fabricante. Se aplicaron cien mililitros de solución de Der p 1 a la columna a un caudal de 20 ml / h. La columna se lavó con 400 ml de PBS NaCl 0,5 M y la elución se realizó a 20 ml / h usando glicina 5 mM en etilenglicol al 50% pH 10,0. Se ensayó la absorbancia de las fracciones a 280 nm y se dializaron extensamente durante 18 h frente a 10 litros de PBS. Estas fracciones se denominarán CS-Der p 1 durante el resto del estudio. Se realizó una purificación adicional en la mitad del dializado aplicándolo a una columna de afinidad que contenía 100 mg de inhibidor de tripsina de soja (SBTI) acoplado a 5 g de Sepharose 4B activada con cianógeno (Pharmacia Biotech), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las fracciones se recogieron y se ensayaron de nuevo para determinar la absorbancia a 280 nm para recoger Der p 1 empobrecido en serina-proteasa y se volvieron a dializar ampliamente contra PBS. Der p 1, que se había empobrecido en serina proteasa por este proceso, se denominó C-Der p 1 para el resto del estudio. La concentración de proteína de C / CS-Der p 1 se evaluó usando un ensayo de placa de ácido bicinconínico (Pierce y Warriner Ltd., Chester, Cheshire, Reino Unido). La pureza de las preparaciones se evaluó usando migración en análisis SDS-PAGE al 12% (geles teñidos con Biorad Silver Stain). Las muestras se almacenaron en alícuotas a –20 ° C.

Se utilizó una gama de sustratos fluorescentes sintéticos (Novabiochem, Nottingham, Reino Unido) para analizar la selectividad del sustrato Der p 1, e incluyó Cbz-Arg-Arg-AMC, H-Arg-AMC, Cbz-Phe-arg-AMC, Boc-Gln -Ala-Arg-AMC, Tosyl-Gly-Pro-Arg- AMC, H-Pro-Phe-Arg-AMC, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC (22) y Suc-Gly-Pro-Leu- Gly-Pro-AMC (23). Se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) para generar un stock de 10 mM y la hidrólisis de cada sustrato (10 μM final) por 6 μg de CS-Derp1 se realizó por triplicado en 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0) que contenía 5 mM. cisteína y DMSO al 2%. La hidrólisis se midió controlando la liberación de AMC cada 10 s durante 2 min, usando un minifluorímetro Hoeffer TK 100 (longitud de onda de excitación de 365 nm y detección de emisión a 465 nm, San Francisco, CA). Las concentraciones de sustrato se mantuvieron constantes permitiendo no más del 5% de hidrólisis. La velocidad de hidrólisis se determinó mediante análisis de regresión lineal utilizando el programa informático SIGMA PLOT, versión 4.00. La concentración de AMC se determinó a partir de la línea de regresión: [AMC] = (y - c) / m, donde y son las unidades fluorescentes liberadas por la hidrólisis, c es la intersección y m es la pendiente de la línea de regresión.

El perfil de pH de CS-Derp1 purificado frente a los sustratos sintéticos Boc-Gln-Ala-Arg-AMC y Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC se determinó en los siguientes tampones:

Tampón de ácido cítrico / citrato de sodio 0,1 M (pH 3–6), tampón fosfato 0,1 M (pH 6–8) y Tris-HCl 0,5 M (pH 8–9,5). Todas las reacciones se realizaron en presencia de cisteína 5 mM.

La constante de velocidad (Kmetro) de CS-Der p 1 para sustratos sintéticos se determinó controlando las velocidades iniciales de hidrólisis al pH óptimo para cada sustrato. El rango de concentraciones de sustrato utilizado para Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, Tosyl-Gly-pro-Arg-AMC y Cbz-Phe-Arg-AMC fue de 0 a 600 μM, 0 a 10 μM y 0 a 100 μM, respectivamente. Las velocidades iniciales de hidrólisis (Vo) se representaron gráficamente frente a las diferentes concentraciones de sustrato [S] para garantizar que se observara la curvatura. Los datos también se representaron como una línea recta usando la gráfica de Hanes-Woolf y luego se aplicó a la ecuación de tasa de Michaelis-Menten como se describe a continuación usando un programa de análisis de regresión no lineal, en SIGMA PLOT versión 4.00, para obtener la Kmetro y velocidad inicial máxima (Vmax).

Las actividades enzimáticas de CS-Der p 1 y C-Der p 1 se caracterizaron además por inhibición diferencial usando E64 y APMSF, inhibidores de cisteinil y serina proteinasas, respectivamente. CS-Der p 1 y C-Der p 1 se preincubaron con E64 10 μM o APMSF 100 μM antes de analizar la actividad residual como se describe anteriormente utilizando Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (10 μM final en tampón fosfato 0,1 M pH 6,0 ) o Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC (final 10 μM en Tris-HCl 0,5 M pH 8,0). Todos los tampones contenían cisteína 5 mM.

Las muestras de proteínas se enviaron a SDS-PAGE y / o se analizaron mediante análisis Western Blot como se describe (24). Brevemente, después de la transferencia electroforética en membranas de nitrocelulosa Hybond (Amersham, Bucks, Reino Unido), las membranas se sondaron secuencialmente con IgG de conejo anti-h-elafina (dilución 1: 1000, incubación de 1 hora a temperatura ambiente) y anti-cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante. -IgG de conejo (dilución 1: 2500, 20 min a temperatura ambiente Dako, Ely, Cambridgeshire, Reino Unido). Las transferencias de Western se desarrollaron mediante quimioluminiscencia mejorada (kit ECL Amersham).

Se añadió tampón Tris 50 mM Tris 0,5 M NaCl 0,1% Triton pH 8 a cantidades definidas de HNE en una placa ELISA de 96 pocillos (Linbro Flow Laboratories, McLean, VA) hasta un volumen de 200 µl. Se agregaron cincuenta microlitros de sustrato elastasa sintético N-metoxisuccinil-ala-ala-pro-val-p-nitroanilida (Sigma) a cada pocillo, y se controló la escisión del sustrato mediante el cambio en la absorbancia (a 405 nm), medida espectrofotométricamente, a puntos de tiempo definidos, utilizando un lector de placas Dynex MRX II (Dynatech, Billinghurst, Reino Unido).

La actividad anti-HNE de las soluciones de prueba (proteínas purificadas o BALF) se evaluó mediante la adición de la solución a la mezcla de HNE / tampón, manteniendo un volumen total de 200 µl. A continuación, la placa se incubó durante 15 min a 37ºC antes de la adición del sustrato como se describió anteriormente. Se demostró que las fracciones de Der p 1, ditiotreitol (DTT) y L-cisteína, solas o en combinación, no influyeron en la tasa de escisión del sustrato por HNE (datos no mostrados).

Primero buscamos establecer las especificidades enzimáticas de nuestra preparación de CS-Der p 1, después de la purificación de la columna de cromatografía de afinidad 4C1. Se utilizaron varios sustratos sintéticos que se enumeran en la Tabla 1.

TABLA 1 Especificidad de sustrato de CS-Der p 1

La especificidad del sustrato de CS-Der p 1 se analizó usando varios sustratos fluorogénicos sintéticos (concentración final de 10 µM). Todos los ensayos se llevaron a cabo en Tris-HCl 0,5 M pH 8,0 que contenía cisteína 5 mM. Los resultados se expresan como nM de 7-amino-4-metilcumarina (AMC) liberada / s / mg ± SD.

La afinidad de estas proteasas se estudió con más detalle en la Figura 1.

Figura 1. Gráficos de Michaelis-Menten y Hanes-Woolf para la hidrólisis de Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC y Cbz-Phe-Arg-AMC por CS-Der p 1. El curvas en A, C, y mi representan la tasa inicial de hidrólisis (V0) de Boc-Gln-Ala-Arg-AMC, Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC y Cbz-Phe-Arg-AMC por CS-Der p 1. Los gráficos de Hanes-Woolf correspondientes se muestran en B, D, y F. los Kmetro y Vmax se determinaron ajustando los datos a la forma hiperbólica de la ecuación de velocidad en el programa de regresión no lineal de SIGMAPLOT 4.00.

Figura 2. Perfiles inhibidores de CS-Der p 1 (A, B) y C-Der p 1 (C) actividades de E64 y APMSF. CS-Der p 1 y C-Der p 1 se inhibieron diferencialmente mediante la preincubación con E64 10 μM y APMSF 100 μM antes de analizar la actividad residual utilizando Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (A, C) o Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC (B) a pH 6,0 o pH 8,0, respectivamente. Todos los tampones contenían cisteína 5 mM. Los resultados se expresan como velocidades iniciales de hidrólisis (pM / s) medidas durante un período de 2 minutos. ND, no detectado.

Habiendo establecido que CS-Der p 1 contenía componentes de serina proteasa y cisteína proteasa, separamos ambas actividades sometiendo la fracción CS-Der p 1 a cromatografía de afinidad SBTI.

El C-Der p 1 purificado resultante se ensayó luego en Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC y Boc-Gln-Ala-Arg-AMC. Encontramos que C-Der p 1 era activo contra Boc-Gln-Ala-Arg-AMC y solo E-64 abolió esa actividad (Figura 2C). No hubo actividad registrable contra Tosyl-Gly-Pro-Arg-AMC (datos no mostrados), lo que establece que, de hecho, C-Der p 1 solo contenía la actividad de cisteína proteinasa.

Habiendo demostrado enzimáticamente que CS-Der p 1 contenía actividades de cisteína y serina proteasa (Tabla 1 y Figuras 1, 2A y 2B), mientras que C-Der p 1 solo contenía la primera (Figura 2C), la actividad de ambas fracciones en los inhibidores de elastasa pulmonar se investigó h-A1-Pi, h-elafin, h-SLPI y m-SLPI.

La interacción de Der p 1 (CS y C) con h-A1-Pi se analizó mediante SDS-PAGE: Figura 3A

Figura 3. Inactivación de h-A1-Pi por Der p 1. (A) Degradación de h-A1-Pi por Der p 1 (análisis SDS-PAGE). Se incubó h-A1-Pi (2 μg) con C / CS-Der p 1 (2 ha 37 ° C), con o sin L-Cys (20 mM) y E-64 (0,4 mM). Se eligió una relación molar Der p 1 / h-A1-Pi de 2,0: 1 después de experimentos piloto previos (no mostrados). Las muestras se diluyeron con tampón de carga (SDS y 2-mercaptoetanol) y se realizó el análisis SDS-PAGE (gel al 12%). Carril 1, h-A1-Pi solo carril 2, h-A1-Pi + L-Cys carril 3, h-A1-Pi + CS-Der p 1 + L-Cys carril 4, h-A1-Pi + CS-Der p 1 + L-Cys + E-64 carril 5, h-A1-Pi + C-Der p 1 + L-Cys carril 6, h-A1-Pi + C-Der p 1 + L-Cys + E-64 estándares, los pesos moleculares (kD) se indican mediante flechas. (B) Inactivación funcional de h-A1-Pi por Der p 1 medida por la actividad HNE residual. Se incubó h-A1-Pi (0, 1, 2, 4 h) a 37 ° C con Der p 1 (C / CS) y L-Cys (20 mM), con o sin E-64 (0,4 mM). Se eligió una relación molar Der p 1 / h-A1-Pi de 2,0: 1 sobre la base del análisis de gel (A). Al final de la incubación, la mezcla se agregó a HNE purificado (25 ng) para una incubación adicional de 15 minutos a 37 ° C, antes de agregar el sustrato de HNE N-metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilida . Después de 15 min, se leyó la absorbancia a 405 nm. Los resultados se expresan como% de actividad de HNE, donde se incubó HNE con el tampón de control solo (Tris 50 mM, NaCl 0,5 M, Triton X al 0,1%, pH 8,0). Cuadrícula, C-Der p 1 + E-64 diamantes, CS-Der p 1 + E-64 circulos, C-Der p 1 triangulos, CS-Der pág. 1.

Se usó la misma relación Der p 1 / A1-Pi para el ensayo funcional en el que se midió la actividad anti-HNE residual de h-A1-Pi (Figura 3B).

En todos los puntos de tiempo (0, 1, 2, 4 h), los resultados se expresan como porcentaje de actividad de HNE residual, en comparación con HNE incubado con tampón solo. Reflejando los resultados del análisis SDS-PAGE, observamos que tanto CS-Der p 1 como C-Der p 1 inactivaban funcionalmente h-A1-Pi (según lo determinado por el aumento de la actividad de HNE a lo largo del tiempo). La incubación de Der p 1 con E-64 evitó la inactivación de h-A1-Pi porque la actividad de HNE permaneció mínima durante todo el experimento, demostrando de nuevo que, de hecho, la cisteína proteinasa de Der p 1 es responsable de la actividad. También se demostró que Der p 1 y L-cys, solos o en combinación, no influyeron en la actividad de HNE (no mostrado).

La interacción entre Der p 1 y h-elafin se analizó como se describe anteriormente, utilizando SDS-PAGE y análisis de transferencia Western (Figura 4A)

Figura 4. Inactivación de h-elafin por Der p 1. (A) Escisión de elafina por Der p 1 (análisis SDS-PAGE / Western Blot). Cima: Se incubaron 0,5 μg de h-elafina con C-Der p 1 (2 ha 37 ° C) y L-Cys (20 mM). Se utilizaron diferentes relaciones molares C-Der p 1 / elafina: 0,5: 1 (carril 4), 0.1:1 (carril 5), 0.05:1 (carril 6), 0.01:1 (carril 7) y 0.005: 1 (carril 8). h-Elafin también se incubó sola (carril 1), con L-Cys 20 mM (carril 2), o con C-Der p 1 en ausencia de L-Cys (carril 3). Las muestras se diluyeron con tampón de carga (SDS y 2-mercaptoetanol) y se realizó el análisis SDS-PAGE (gel al 15%). Después de la electrotransferencia, se sondaron sucesivamente las membranas con anticuerpos IgG anti-h-elafina (dilución 1 / 1.000, 1 h) e IgG de cabra anti-conejo (dilución 1 / 5.000, 20 min) acoplados a peroxidasa de rábano picante. Las transferencias se revelaron usando el reactivo ECL (Amersham). Fondo: Como anteriormente, excepto que se usó CS-Der p 1 en lugar de C-Der p 1. Se usó la relación molar de CS-Der p1 / elafina: 0.5: 1 (carril 4), 0.1:1 (carril 5), 0.05:1 (carril 6), 0.01:1 (carril 7) y 0.005: 1 (carril 8). Elafin también se incubó sola (carril 1), con L-Cys 20 mM (carril 2), o con CS-Der p1 en ausencia de L-Cys (carril 3, relación molar CS-Der p 1 / elafina = 1: 1). (B) Inactivación funcional de h-elafina por Der p 1 medida por la actividad HNE residual. La h-elafina se incubó (0, 1, 2, 4 h) a 37 ° C con Der p 1 (C / CS) y L-Cys (20 mM), con o sin E-64 (0,4 mM). Se eligió una relación molar Der p 1 / h-elafina de 0,3: 1 sobre la base del análisis de gel (A). Al final de la incubación, se midió la actividad anti-HNE residual de h-elafina como se describe en la Figura 3. Cuadrícula, C-Der p 1 + E-64 diamantes, CS-Der p 1 + E-64 circulos, C-Der p 1 triangulos, CS-Der pág. 1.

La escisión de h-elafina se obtuvo en una relación CS-Der p 1 / h-elafina de 0,5: 1 (Figura 4A, fondo, carril 4). La disminución de la proporción resultó en la preservación gradual de la integridad de h-elafin (Figura 4A, fondo, carriles 4–8). L-Cys por sí sola no influyó en la migración de h-elafin (carril 2). De manera muy significativa, la interacción entre CS-Der p 1 y h-elafina en ausencia de L-Cys aún inducía la degradación de h-elafina (Figura 4A, fondo, carril 3), lo que sugiere que la actividad de degradación de h-elafina se debe al menos en parte a la serina proteasa contenida en CS-Der p 1.

Como era de esperar, C-Der p 1, que solo tiene actividad de cisteína proteinasa, necesitaba activación con L-Cys para poder degradar la h-elafina (Figura 4A, cima, carriles 4–8, comparado con carril 3, sin L-Cys). En conjunto, los datos presentados aquí sugieren que las actividades de serina y cisteína de Der p 1 son capaces de degradar la h-elafina.

Para el ensayo funcional (Figura 4B), se eligió una relación molar "intermedia" Der p 1 / h-elafina de 0,3: 1 sobre la base de que una relación de 0,5: 1 escindió la mayor parte de la molécula de elafina nativa después de 2 h (Figura 4A, carril 4), mientras que una relación de 0,1: 1 era menos eficiente (Figura 4A, carril 5).

Los resultados revelan que tanto CS-Der p 1 como C-Der p 1 inactivaron funcionalmente h-elafina. La incubación de CS-Der p 1 con E-64 no pudo prevenir la inactivación de h-elafina, lo que respalda los resultados del análisis de transferencia Western de que, de hecho, la serina proteasa contribuye de manera muy significativa a la actividad de degradación de h-elafina en la fracción CS. Sin embargo, C-Der p 1, que sólo tiene actividad de cisteína proteinasa, perdió su actividad inactivante de h-elafina tras la incubación con E-64, lo que sugiere que tanto la serina como la cisteína proteasas tienen la capacidad de inactivar la h-elafina.

Figura 5. Interacciones Der p 1 / h-SLPI. (A) Incubación de C-Der p 1 con h-SLPI nativa (análisis SDS-PAGE). Se incubaron dos microgramos de h-SLPI (2 ha 37 ° C) con C-Der p 1 y L-Cys (20 mM), con (carril 4) o sin (todos los demás carriles) S-64. Se utilizaron dos relaciones molares diferentes C-Der p 1 / h-SLPI: 0,5: 1 (carriles 3-5) y 1 (carril 6). h-SLPI también se incubó solo (carril 1) o con L-Cys (carril 2). A continuación, las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE (gel al 15%) como se explicó anteriormente. (B) Incubación de CS-Der p 1 con h-SLPI nativa (análisis SDS-PAGE). Relaciones molares de CS-Der p 1 / h-SLPI: 0,5: 1 (carriles 3-5), 1:1 (carril 6) y 0,25: 1 (carril 7). Carril 1, h-SLPI solo carril 2, h-SLPI + L-Cys carril 3, h-SLPI + CS-Der p 1 carril 4, h-SLPI + CS-Der p 1 + E-64 carril 5, h-SLPI + CS-Der p 1 + L-Cys carriles 6 y 7, como carril 5 (pero diferentes proporciones molares, véase más arriba). N.B .: La banda marcada con un asterisco es un contaminante observado en algunas preparaciones de R & ampD h-SLPI. Los números 7.2 y 32 representan el peso molecular (kD) de los estándares. (C) Incubación de CS / C-Der p 1 con h-SLPI nativa o desnaturalizada (sin o con incubación con DTT) (análisis SDS-PAGE). Izquierda: sin preincubación con DTT: se incubaron 2 μg de h-SLPI (2 ha 37 ° C) con C / CS-Der p 1 y L-Cys (20 mM), con o sin E-64. La relación molar C / S-Der p 1 / h-SLPI fue de 0,5: 1. Carril 1, h-SLPI solo carril 2, h-SLPI + L-Cys + C-Der p 1 carril 3, h-SLPI + C-Der p 1 + L-Cys + E-64 carril 4, h-SLPI + CS-Der p 1 + L-Cys carril 5, h-SLPI + CS-Der p 1 + L-Cys + E-64. A continuación, las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE (gel al 15%) como anteriormente. Derecha: Preincubación con DTT: se preincubaron 2 μg de h-SLPI durante 30 min a 37 ° C con DTT 2 mM. A continuación, se incubó la mezcla de h-SLPI (2 ha 37ºC) con las mismas moléculas que antes. Carriles: como anteriormente. N.B .: El contaminante de I + D + i en h-SLPI, aunque está presente, es menos notable aquí. Los números 7.2 y 32 representan, como anteriormente, patrones de peso molecular (kD).

Usando una relación molar C / CS-Der p 1 / SLPI de 0.5: 1, la preincubación de h-SLPI con DTT 2 mM lo hizo susceptible a una mayor escisión tanto por C-Der p 1 (comparar la Figura 5C, izquierda y Derecha, carril 2) y CS-Der p 1 (comparar la Figura 5C, izquierda y Derecha, carril 4). En las diluciones de DTT utilizadas en el experimento, verificamos que el DTT en sí mismo no afectaba la actividad de Der p 1 (no mostrado). Curiosamente, tanto C-Der p 1 (Figura 5C, Derecha, carril 3) y actividades de CS-Der p 1 (Figura 5C, Derecha, carril 5) fueron abolidos en un grado similar con E-64, lo que sugiere que es la cisteína proteasa de Der p 1, la que juega un papel en la degradación de h-SLPI tratada con DTT.

A diferencia de h-SLPI (Figura 5), ​​m-SLPI fue muy sensible a la inactivación de CS-Der p 1 (Figura 6)

Figura 6. Degradación de m-SLPI nativa por Der p 1 (análisis SDS-PAGE). Se incubaron dos microgramos de m-SLPI (2 ha 37 ° C) con o sin CS-Der p 1 y con o sin L-Cys (20 mM). Se eligió una relación molar CS-Der p 1 / m-SLPI de 0,5: 1 de experimentos piloto anteriores. Carril 1, m-SLPI solo carril 2, m-SLPI + CS-Der p 1 carril 3, como carril 2 + L-Cys carril 4, m-SLPI + L-Cys carril 5, CS-Der p 1 solo. Las muestras se diluyeron y se sometieron a análisis SDS-PAGE (acrilamida al 15%) como anteriormente. N.B .: m-SLPI se ejecuta como un doblete. Los pesos moleculares estándar (kD) se indican mediante flechas.

Debido a que los tres inhibidores de elastasa humana A1-Pi, elafin y SLPI estudiados anteriormente son los únicos tres inhibidores principales de elastasa identificados hasta ahora en el pulmón, se nos solicitó probar si Der p 1 era capaz de inactivar la capacidad inhibidora de elastasa en humanos. BALF. Debido a que los pacientes con síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) establecido tienen un nivel muy alto de antiproteasas activas en su BALF (21), decidimos estudiar un conjunto de seis muestras de BAL.

Como se demostró en nuestro estudio anterior (21), mostramos aquí que BALF no tratado tuvo una marcada actividad anti-HNE durante el transcurso del tiempo del experimento, con una inhibición de HNE que oscilaba entre el 85 y el 98%. La incubación de BALF con L-Cys sola no cambió esta actividad. Por el contrario, tanto C-Der p 1 como CS-Der p 1, cuando se incubaron con L-Cys, degradaron la actividad anti-HNE de este grupo de BALF (Figura 7)

Figura 7. Inactivación de muestras de líquido de lavado broncoalveolar humano (BALF) con Der p 1. Veinte microlitros de BALF de pacientes con SDRA establecido (ver M ateriales y M étodos) se incubaron (0, 1, 2, 4 h) con 7.5 μg (1.2 μM) de Der p 1 (C / CS) y L-Cys (20 mM), con o sin E-64 (0.4 mM), en un volumen final de 250 μl. Después de la incubación, se agregaron 10 μl de la mezcla de incubación a 10 ng de HNE en pocillos de microplacas y, después de 15 minutos más de incubación a 37 ° C, se agregó el sustrato de HNE como se explicó anteriormente. Cuadrícula, BALF solo diamantes, BALF + L-Cys circulos, BALF + CS-Der p 1 + L-Cys + E-64 triangulos, BALF + CS-Der p 1 + L-Cys cuadrados con signos más, BALF + C-Der p 1 + L-Cys.

Der p 1 es uno de los aeroalergenos más comunes asociados con el asma atópica (25-26). Varios estudios recientes han implicado la actividad de cisteína proteasa de Der p 1 en la patogenia del asma (7-10). En el presente artículo hemos explorado otras cuestiones relacionadas con las propiedades enzimáticas de Der p 1 en relación con su actividad sobre las moléculas de defensa pulmonar A1-Pi, SLPI y elafina.

La principal proteína presente en Der p 1 purificada por afinidad convencional, que aquí hemos denominado CS-Der p 1, es sin duda una cisteína proteinasa, como lo demuestra la pureza del gel teñido con plata y la secuenciación N-terminal (7, 27). Sin embargo, trabajos anteriores sugirieron que hay un contaminante menor de serina proteasa en esa preparación, que se eliminó con un paso adicional de cromatografía de afinidad SBTI (28-30). Nuestros resultados confirman y amplían estos hallazgos al mostrar, utilizando una amplia variedad de sustratos sintéticos, que de hecho las actividades de cisteína y proteasa coexisten en CS-Der p 1, y que el paso adicional SBTI eliminó el contaminante de serina proteasa, porque la proteína restante (C -Der p 1) solo pudo degradar el sustrato de cisteína proteasa (Figura 2). Sin embargo, no hemos podido purificar e identificar el componente de serina proteasa, probablemente debido a su muy alta afinidad por SBTI, lo que hace que sea muy difícil eluir de la columna (A. Brown, datos no publicados).

Debido a la importancia de los inhibidores de elastasa A1-Pi, elafina y SLPI como moléculas clave en la defensa del pulmón (13), se nos solicitó determinar si CS-Der p 1 y C-Der p 1 podían o no para inactivar bioquímica y funcionalmente estas moléculas.

De acuerdo con nuestro estudio anterior (7), encontramos que CS-Der p 1 podría inactivar h-A1-Pi, y además establecimos aquí que es la cisteína proteinasa de Der p 1 la responsable de la h-A1-Pi –Actividad degradante, porque CS- y C-Der p 1 tienen actividades similares. Por el contrario, para la h-elafina, encontramos que la serina proteasa tenía la actividad inactivante más potente, como lo ilustra el hecho de que incluso en presencia de una cisteína proteasa inactiva (sin L-Cys) la h-elafina se degradaba casi por completo. Además, cuando la cisteína proteasa fue inhibida por E-64, la actividad de h-elafina todavía se degradó en el mismo grado que cuando no se añadió E-64. Estos hallazgos sugieren que la serina proteasa, aunque probablemente presente como un contaminante menor en la fracción CS-Der p 1, tiene una afinidad mucho mayor por la h-elafina que la cisteína proteasa.

Curiosamente, h-SLPI y m-SLPI no fueron igualmente sensibles a Der p 1. De hecho, m-SLPI fue mucho más sensible que h-SLPI (comparar las Figuras 5 y 6), y este último solo se volvió susceptible a la escisión por Der p 1 después del pretratamiento con DTT, que rompe la molécula mediante la reducción de sus enlaces disulfuro internos. Esta diferencia de sensibilidad es notable en vista de las homologías significativas entre m-SLPI y h-SLPI (58% en general) (31) y entre elafina humana (que es sensible a Der p 1) y SLPI humana (que no lo es, 47 % de homología) (13). Es interesante que las tres moléculas que se encuentran en el presente estudio como sensibles a Der p 1 (h-elafin, h-A1-Pi y m-SLPI) tienen una alanina en o cerca del sitio reactivo antiproteasa (en las posiciones P1 , P4 y P4, respectivamente) mientras que no hay alanina en h-SLPI. De hecho, cuando se estudiaron los sitios de escisión de Der p 1 en h-A1-Pi (7), se demostró que las enzimas escindían a ambos lados del residuo de alanina. Además, m-SLPI tiene un motivo alanina-arginina en la posición P3-P4, también presente en el sustrato sintético de cisteína proteinasa Boc-Gln-Ala-Arg-AMC usado en este estudio.

Independientemente del mecanismo de inhibición diferencial de Der p 1 de las antiproteasas pulmonares, nuestro in vitro Los experimentos realizados con las proteínas humanas aisladas SLPI, A1-Pi y elafina revelaron que las dos últimas moléculas eran en su mayoría susceptibles a las proteinasas de cisteína y serina presentes en Der p 1, respectivamente, mientras que in vitro La resistencia de h-SLPI a Der p 1 sugeriría que el primero puede no ser un sustrato significativo de Der p 1 en vivo.

Para determinar la importancia de estos hallazgos ex vivo en muestras de pulmón humano, obtuvimos BALF de pacientes con SDRA establecido, con el conocimiento de que estos pacientes tendrían niveles altos de antiproteasas (21) y proporcionarían un buen marcador de sensibilidad pulmonar a Der p 1. De hecho, la incubación de líquido BALF con Der p 1 de cualquiera de las preparaciones (C / CS-Der p 1) revela que ambas proteasas conducen a una pérdida marcada de actividad antielastasa en el fluido. Este hallazgo está de acuerdo con nuestros datos, que muestran la alta susceptibilidad de las antielastasas A1-Pi y elafin humanas a la escisión por las proteasas del ácaro. Debido a que se han detectado concentraciones superiores a 3 ng / ml de Der p 1 en el BAL de individuos alérgicos (32) y las antiproteasas estudiadas aquí también están presentes en ng / ml en BAL (21), proporciones molares similares de Der p 1 : antiproteasas como las utilizadas in vitro es probable que estén presentes en vivo, lo que hace que nuestros hallazgos sean fisiopatológicamente relevantes. Los estudios presentados aquí se suman a nuestro conocimiento sobre las actividades biológicas de Der p 1 y el papel de sus funciones enzimáticas en el desarrollo y persistencia del asma al comprometer las defensas antiproteasas del pulmón. Además, Der p 1 tiene un efecto directo sobre algunos de los componentes del sistema inmunológico adaptativo, incluidos CD23 en las células B y CD25 en las células T, lo que aumentaría la síntesis de IgE al interrumpir una señal de retroalimentación negativa y favorecer una Th1 a Th2. cambio al afectar las respuestas de interferón-γ, respectivamente (8, 9, 20, 27). La consecuencia de esto sería promover respuestas inflamatorias alérgicas. Además, Der p 1 tiene actividades destructivas en las células estructurales ya que altera las uniones de las células epiteliales (10), lo que facilita el transporte del alérgeno a través del epitelio.

En general, estos hallazgos tienen implicaciones potenciales al menos en tres niveles. Primero, sugieren que después de la exposición de la mucosa bronquial al sedimento fecal de HDM, las proteasas de ácaros solubilizados resultantes pueden acceder al intersticio pulmonar, promover respuestas Th2 y sesgar el equilibrio elastasa / antielastasa hacia elastasa y, por lo tanto, hacia un estado proinflamatorio. De hecho, la elastasa, además de escindir una variedad de sustratos dentro del pulmón (33), puede regular al alza la potente quimiocina neutrófila IL-8 (34-35), con la consiguiente inflamación neutrofílica, que en casos extremos podría desencadenar la aparición de un asma fatal. (36–40).

En segundo lugar, el inhibidor de HNE h-A1-Pi puede inhibir la hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR) mediada por proteasa en un modelo alérgico (41). Por lo tanto, se deduce que la inactivación de A1-Pi por Der p 1 puede ser perjudicial al facilitar AHR.

En tercer lugar, A1-Pi, SLPI y elafina poseen propiedades además de su actividad antielastasa. Pueden funcionar como antimicrobianos, ya sea directa o indirectamente (15-16, 18-19, 42) y, al menos para elafin y SLPI, pueden “cebar” el sistema inmunológico innato (17, 43). Por tanto, la inactivación de estas funciones inmunitarias innatas adicionales puede contribuir a las exacerbaciones infecciosas que se encuentran en los pacientes con asma (44-45).

Además, nuestro informe sugiere por primera vez que la serina proteasa de Der p 1 también puede ser un importante objetivo terapéutico e identifica a la elafina, una molécula clave en la defensa pulmonar, como un sustrato importante para esta proteasa (13-14, 46).

Será necesario seguir trabajando para establecer en vivo si un bloqueo dual de las proteasas de cisteína y serina de Der p 1 será beneficioso para los pacientes con inflamación alérgica inducida por HDM, modulando las respuestas de tipo 2 y / o restaurando las funciones antimicrobianas pulmonares.


RESULTADOS

SLC25A46 se asocia con varias proteínas OM, particularmente componentes en la dinámica mitocondrial

En un estudio anterior, encontramos que los casos raros de PCH probablemente fueron causados ​​por una deleción en el exón 1 (que causa la alteración del gen) o una mutación puntual en el exón 8 en la proteína SLC25A46 de OM mitocondrial (la leucina en la posición 341 se reemplaza con prolina, denominada L341P (Pálido et al., 2016) SLC25A46 L341P no era estable, y las mitocondrias mostraban mitocondrias hiperfusionadas y otras morfologías aberrantes (Wan et al., 2016). Para investigar la función potencial de SLC25A46, realizamos inmunoprecipitaciones y análisis de espectrometría de masas en mitocondrias aisladas de una línea celular HEK293T estable que expresa el tipo salvaje (WT) SLC25A46 etiquetado con un epítopo de hemaglutinina (HA) 2 × en el extremo N-terminal. Una etiqueta colocada en el extremo N o C no interfirió con la inserción en el OM mitocondrial (Figura complementaria S1A Abrams et al., 2015 Janer et al., 2016 Wan et al., 2016). Después de la lisis en digitonina al 1%, SLC25A46 interactuó principalmente con proteínas involucradas en la fisión y fusión como MFN1 / 2 u OPA1 y con componentes del complejo MICOS (Tabla complementaria S1). Un subconjunto de estos posibles socios de interacción fue confirmado por una variedad de enfoques. Primero, solubilizamos las mitocondrias que contenían SLC25A46 con una etiqueta HA N-terminal en 1% de digitonina y usamos gradientes de glicerol para examinar la distribución de proteínas mitocondriales (Figura 1A). SLC25A46 WT migró principalmente cerca del centro del gradiente en las fracciones 7-13. La migración de las proteínas OM MFN1 y MTCH2 también se enriqueció en fracciones similares a las de la proteína SLC25A46 WT. En cambio, MIC60, MIC27 y MIC19 del complejo MICOS y TOMM40 migraron en fracciones más pesadas (Bohnert et al., 2015 Friedman et al., 2015). Los controles adicionales incluyeron PNPase y YME1L del espacio intermembrana, TIMM23 en el MI y PreP y LRP130 localizados en matriz, que mostraron todos un patrón de distribución diferente al SLC25A46. Para evaluar la unión de SLC25A46 y MFN1, el análisis de las fracciones 9, 11 y 13 de coinmunoprecipitación (coIP) reveló que un subconjunto de MFN1 y MFN2 de hecho interactuaba con SLC25A46 (Figura 1B). Las interacciones entre SLC25A46 y MFN1 / MFN2 fueron específicas porque la proteína de OM MID51 no copurificó con SLC25A46 WT o L341P en experimentos de coIP similares (Figura 2A). También usamos el sistema de gradiente de glicerol para sondear el ensamblaje de SLC25A46 L341P de una línea celular similar, una línea celular HEK293T estable que expresa 2xHA-SLC25A46 L341P. En contraste, SLC25A46 L341P fue menos abundante y sedimentado en las fracciones 17-23, cerca del fondo del gradiente (Figura 1A y Figura complementaria S1B). Los complejos de TOMM40, MFN1 y MIC60 no se alteraron en las mitocondrias con SLC25A46 L341P (Figura complementaria S1B).

FIGURA 1: SLC25A46 comigra con la dinámica mitocondrial y las proteínas MICOS. (A) Centrifugación de densidad en gradiente de glicerol de extractos mitocondriales generados a partir de una línea celular estable que expresa 2xHA-SLC25A46 WT. Las mitocondrias se solubilizaron en digitonina al 1% y los lisados ​​se cargaron en un gradiente lineal de glicerol al 10-50% y se centrifugaron durante la noche. Las fracciones 1 a 23 se analizaron con los anticuerpos indicados. Se incluyó una muestra similar y se usó el anticuerpo HA para determinar el ensamblaje de SLC25A46 L341P. SM, material de partida. (B) Inmunoprecipitación (IP) con el anticuerpo HA de 2xHA-SLC25A46 WT de las fracciones indicadas (1, 9, 11,13) de la centrifugación en gradiente de densidad de glicerol en A. Las muestras de entrada corresponden al 10% de cada fracción. Se utilizaron anticuerpos contra HA, MFN1 y MFN2. (C) Las mitocondrias aisladas de las células HEK293T que expresan de forma estable 2xHA-SLC25A46 WT o L341P se solubilizaron con digitonina y los extractos mitocondriales se resolvieron mediante BN-PAGE bidimensional. Para la inmunotransferencia se utilizaron anticuerpos contra MFN1, TOMM40, PreP y HA. Para MFN1, TOMM40 y PreP, se muestra el análisis de las mitocondrias WT y los complejos migraron de manera idéntica en las mitocondrias de la línea celular SLC25A46 L341P. (▪) El complejo MFN1-SLC25A46. (D, E) Se aislaron mitocondrias de células LAN5 y luego se lisaron en digitonina al 1%. Los extractos mitocondriales se resolvieron mediante anticuerpos BN-PAGE un (D) o bidimensionales (E) para SLC25A46 endógenos, MIC19, MIC60, MFN2 y MTCH2. En D, se muestran exposiciones más cortas y más largas para SLC25A46 para resaltar el complejo más grande que se une al complejo MICOS. (▪) El complejo MFN1-SLC25A46 (▴) el complejo MICOS-SLC25A46 (*) el complejo MTCH2-SLC25A46.

FIGURA 2: SLC25A46 interactúa con proteínas importantes para la biogénesis y morfología mitocondrial. (A) IP con el anticuerpo HA de extractos de células completas de HEK293T o células HEK293T estables que expresan 2xHA-SLC25A46 WT o 2xHA-SLC25 L341P. Las células se reticularon con ditiobis (propionato de succinimidilo) antes de la lisis. Las muestras se analizaron con los anticuerpos indicados. Las muestras de entrada representan el 2% del material utilizado para la PI. Las formas corta (S) y larga (L) de OPA1 están marcadas. (B) Nivel de estado estable de los socios de interacción SLC25A46 en HCT116 WT o SLC25A46 knockear (SLC25A46 - / ) se determinaron las células. Las mitocondrias de cada línea celular fueron aisladas, solubilizadas, separadas por SDS-PAGE y analizadas con inmunotransferencia. Tres clones knockout de una sola célula diferentes designados 1.7, 4.1 y 4.3, usando dos gRNA diferentes. El asterisco marca una banda inespecífica del anticuerpo. (C) Niveles de estado estacionario de MFN1 y MFN2 en HEK293 T-REx Flp-In WT, y SLC25A46 Las células - / - se midieron en tres experimentos independientes. Las mitocondrias de cada línea celular fueron aisladas, solubilizadas, separadas por SDS-PAGE y analizadas con inmunotransferencia. TOMM40 se incluyó como control de carga. (D) Análisis densitométrico de C. Los resultados se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes. t prueba, pag & lt 0,05. (E) Análisis de MFN1 y MFN2 expresión en HEK293 T-REx Flp-In WT y SLC25A46 - / - células por qPCR (media ± SEM, norte = 3). (F) Nocaut de SLC25A46 no altera la composición de fosfolípidos de las mitocondrias. Los fosfolípidos se extrajeron de 0,75 mg de mitocondrias en las líneas celulares como en B, se separaron mediante cromatografía en capa fina y se visualizaron mediante tinción con azul de molibdeno. Las imágenes escaneadas se analizaron utilizando el software Cantidad 1, y la abundancia relativa de cada fosfolípido se calculó como porcentaje del fosfolípido total en cada muestra (media ± SEM, norte = 3). CL, cardiolipina PA, ácido fosfatídico PC, fosfatidilcolina PE, fosfatidiletanolamina PI, fosfatidilinositol PG, fosfatidilglicerol PS, fosfatidilserina.

Utilizando geles nativos de azul (BN), también investigamos la migración de SLC25A46 WT y L341P, así como la de proteínas asociadas. La mayoría de SCL25A46 WT tenía una masa molecular de 70-200 kDa, pero también se identificaron complejos más grandes (Figura 1C). Por el contrario, la mayoría de SCL25A46 L341P migró a un tamaño mayor, & gt600 kDa, pero SLC25A46 L341P pudo detectarse en todo el gel. En las mitocondrias de las células neuronales LAN5 (Figura 1D), el SLC25A46 endógeno migró en complejos de tamaño similar a los de las células HEK293T que expresan HA-SCL25A46.MFN1, MFN2 y MTCH2 también comigraron con SLC25A46 (Figura 1, complejo C – E MFN1 / 2 – SLC25A46 [▪] y complejo MTCH2 – SLC25A46 [▴]), y se detectó una pequeña cantidad de SLC25A46 en el complejo más grande que comigró con MIC19 y MIC60 (Figura 1, el complejo D y E MICOS – SLC25A46 está marcado con un asterisco). TOMM40 no comigró con SLC25A46 (Figura 1C). Los complejos de TOMM40, MFN1 y MIC60 no se alteraron en las mitocondrias con SLC25A46 L341P (Figura complementaria S1B). Por tanto, el ensayo BN-gel apoya que la mutación L341P en SLC25A46 altera la formación de su complejo. Además, el WT SLC25A46 comigró con las proteínas dinámicas MFN1 y MFN2 además de MTCH2, y una pequeña cantidad de SLC25A46 comigró con el complejo MICOS. En resumen, SLC25A46 se asocia con varias proteínas y puede funcionar como un andamio para el ensamblaje de proteínas involucradas en la ultraestructura mitocondrial.

Debido a que las interacciones entre SLC25A46 y las proteínas asociadas pueden ser transitorias o débiles, realizamos entrecruzamiento intracelular seguido de solubilización celular y ensayos de coIP (Figura 2A). Esto pareció atrapar interacciones porque SLC25A46 coprecipitó con OPA1 (formas cortas y largas de DeVay et al., 2009), MFN1, MFN2 y componentes MICOS MIC60 y MIC19. Esto concuerda con nuestro estudio anterior (Wan et al., 2016) y publicaciones recientes de que SLC25A46 es un componente similar a la levadura Ugo1, que mantiene la morfología mitocondrial (Abrams et al., 2015 Janer et al., 2016). Además, TOMM40 interactuó con SLC25A46, lo que puede reflejar un papel para TOMM40 en el ensamblaje SLC25A46. SCL25A46 L341P también se unió a proteínas similares, pero mostró un aumento de la unión con TOMM40, MTCH2 y MULAN, una ubiquitina ligasa E3 que funciona en el recambio de proteínas OM (Braschi et al., 2009 Ambivero et al., 2014 Yun et al., 2014). Sin embargo, SLC25A46 no mostró una unión fuerte a MIC27. Para confirmar la especificidad de las interacciones de SLC25A46 con proteínas OM, encontramos que MID51 no copurificaba con SLC25A46 (Figura 2A). Este experimento de inmunoprecipitación en condiciones de entrecruzamiento respalda que las interacciones de SLC25A46 con proteínas asociadas pueden ser transitorias y requieren un método como el entrecruzamiento para la estabilización.

Se utilizó el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / Cas9 para eliminar SLC25A46 de la línea celular HCT116. SLC25A46 se eliminó con éxito, y tres líneas celulares monoclonales representativas (designadas 1.7, 4.1, 4.3 SLC25A46 - / - ) fueron elegidos para una caracterización adicional. El análisis de los niveles en estado estacionario de proteínas asociadas identificadas en la Figura 2A se probó mediante inmunotransferencia (Figura 2B). La abundancia de la mayoría de estas proteínas no se alteró, lo que indica que SLC25A46 no es una proteína asociada genuina con el complejo MICOS. Sin embargo, observamos un ligero aumento en los niveles de las proteínas de dinámica mitocondrial MFN1 y MFN2 (Figura 2B). También observamos un aumento de los niveles de estado estable de MFN1 y MFN2 en las mitocondrias cuando SLC25A46 fue eliminado en la línea celular HEK293 T-REx Flp-In (Figura 2, C y D). Específicamente, la abundancia de MFN1 / 2 aumentó ~ 1,6 y 2 veces, respectivamente (Figura 2D). Para analizar si estos niveles elevados fueron causados ​​por una mayor importación de proteínas, importamos MFN1-13myc y MFN2-20myc radiomarcados (Chen et al., 2003) en mitocondrias aisladas de WT y SLC25A46 - / - HEK293 T-REx Flp-In y analizó la importación por SDS-PAGE y BN-PAGE (Figura complementaria S2, A y B). La presencia de etiquetas myc adicionales en el extremo C de MFN1 y MFN2 no interfiere con la función o el ensamblaje (Chen et al., 2003) pero da como resultado un aumento del peso molecular (Figura complementaria S2, A y B). Se recuperaron MFN1 y MFN2 importados en la fracción de gránulos después de la extracción con álcali. Para ambas proteínas, no observamos ningún cambio en la importación de proteínas. También incluimos reacciones de importación de control que carecían de mitocondrias para confirmar que MFN1 y MFN2 no se fraccionaron inespecíficamente en el sedimento después de la extracción con álcali MFN1 y MFN2 no se recuperaron en la fracción del sedimento en ausencia de mitocondrias (Figura complementaria S2A). Tampoco notamos ninguna diferencia en MFN1 y MFN2 expresión en HEK293 T-REx Flp-In SLC25A46 células knockout usando PCR cuantitativa (qPCR Figura 2E). Por tanto, la desactivación de SLC25A46 estabiliza MFN1 y MFN2 en las mitocondrias debido a la disminución de la degradación de MFN1 y MFN2.

SLC25A46 no funciona en las vías de tráfico y biogénesis de fosfolípidos mitocondriales

Debido a que el complejo MICOS se ha implicado en la biogénesis y el tráfico de lípidos y se creía que el homólogo de levadura SLC25A46, Ugo1, regulaba la composición lipídica local de la OM (Hoppins et al., 2009 Anton et al., 2011), evaluamos si los niveles de lípidos mitocondriales estaban alterados en SLC25A46 - / - células. Se analizó el contenido total de fosfolípidos en las mitocondrias y no se detectaron diferencias (Figura complementaria S3A). El perfil de lípidos se evaluó mediante cromatografía en capa fina (Figura complementaria S3B) y se cuantificaron los fosfolípidos individuales (Figura 2F). El perfil de los lípidos individuales no fue diferente en el SLC25A46 - / - líneas celulares que en las células WT HCT116. Por tanto, SLC25A46 no juega un papel directo en la biogénesis de lípidos o el tráfico de lípidos.

La abundancia de MFN1 y MFN2 aumenta en células que carecen de SLC25A46

Debido a que observamos niveles más altos de estado estable de MFN1 y MFN2 en células que carecen de SLC25A46, investigamos el ensamblaje de estas proteínas. Debido a que SLC25A46 se expresa en gran medida en el tejido neuronal y el mutante SLC25A46 altera la función neuronal (Haitina et al., 2006 Abrams et al., 2015 Wan et al., 2016), utilizamos ARN en horquilla cortos (shRNA) para derribar SLC25A46 en células LAN5 (Figura 3, A y B). Como se observa en HCT116 y HEK293 T-REx Flp-In SLC25A46 - / - células, los niveles de estado estacionario de MFN1 y MFN2 estaban ligeramente elevados después de la caída de SLC25A46 (Figura 3A). Esto condujo a una abundancia elevada de complejos MFN1 y MFN2 en células que carecen de SCL25A46 cuando las mitocondrias aisladas se solubilizaron en digitonina y se separaron mediante BN-PAGE (Figura 3B). Nuevamente, no observamos ningún cambio marcado en la expresión de las transcripciones para MFN1 y MFN2 (Figura 3C). Obtuvimos resultados similares en HCT116 SLC25A46 - / - celdas (Figura complementaria S4).

FIGURA 3: Los niveles de SLC25A46 afectan los niveles de estado estacionario y el ensamblaje de MFN1 y MFN2. (A) Se determinó la oligomerización de MFN1 y MFN2 en mitocondrias aisladas de líneas celulares LAN5 en las que SLC25A46 se derribó con diferentes construcciones de ARNhc después de la inducción de doxiciclina usando BN-PAGE e inmunotransferencia. (B) Los niveles en estado estacionario de las proteínas indicadas se determinaron utilizando los mismos extractos mitocondriales cargados en BN-PAGE en A. (C) Análisis de MFN1 y MFN2 expresión en células LAN5 en las que SLC25A46 fue derribado con una construcción de shRNA específica por qPCR (media ± SEM, norte = 3). (D) Se investigó la red mitocondrial en las líneas celulares LAN5 en las que se derribó SLC25A46 después de la inducción de doxiciclina mediante tinción de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo contra la proteína de matriz Mortalin o la proteína OM TOMM20. Se usó 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol para teñir el núcleo. Barra de escala, 10 μm. (E) Cuantificación de la red mitocondrial de D. Para cada experimento, se contaron 100 células (media ± SEM, norte = 3). (F) Las células vivas se cuantificaron usando un ensayo de azul tripán en las líneas LAN5 y HEK294 T-REx Flp-In. Se sembró en placa un número igual de células de cada línea, y luego se contaron las células vivas después de 4 días. La expresión de SLC25A46 en LAN5 se eliminó durante 2 semanas antes del experimento. Los datos representan la media ± SEM. (norte = 3). (G) Como en A, pero la oligomerización de MFN1 y MFN2 se analizó en células HEK293 T-REx Flp-In que carecen de SLC25A46. El knockout de SLC25A46 se rescató expresando 2xHA-SLC25A46 WT o L341P durante 48 h después de la inducción con 10 ng / ml de doxiciclina. (H) Los lisados ​​de G se separaron mediante SDS-PAGE y los niveles en estado estacionario de las proteínas indicadas se investigaron mediante inmunotransferencia. Se detectaron 2xHA-SLC25A46 y SLC25A46 endógeno con anti-SLC25A46 y se incluyó una exposición más prolongada para detectar HA-SLC25A46 L341P del panel. También se incluyó un panel con anti-HA para detectar HA-SLC25A46 WT y L341P expresados.

Para determinar si los estados de oligomerización mejorados de MFN1 y MFN2 conducen a mitocondrias hiperfusionadas, derribamos SLC25A46 en células LAN5 por interferencia de ARN (ARNi) y visualizamos las mitocondrias mediante tinción de inmunofluorescencia usando un anticuerpo contra la proteína de matriz Mortalin y la proteína OM TOMM20. Como se esperaba, las mitocondrias parecían alargadas e hiperfundidas en las células con SLC25A46 derribado, como se informó anteriormente (Figura 3D Abrams et al., 2015 Janer et al., 2016 Wan et al., 2016). Para confirmar que la red mitocondrial estaba realmente hiperfundida en células de caída de SLC25A46, cuantificamos la red mitocondrial (Figura 3E). En las células que carecían de SLC25A46, la red consistía en aproximadamente un 65% de mitocondrias hiperfusionadas y aproximadamente un 30% de mitocondrias normales. Por el contrario, las células de control tenían una red con aproximadamente un 70% de mitocondrias normales y aproximadamente un 25% de mitocondrias hiperfusionadas. Por lo tanto, la red mitocondrial en las células LAN5 que carecen de SLC25A46 es aberrante, marcada con una red hiperfundida.

La oligomerización de MFN1 y MFN2 se puede confirmar mediante la reticulación con un reticulante de cisteína-cisteína, que produce complejos de alto peso molecular en geles de SDS. En SLC25A46 - / - HCT116 o LAN5 SLC25A46 knockdown, se detectó una abundancia aumentada de oligómeros MFN1 y MFN2 por reticulación (Figura complementaria S5, A y B). Nuestros resultados apoyan la observación de que la expresión disminuida de SLC25A46 conduce a mitocondrias hiperfusionadas (Figura 3, D y E Abrams et al., 2015 Wan et al., 2016), que se correlaciona con un aumento de los niveles de estado estacionario y la oligomerización de los complejos MFN1 y MFN2 en las mitocondrias hiperfusionadas.

Debido a que las mitocondrias hiperfundidas podrían influir en la viabilidad celular, analizamos el crecimiento celular de HEK293 T-REx Flp-In SLC25A46 - / - y células LAN5 en las que la expresión de SLC25A46 fue silenciada por un ARNhc específico (Figura 3F). Sin embargo, no se detectaron cambios en la viabilidad celular en estas líneas (Figura 3F). Nuestros resultados contrastan con un estudio reciente de Janer et al. (2016) en el que las líneas de fibroblastos derivadas de un paciente o anuladas para SLC25A46 mostraron un aumento de la senescencia celular.

La expresión de SLC25A46 L341P no rescata niveles elevados de MFN1 y MFN2 en células que carecen SLC25A46

A continuación, analizamos si el mutante SLC25A46 L341P es capaz de rescatar el fenotipo en células knockout SLC25A46 porque nuestros estudios anteriores indicaron que la mutación L341P desestabilizó SLC25A46, causando mitocondrias hiperfusionadas y PCH letal (Wan et al., 2016). Se eliminó SLC25A46 en células HEK 293 T-REx Flp-In y se introdujo 2xHA-SLC25A46 WT o L341P inducible por doxiciclina. Las mitocondrias aisladas de estas líneas celulares se sometieron a SDS- y BN-PAGE como en la Figura 3, A y B. Nuevamente, MFN1 y MFN2 mostraron niveles aumentados de estado estacionario y oligomerización cuando se eliminó SLC25A46 (Figura 3, G y H) . Mientras que la inducción de 2xHA-SLC25A46 WT rescató el knockout, la inducción de 2xHA-SLC25A46 L341P falló y, en cambio, aumentó los niveles de estado estacionario, y prevaleció la oligomerización de MFN1 y MFN2 (Figura 3, G y H). Tenga en cuenta que la expresión de las proteínas HA-SLC25A46 se confirmó mediante inmunotransferencia con un anticuerpo anti-HA. Además, se usó anti-SLC25A46 para detectar la expresión de SLC25A46 endógeno y SLC25A46 marcado con HA porque 2xHA-SLC25A46 L341P se degrada rápidamente, este panel se sobreexpuso para verificar que 2xHA-SLC25A46 L341P estaba presente (Figura 3H). Por tanto, las células que expresan SLC25A46 L341P tienen un fenotipo idéntico al del knockout de SLC25A46.

SLC25A46 L341P no es estable

Debido a que la rápida renovación de una proteína de OM mitocondrial específica es una base molecular inesperada para una enfermedad, investigamos esta vía de degradación en detalle. Transfectamos transitoriamente líneas celulares HEK293T con construcciones que expresaban proteína mutante SLC25A46 WT o L341P que contenía un epítopo 2xHA en el extremo N-terminal. Tratamos las células con cicloheximida para bloquear la traducción citosólica y eliminamos alícuotas en una persecución en el tiempo (Figura 4A). Se detectó SLC25A46 con un anticuerpo anti-HA. La proteína Mitocondrial OM TOMM40 se incluyó como control. La abundancia de SLC25A46 se cuantificó por densitometría (Figura 4B). Mientras que TOMM40 y WT SLC25A46 se mantuvieron estables durante la persecución, no se detectó SLC25A46 L341P, excepto cuando la mancha estaba sobreexpuesta en relación con WT SLC25A46. Tenga en cuenta que el aparente aumento en la abundancia de SLC25A46 en los puntos de tiempo de 40 y 60 minutos es inesperado pero probablemente indicativo de la variabilidad normal asociada con la proteína estable en este tipo de experimentos que observamos anteriormente (Hwang et al., 2007). Para determinar si se toleraron diferentes sustituciones de aminoácidos, se realizaron cambios que incluían una sustitución básica (arginina, R), ácida (glutamato, E) e hidrófoba conservadora (valina, V) a SLC25A46 en la posición 341, y la estabilidad se probó como en la Figura 4A (Figura 4C). De nuevo, las sustituciones de arginina y glutamato redujeron notablemente la estabilidad, similar a la mutación de prolina, y la sustitución conservadora de valina también redujo la estabilidad de SLC25A46, pero la proteína fue detectable con una exposición más corta de la película. Por lo tanto, la mutación en la posición 341 disminuye fuertemente la estabilidad de SLC25A46.

FIGURA 4: SLC25A46 L341P es muy inestable en células cultivadas y no alcanza su conformación nativa. (A) La vida media de WT SLC25A46 o SLC25A46 L341P se determinó mediante experimentos de persecución con cicloheximida (CHX). Las células HEK293T se transfectaron transitoriamente con construcciones para 2xHA-SLC25A46 WT o 2xHA-SLC25A46 L341P. A las 24 h posteriores a la transfección, se añadió CHX y se tomaron muestras en los puntos de tiempo indicados. Las mitocondrias se aislaron y analizaron con anticuerpos contra la etiqueta HA y control TOMM40. (B) Densitometría de inmunotransferencias de A. (C) Como en A, las construcciones se generaron con las mutaciones indicadas en la posición 341. (D) Como en A, las construcciones se generaron con las mutaciones indicadas en las posiciones 341, 333 y 340. (E) Se importaron 2xHA-SLC25A46 WT, L341P y R340C radiomarcados durante 10 min en mitocondrias aisladas de células HEK293 T-REx Flp-In. Después de la importación, la mitad de la muestra se trató con 1,25 µg / ml de tripsina durante 15 min en hielo y las proteínas insertadas se recuperaron en el sedimento después de la extracción con álcali. Como control, la otra mitad se incubó durante 15 min en hielo, seguido de extracción con álcali. Todas las muestras se resolvieron mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante autorradiografía. Las flechas etiquetadas 1–3 indican diferentes productos de escisión que fueron prominentes en el panel que estuvo expuesto durante más tiempo.

También se identificaron mutaciones en SLC25A46 en pacientes con trastorno del espectro de atrofia óptica (Abrams et al., 2015). Estas mutaciones se asociaron con defectos en la morfología mitocondrial, pero no se determinó el destino de la proteína SLC25A46 mutante. Dos mutaciones, P333L y R340C, estaban cerca de L341P y localizadas en el supuesto quinto dominio que atraviesa la membrana, según la homología con los portadores mitocondriales (Wan et al., 2016). Como en la Figura 4C, la abundancia de estas proteínas se determinó usando estudios de persecución de cicloheximida (Figura 4D). Se detectó SLC25A46 R340C, pero las variantes L341P y P333L se identificaron solo cuando la transferencia estuvo expuesta durante más tiempo. El paciente con el mutante P333L murió a las 15 semanas de vida, mientras que el paciente con la mutación R340C tenía 51 años en el momento del estudio (Abrams et al., 2015). Por lo tanto, es probable que el recambio rápido de SLC25A46 durante el desarrollo esté asociado con el inicio temprano de la muerte.

Para determinar si la rápida degradación de SLC24A46 L341P fue el resultado de que la proteína mutante no alcanzó su conformación nativa en el OM después de la importación, importamos SLC25A46 WT, L341P y R340C marcados radiactivamente en mitocondrias aisladas y tratamos la mitad de la muestra con una concentración baja. cantidad de tripsina para realizar una proteólisis limitada. La inserción de la membrana se confirmó mediante extracción con álcali (Figura 4E). En ausencia de tratamiento con tripsina, las tres proteínas se importaron en la misma medida. La comparación de los productos de escisión después de una proteólisis limitada mostró que las tres proteínas tenían patrones de escisión diferentes. Se detectaron y etiquetaron tres productos de degradación prominentes en el panel con la exposición más prolongada. SLC25A46 WT y R340C tenían un producto de escisión prominente en la posición 2 y un producto secundario en la posición 1, con la excepción de que R340C tenía menos de estos productos que WT. En contraste, SLC25A46 L341P tenía un producto de escisión adicional en la posición 3 que era más prominente que para WT y R340C. Por lo tanto, concluimos que SLC25A46 L341P se importa normalmente pero no alcanza la conformación nativa, lo que resulta en una rápida degradación. El hecho de que SLC25A46 L341P no se pliega en su conformación final también está respaldado por la observación de que SLC25A46 L341P mostró un patrón de distribución diferente en los gradientes de glicerol y BN-PAGE que WT SLC25A46 (Figura 1, A y C).

SLC25A46 L341P está poliubiquitilado y degradado por el proteasoma

La fuerte interacción de SLC25A46 L341P con MULAN implica que el SLC25A46 mutante puede ser degradado rápidamente por el UPS (Figura 2A). Sin embargo, se ha sugerido que las proteínas de la OM mitocondrial se cambian solo por mitofagia con la eliminación final de todo el orgánulo (Ling y Jarvis, 2013). Por lo tanto, investigamos el proceso de rotación con más detalle. Las células que expresan SLC25A46 L341P se trataron con los dos inhibidores del proteasoma MG132 y bortezomib y con el inhibidor de la autofagia de fase tardía bafilomicina A1 (Figura 5A). Debido a que MG132 a una concentración 10 veces mayor también puede inhibir las calpaínas y catespinas proteolíticas (Tsubuki et al., 1996 Kisselev y Goldberg, 2001), también se utilizó bortezomib, que es específico del proteasoma (Moore et al., 2008). El nivel de estado estacionario de SLC25A46 L341P aumentó solo cuando las células se trataron con MG132 o bortezomib (Figura 5A). Las proteínas que son degradadas por el proteasoma suelen estar ubiquitiladas, lo que da como resultado una movilidad reducida en los geles de SDS. Una fracción de SLC25A46 L341P mostró movilidad reducida después de la inhibición del proteasoma, lo que sugiere ubiquitilación (Figura 5A, la fracción monoubiquitilada está marcada con un asterisco). Por el contrario, SLC25A46 L341P no se estabilizó con el tratamiento con bafilomicina A1, aunque el marcador de autofagia LC3-II se acumuló, lo que indica que la autofagia estaba efectivamente inhibida (Figura 5A).Cuando analizamos las mitocondrias de las células HEK293T que se transfectaron transitoriamente con HA-SLC25A46 WT o mutante L341P, encontramos que el tratamiento con MG132 nuevamente estabilizó notablemente HA-SLC25A46 L341P, mientras que HA-SLC25A46 WT solo se estabilizó ligeramente (Figura 5B). Además, una fracción de SLC25A46 WT y L341P de las células tratadas con MG132 también mostró una menor movilidad después de una mayor exposición, lo que apoya la ubiquitilación de las proteínas (Figura 5B). En las células HeLa transfectadas transitoriamente con SLC25A46 WT o L341P marcado con HA, el mutante SLC25A46 era apenas detectable (Figura complementaria S6) y se localizó en las mitocondrias y el citosol, sin embargo, no se observaron grandes agregados. En comparación, SLC25A46 WT fue abundante y se localizó exclusivamente en las mitocondrias. Cuando las células se trataron con MG132, SLC25A46 L341P y WT se acumularon en las mitocondrias y en el citosol. Llegamos a la conclusión de que SLC25A46 L341P no forma grandes agregados, sino que se importa a las mitocondrias y luego se retrotransloca rápidamente al citosol debido a la inestabilidad. WT SLC25A46 sigue una ruta similar pero con una cinética más lenta.

FIGURA 5: SLC25A46 L341P está poliubiquitilado y degradado por el proteasoma. (A) Se trataron células HEK293 T-REx Flp-In que expresaban 2xHA-SLC25A46 L341P con MG132, bortezomib, bafilomicina A1 o DMSO (0,1%) durante 6 h. Las células se lisaron y los extractos totales se analizaron mediante SDS-PAGE. Se incluyeron anticuerpos contra LC3 y ubiquitina como controles para verificar la inhibición de la autofagia y la degradación de proteínas, respectivamente. TOMM40 sirvió como control de carga. El asterisco marca 2xHA-SLC25A46 L341P monoubiquitylated. (B) SLC25A46 L341P se acumula en las mitocondrias tras la inhibición del proteasoma. Se transfectaron células HEK293T como en A y luego se trataron con 10 µM de MG132 (M) o DMSO de control (D) durante 6 h. Se aislaron mitocondrias y se detectó SLC25A46 L341P marcado con HA mediante inmunotransferencia. (C) Se inmunoprecipitó SLC25A46 WT o L341P ubiquitilado en condiciones desnaturalizantes con un anticuerpo Flag de células que expresan transitoriamente HA-ubiquitina-GFP y 3xFlag-SLC25A46 WT o L341P. La ubiquitina se detectó con un anticuerpo anti-HA. La GFP escindida de HA-ubiquitina sirvió como control de transfección y se incluyó TOMM40 como control de carga. (D) La relación entre SLC25A46 WT y L341P ubiquitilados y no ubiquitilados se determinó después del análisis densitométrico de ambos grupos de proteínas de C. Media ± SEM norte = 3. (E) La inhibición del proteasoma bloquea la rápida degradación de SLC25A46 L341P en las mitocondrias. Se transfectaron transitoriamente HEK293T con construcciones para 2xHA-SLC25A46 WT o L341P durante 24 hy luego se recogieron antes (0) y 15 o 30 min después de la adición de cicloheximida. Las mitocondrias se aislaron y analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. Para bloquear la degradación dependiente del proteasoma, se añadió MG132 25 µM en ese momento como adición de cicloheximida.

Para confirmar la ubiquitilación de SLC25A46, transfectamos transitoriamente células con SLC25A46 WT o L341P etiquetadas con Flag, así como con una construcción para ubiquitina-GFP etiquetadas con HA (y como control, un vector vacío Figura 5C). Se inmunoprecipitó SLC25A46 de lisados ​​con anti-Flag seguido de inmunotransferencia con anti-HA. Como se esperaba, se ubiquitiló SLC25A46, y el mutante L341P poseía una mayor modificación (Figura 5, C y D).

Para verificar la participación de UPS en el recambio de SLC25A46, se sometieron células transfectadas transitoriamente con SLC25A46 WT o L341P a una persecución de cicloheximida en presencia de MG132 para evaluar la estabilidad de SLC25A46 (Figura 5E). SLC25A46 WT era estable, mientras que SLC25A46 L341P estaba presente a niveles más bajos, pero se detectó degradación tras una exposición más prolongada a la película. La adición de MG132 estabilizó el SLC25A46 L341P, confirmando que el proteasoma degradó al mutante L341P. TOMM40 se mantuvo estable y se incluyó como control de carga. Por tanto, SCL25A46 L341P en la OM mitocondrial está ampliamente ubiquitilado y degradado por el proteasoma, independientemente de la mitofagia.

MULAN y MARCH5 ubiquitylate coordinadamente SLC25A46 L341P, y P97 media la degradación de SLC25A46

Determinamos los componentes que median el recambio de SLC25A46 aprovechando inhibidores, mutantes y silenciamiento de ARNi. Cuando las células HEK293T que expresan de manera estable SLC25A46 L341P se trataron con el inhibidor del proteasoma MG132 (M) o el inhibidor de P97 NMS873 (N Magnaghi et al., 2013), los ensayos de coIP revelaron una interacción robusta de SCL25A46 L341P con MULAN y una interacción más débil con P97 (Figura 6A). No se detectó una fuerte interacción con MARCH5, porque MARCH5 no pudo coinmunoprecipitar con SCL25A46 L341P (Figura 6A). Tenga en cuenta que las inmunotransferencias con el anticuerpo para MARCH5 endógeno producen algunos antecedentes, y se detectó una banda inespecífica que migra a un peso molecular más alto que MARCH5 (marcada con un asterisco en la Figura 6A).

FIGURA 6: La rápida renovación de SLC25A46 L341P depende en gran medida de P97. (A) SLC25A46 se une a P97, MARCH5 y MULAN. Se trataron células HEK293T estables que expresaban 2xHA-SLC25A46 L341P con DMSO (control de vehículo), MG132 (M) 25 μM o NMS873 (N) 5 μM durante 3 h antes de la lisis celular. Las células se lisaron en digitonina y se inmunoprecipitó SLC25A46 a partir de extractos de células completas con anticuerpo anti-HA. Para la inmunotransferencia se utilizaron anticuerpos contra HA, P97, MULAN y el control de matriz LRP130. Las muestras de entrada corresponden al 2% de la cantidad de lisado utilizado para el IP. El asterisco marca una señal inespecífica en los carriles IP para MARCH5. (B) La inhibición de P97 altera la degradación de SLC25A46 L341P. Las mismas células que en A se trataron con DMSO y NMS873 5 o 10 µM en combinación con CHX. En los tiempos indicados, se recolectaron las células y se aislaron las mitocondrias. La degradación de SLC25A46 L341P se detectó mediante inmunotransferencia y se incluyó TOMM40 como control de carga. El asterisco marca especies poliubiquitiladas. (C) Se transfectaron células HEK293T que expresan establemente ARNhc inducible por doxiciclina (Doxy) que se dirige a P97 con una construcción para 2xHA-SLC25A46 L341P. Después de 24 h, las células se trataron con CHX y las muestras se retiraron en los tiempos indicados. Las células se separaron en un sedimento mitocondrial y un sobrenadante postmitocondrial cantidades iguales de proteína de cada fracción se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. El tratamiento con doxiciclina se inició 24 h antes de la transfección y se mantuvo durante el análisis. El asterisco marca SLC25A46 monoubiquitylated. (D) La vida media de SLC25A46 L341P se determinó en células HEK293T que expresan transitoriamente 2xHA-SLC25A46 L341P en combinación con WT P97, P97-QQ mutante de sitio activo o vector vacío. Las células se trataron con CHX y se analizaron como se describe en C. El asterisco marca SLC25A46 monoubiquitylated.

Seguimos esta investigación con experimentos de persecución de cicloheximida para detener la traducción citosólica e investigamos la estabilidad de SLC25A46 L341P en condiciones que disminuían la proteólisis (Figura 6, B – D). Se retiraron alícuotas antes del tratamiento con cicloheximida y 15 y 30 minutos después del tratamiento, y los lisados ​​de mitocondrias se sometieron a inmunotransferencia. El tratamiento con NMS873 para inhibir P97 antes de la persecución de cicloheximida resultó en la acumulación de SLC25A46 L341P en complejos de gran masa molecular (marcados con un asterisco), lo que indica una acumulación de mutante SLC25A46 L341P poliubiquitilado en las mitocondrias (Figura 6B). No esperamos que esta fracción de SLC25A46 (marcada con un asterisco) sea un agregado inespecífico porque 1) la forma de alta masa molecular de SLC25A46 no se detectó cuando las células se trataron de forma simulada con dimetilsulfóxido (DMSO) 2) las muestras fueron preparado para SDS-PAGE con un tampón de muestra que contenía SDS, lo que da como resultado la solubilización esperada de SLC25A46 y 3) SLC25A46 preparado en tampón de muestra que contiene SDS no se observa en el gel de apilamiento, y la fracción SLC25A46 en la parte superior del gel ( marcado con un asterisco) introducido en el gel de separación. La expresión de la proteína P97 se redujo usando un sistema de ARNhc inducible por doxiciclina (Figura 6C). La disminución de los niveles de proteína P97 se correlacionó con una mayor estabilidad de SLC25A46 L341P en las mitocondrias y un ligero aumento en la estabilidad de un grupo citosólico. Esto apoya una vía en la que SLC25A46 se inserta primero en la OM mitocondrial y luego se degrada. Además, la expresión del mutante P97-QQ del sitio activo reflejó la inducción de ARNhc (Figura 6D), en la que SLC25A46 L341P se estabilizó en la membrana mitocondrial, además, se detectó una forma monoubiquitilada de SLC25A46 L341P (marcada con un asterisco), y una fracción del mutante P97-QQ asociado con el mutante SLC25A46 en las mitocondrias. Por el contrario, la sobreexpresión de P97 activo no aumentó la acumulación de SLC25A46 mutante (Figura 6D). Tenga en cuenta que en la Figura 6C con anti-P97, se detectó una fracción del conjunto de P97 en la fracción mitocondrial, lo que probablemente refleja un conjunto de P97 que podría estar involucrado en la degradación de SLC25A46. De manera similar, se identificó una pequeña fracción del mutante P97-QQ en la fracción mitocondrial; este conjunto puede ser mayor porque el anticuerpo antihistidina no es tan robusto como el anticuerpo P97.

Manipulamos la expresión de MULAN. La sobreexpresión de MULAN dio como resultado un aumento de la monoubiquitilación de SLC25A46 L341P (marcado con un asterisco). Sin embargo, MULAN H319A "muerto por ligasa" aumentó la estabilidad de SLC25A46 L341P pero carecía de ubiquitilación (Zhang et al., 2008 Figura 7A). Inicialmente, anticipamos que la sobreexpresión de WT MULAN daría como resultado un aumento del recambio de SLC25A46 L341P, similar a las condiciones del control de vector vacío. Sin embargo, es probable que las células no toleren bien la sobreexpresión de MULAN porque los informes indican que la sobreexpresión de WT MULAN inhibe el crecimiento celular y causa la muerte celular (Zhang et al., 2008 Bae et al., 2012). Por lo tanto, interpretamos este resultado como una indicación de que una mayor abundancia de MULAN activo provoca una mayor degradación de las proteínas clave necesarias para la supervivencia celular, como Akt (Bae et al., 2012), y la sobreexpresión de MULAN a largo plazo conduce a la apoptosis a través de la activación de caspasas (Zhang et al., 2008). De hecho, la sobreexpresión a largo plazo de MULAN conduce a la muerte celular en estos experimentos. Concluimos que en condiciones apoptóticas, la vía de control de calidad para proteínas como SLC25A46 L341P no funciona de manera eficiente y, por lo tanto, el recambio de SLC25A46 no es tan robusto como en el caso de la expresión del vector vacío. Además, se encontró un resultado similar con el retículo endoplásmico (ER) ubiquitina ligasa HRD1. La sobreexpresión de la HRD1 mutante no degradó la cadena ligera de inmunoglobulina κ no secretada (Ig κ LC), pero la sobreexpresión de WT HRD1 también inhibió la degradación de la Ig κ LC no secretada (Okuda-Shimizu y Hendershot, 2007). Por lo tanto, los resultados con HRD1 reflejan aquellos con sobreexpresión de WT MULAN.

FIGURA 7: MARCH5 y MULAN median la ubiquitilación y degradación de SLC25A46 L341P. (A) Aumento de la vida media de SLC25A46 L341P al sobreexpresar el mutante de dedo RING MULAN H319A. Una línea celular estable que expresa 2xHA-SLC25A46 L341P se transfectó transitoriamente con un vector vacío, WT MULAN o MULAN H319A y se trató con CHX durante los puntos de tiempo indicados. Se aislaron las mitocondrias y se detectó MULAN con un anticuerpo anti-myc. El asterisco marca SLC25A46 monoubiquitylated. (B) Como en A, con la excepción de que las células se transfectaron transitoriamente con WT MARCH5 o el mutante RING MARCH5 H43W. (C) Se transfectaron células HEK293T que expresaban de forma estable ARNhc de control inducible por Doxi o un ARNhc dirigido a MULAN con construcciones para ARNhc de control o ARNhc dirigido a MARCH5 y 2xHA-SLC25A46 L341P. Se añadió doxiciclina (1 µg / ml) durante la transfección. Después de 48 h, se añadió CHX y las células se recolectaron justo antes de la adición de CHX (0) ya los 15 y 30 min. Las mitocondrias se aislaron y analizaron mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia. (D) Como en C, pero las células se transfectaron con 3xFlag-SLC25A46 L341P y HA-Ubiquitin-GFP. Después del tratamiento de las células con MG132 25 µM durante 3 h, se inmunoprecipitaron proteínas ubiquitiladas marcadas con HA en condiciones desnaturalizantes con anti-HA. Se detectó 3xFlag-SLC25A46 L341P ubiquitilado con un anticuerpo anti-Flag. El asterisco marca especies poliubiquitiladas. TOMM40 es un control de carga. (E) Determinación de la abundancia de SLC25A46 L341P en células knockout HEK293 T-REx Flp-In WT, MARCH5, MULAN o MARCH5 / MULAN. Las células se transfectaron con una construcción 2xHA-SLC25A46 L341P. Se aislaron las mitocondrias de las líneas celulares, se solubilizaron, se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia. PreP se incluyó como control de carga. (F) Como en E, con tratamiento CHX para los tiempos indicados. Las células se recolectaron en cada momento y se aislaron las mitocondrias. Se detectaron SLC25A46 L341P y SLC25A46 endógeno mediante inmunotransferencia, y se incluyó TOMM40 como control de carga. (G) Bajo la expresión fisiológica de WT SLC25A46, los niveles de MFN1, MNF2 y dímeros se mantienen constantes para no perturbar el fino equilibrio entre fisión y fusión, que es importante para el desarrollo y la supervivencia (izquierda). Sin embargo, cuando el gen SLC25A46 se interrumpe por deleciones o el producto génico se desestabiliza por mutaciones puntuales como L341P, que se degrada rápidamente por la degradación asociada a la OM, los dímeros MFN1 y MFN2 se acumulan en la OM y desplazan el equilibrio hacia la fusión. Esto conduce a hipoplasia pontocerebelosa y muerte prematura (derecha).

Usamos un enfoque similar con la manipulación de la expresión de MARCH5. La transfección transitoria de WT MARCH5 dio como resultado la degradación de SLC25A46 L341P similar a la transfección con un vector vacío (Figura 7B). Por el contrario, la transfección con el mutante de dominio de anillo MARCH5 H43W dio como resultado la estabilización de SLC25A46 L341P en menor grado (Karbowski et al., 2007).

Usando el enfoque de ARNhc para disminuir la expresión de MULAN y MARCH5, encontramos que SLC25A46 L341P se estabilizó notablemente cuando se redujo la expresión de ambos (Figura 7C). Para confirmar la ubiquitilación de SLC25A46 L341P específicamente por MULAN y MARCH5, combinamos la transfección de SLC25A46 L341P con etiqueta de bandera y proteína fluorescente verde (GFP) de ubiquitina-HA con el tratamiento de ARNi de MULAN y MARCH5 como en la Figura 5C. Una vez más, la eliminación de MULAN y MARCH5 desplazó el conjunto de SLC25A46 L341P poliubiquitilado a una cohorte que estaba menos ubiquitilada (Figura 7D, asterisco). Como en la Figura 6B, no esperamos que la fracción de Flag-SLC25A46 L341P que migra a una masa molecular alta (asterisco) sea un agregado inespecífico porque esta fracción no se detectó en la muestra tratada con el shRNA de control. Además, sobre la base del ensayo, primero se inmunoprecipitaron proteínas que se ubiquitilaron con HA y luego se transfirieron para Flag-SLC25A46 L341P con anti-Flag. Por lo tanto, la fracción de Flag-SLC25A46 L341P que migra a una masa molecular alta (asterisco) está poliubiquitilada.

Para verificar el papel de MULAN y MARCH5 en la degradación de SLC25A46 L341P, generamos HEK293 T-REx Flp-In MULAN - / - , 5 DE MARZO - / - , y MULAN - / - /5 DE MARZO - / - líneas celulares y analizó la abundancia de SLC25A46 L341P cuando se transfectó transitoriamente (Figura 7E). De nuevo, solo en ausencia de MARCH5 y MULAN se incrementaron los niveles en estado estacionario de SLC25A46 L341P en comparación con los knockouts de ligasa E3 individuales. Como se observó en el enfoque de shRNA, SLC25A46 L341P se estabilizó notablemente cuando ambas ligasas E3 se eliminaron en las líneas celulares HEK293 T-REx Flp-In (Figura 7F). La eliminación simple de MULAN o MARCH5 tuvo poco efecto sobre la vida media de SLC25A46.

La familia de ligasa Cullin RING no ubiquitila SLC25A46 L341P

Otra clase de ubiquitina ligasas E3 que puede desempeñar un papel en la degradación de SLC25A46 L341P es la familia de ligasa Cullin RING (CRL) (Figura complementaria S7). Anteriormente, SLC25A46 se identificó como un posible sustrato de CRL3 (Emanuele et al., 2011). La molécula pequeña MLN4924, que inhibe la enzima activadora de NEDD8 y, por lo tanto, previene la activación de las ligasas Cullin RING, se agregó a las células antes de la persecución de la cicloheximida (Soucy et al., 2009). SLC25A46 L341P no se estabilizó en estas condiciones. Sin embargo, el inhibidor estaba activo porque evitaba la neddylación de Cul4a por Nedd8 (Brownell et al., 2010). Por tanto, de las ubiquitina ligasas, MARCH5 y MULAN coordinan la degradación de SLC25A46 y parecen tener funciones redundantes.


Los oligómeros tóxicos contienen estructura de lámina α, no estructura de lámina β

La estructura secundaria de Aβ se evaluó luego en función del tiempo mediante dicroísmo circular (CD) (Fig.1C). De acuerdo con el perfil de ThT, la agregación se inició a partir de una conformación de espiral aleatoria no estructurada (0 h) y procedió a la estructura de hoja β en el curso de la agregación (48 h y más). Curiosamente, la curva se elevó y se aplanó en la fase de retraso antes de la formación de la hoja β (que se muestra durante 8 a 36 h). Por lo tanto, los oligómeros hexámeros y dodecámeros poblados durante la fase de retardo no contienen una estructura secundaria convencional medible, mientras que las especies tardías de mayor peso molecular (48 hy más) contienen una estructura β consistente con la inferencia del ensayo de unión de ThT. Los espectros de CD sin rasgos distintivos de los oligómeros intermedios (tanto en tamaño como en tiempo) son similares a lo que propusimos y confirmamos experimentalmente para la estructura de la hoja α (29, 38 ⇓ –40). Los péptidos de hoja α diseñados (indicados como AP #, para péptido alterno) producen una "señal nula" debido a sus características estructurales únicas que conducen a la cancelación de la señal de CD, como se muestra en la Fig. 1C para el diseño de lámina α AP407, que es distinto de los espectros de CD de bobina aleatoria, hélice α y lámina β (29, 38 ⇓ –40). Contrariamente a nuestros resultados, muchos asumen que los oligómeros solubles Aβ adoptan una estructura de lámina β en la fase de retardo, pero varios otros estudios informan espectros de CD muy similares a los espectros de lámina α proporcionados aquí (17, 31, 41, 42). Si bien se obtuvieron espectros similares, no se reconoció que fueran hojas α debido a su novedad, ya que los compuestos modelo son críticos para la asignación de espectros. Aquí usamos nuestros diseños sintéticos de láminas α, como AP407, para ese propósito, pero para hacerlo, fue necesaria una mayor caracterización de la estructura.

Para obtener información estructural más detallada para nuestros diseños de hoja α, se realizaron experimentos de RMN 2D de AP407, que dieron como resultado 455 interacciones nucleares distintas del efecto Overhauser (NOE) entre protones para este péptido de 23 residuos (conjunto de datos S1), lo que permitió el cálculo y prueba de modelos estructurales de AP407 (Apéndice SI, Fig. S4A). Los cambios químicos de la RMN y el conjunto estructural derivado de la RMN están en excelente acuerdo (Apéndice SI, Fig. S4B). Los cambios químicos secundarios, que a menudo se utilizan para determinar regiones de estructura secundaria, son consistentes con la estructura helicoidal α, mientras que las constantes de acoplamiento que reflejan los ángulos diedros Φ no lo son (Apéndice SI, Fig. S4C). En cambio, las constantes de acoplamiento son indicativas de hoja β o estructura extendida.Por lo tanto, los resultados de la RMN apuntan tanto a la hélice α como a la estructura de la hoja extendida, como esperaríamos para una hoja α compuesta por valores helicoidales locales (Φ, Ψ) de quiralidad alternante (Apéndice SI, Fig. S1) formando una estructura de hoja de horquilla. Las NOE brindan más apoyo a esta conclusión. H secuencialnorte-Hnorte Se observaron los NOE esperados para la estructura de la hoja α, mientras que los patrones estándar de NOE de la cadena principal esperados para las estructuras de la hoja α y la hoja β no estaban presentes (Apéndice SI, Fig. S4 D y mi), que es consistente con el espectro de CD plano para AP407 (Fig.1C, con una de las estructuras de RMN proporcionadas en el Recuadro). En un estudio anterior, obtuvimos NOE para otros dos diseños de hojas α, pero no un número suficiente para calcular una estructura (38). Aquí, sin embargo, obtuvimos un mayor número de NOE, incluyendo NOE de cadena lateral, usando un diseño más restringido con un enlace disulfuro que une las cadenas α. El cien por cien de los 455 ENE están satisfechos con el conjunto presentado en Apéndice SI, Fig. S4. Sin embargo, como ocurre generalmente con los péptidos pequeños, AP407 conserva la flexibilidad conformacional, como es particularmente evidente en la región de giro debido al empaquetamiento alternativo de la cadena lateral (Apéndice SI, Fig. S4A).

Se utilizó espectroscopia de modulación microfluídica (MMS) para caracterizar aún más las características estructurales de Aβ durante la agregación. MMS mide los espectros de absorción de péptidos mediante la exploración óptica a través de la banda de amida I, que refleja una combinación de patrones de enlaces de hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo y las orientaciones geométricas en todo el péptido. Como se trata de una técnica nueva y la lámina α es una estructura no estándar, utilizamos horquillas de lámina α de diseño sintético como compuestos modelo para ayudar a interpretar los espectros, junto con controles para otras estructuras secundarias convencionales: horquillas de lámina α diseñadas (AP5, AP90 , AP407 y AP421), péptidos de hoja β (P411) y de hélice α (PSMα1) (secuencias y mapeo de color proporcionados en Apéndice SI, Tabla S2). Cada clase de péptido produjo características espectrales distintivas, como se muestra en los gráficos de la segunda derivada de la región amida I (Fig.1D). Esto se ilustra aún más restando el espectro de péptidos de hoja α AP407 de las otras muestras, destacando las similitudes entre los diferentes péptidos de hoja α con la mayor diferencia a 1.680 nm, que suponemos se debe a la alineación de dipolos mejorada de la estabilización de la Estructura de lámina α en la horquilla debido a la reticulación de disulfuro (Fig.1mi). Además, se predijo que esta banda sería dominante para la estructura de hoja α no solvatada (43) y se confirmó experimentalmente mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) convencional de películas secas (29, 38, 39).

Después de establecer las características espectrales de los compuestos modelo, analizamos la muestra de Aβ más tóxica (24 h) y encontramos que su espectro era consistente con la hoja α y distinto de la hoja β y la hélice α (Fig.1 D y mi). De hecho, el espectro del oligómero Aβ se superpone muy bien a los otros espectros de la hoja α. Con el aumento del tiempo de agregación, el espectro Aβ se desplazó y fue más similar a nuestro control de hoja β (P411) en lugar de cualquiera de nuestros diseños de hoja α (120 h, Fig.1 D y mi), pero tenga en cuenta el cambio en la muestra de Aβ de 120 h con respecto a la horquilla β monomérica P411. Tales cambios se observan habitualmente entre la estructura β convencional y las fibrillas mediante FTIR (44). De acuerdo con los resultados de ThT y CD, la estructura de la hoja α precedió a la formación de la hoja β. Además, se descubrió recientemente que las fibrillas de un fragmento de una variante de la proteína amiloidogénica transtiretina contienen señales espectroscópicas de estructuras de hoja α y hoja β por FTIR, lo que proporciona un apoyo adicional para la presencia de lámina α en sistemas amiloides y la posibilidad de coexistencia de una hoja α y β (27, 45).


Preguntas frecuentes: autofagia y LC3

Atg4 escinde pro-LC3 para formar LC3-I que luego se conjuga con PE (por Atg7) para la generación de LC3-II. Este último se recluta en la membrana autofagosomal para ayudar a la elongación de la membrana. ATG7 también media en la formación del complejo ATG5-ATG12-ATG16 y este último junto con LC3-II es muy crítico para la formación de autofagosomas. La proteína adaptadora p62 / SQSTM1 se une a proteínas ubiquitinadas y LC3-II para mediar en la autofagia mediante la localización en compartimentos autofágicos, transportando proteínas ubiquitinadas y orgánulos para su degradación.

Hasta la fecha se han estudiado varios marcadores moleculares de autofagia, pero la conversión de LC3-I en LC3-II a través de la conjugación de fosfatidiletanolamina (PE) se ha aceptado como el estándar de oro para la formación de autofagosomas. p62 / SQSTM1 también es importante ya que es un sustrato para LC3 que facilita la degradación selectiva durante la autofagia. Algunas de las principales proteínas implicadas en la señalización de la autofagia son:

Algunas de las principales proteínas implicadas en la señalización de la autofagia

¿Qué es LC3 y en qué se relaciona o se diferencia de Atg8?
LC3 se identificó originalmente como una subunidad de las proteínas 1A y 1B asociadas a los microtúbulos (MAP1LC3) y posteriormente se encontró que tenía similitudes con la proteína de levadura Atg8 (también llamada Apg8, Aut7 o Cvt5). Los homólogos de levadura en mamíferos se subdividen en dos subfamilias principales: MAP1LC3 / LC3 (LC3A, LC3B y LC3C) y GABARAP (GABARAP, GABARAPL1 y GABARAPL2 / GATE-16). Tanto LC3 como GABARAP se expresan como proteínas precursoras que experimentan escisión seguida de lipidación / conjugación de PE para generar LC3-II y GABARAP-PE respectivamente. Además de GABARAPL2, se ha documentado que todos los homólogos de Atg8 de mamíferos desempeñan un papel en la biogénesis de los autofagosomas. Además, debido a las características únicas en la distribución de sus cargas moleculares de superficie, se ha sugerido que LC3 y GABARAP reconocen distintos conjuntos de cargas para la autofagia selectiva. Volver a las preguntas frecuentes

¿Cuál es la diferencia entre LC3A, LC3B y LC3C o LC3-I y LC3-II?
LC3 es una proteína soluble con una masa molecular de ~ 17 kDa y se distribuye de forma ubicua en eucariotas. Se expresa como las variantes de empalme LC3A, LC3B y LC3C que muestran una distribución tisular única. Todas las isoformas de LC3 sufren modificaciones postraduccionales, especialmente la conjugación de PE (lipidación) durante la autofagia. Tras la señal autofágica, la forma citosólica de LC3 (LC3-I) se conjuga con PE para formar el conjugado LC3-PE (LC3-II), que se recluta en las membranas autofagosómicas. Volver a las preguntas frecuentes

Análisis de WB de HeLa (1), HeLa + Cloroquina / CQ (2), SHSY5Y (3), SHSY5Y + CQ (4), A431 (5), A431 + CQ (6) y Ntera2 (7) usando anticuerpo LC3 policlonal de conejo a una concentración de 2 ug / ml.

ICC / IF de células HeLa tratadas con CQ utilizando anticuerpos LC3B (NBP2-46892) y Tubulina (NB100-690) con detección a través de secundarios marcados con Dylight 488 (verde) y Dylight 550 (rojo) respectivamente. Los núcleos se contratiñeron con DAPI (azul).

¿Es posible distinguir los grupos LC3-I y LC3-II en ensayos de inmunotinción con dos anticuerpos marcados con fluorescencia diferentes?
No, debido a que la principal diferencia entre LC3-I y LC3-II es su estado de lipidación (el resto PE conjugado), se sabe que todos los anticuerpos LC3 disponibles comercialmente detectan ambas formas. Hasta donde sabemos, no existen anticuerpos que detecten una sola isoforma. Volver a las preguntas frecuentes

Al hacer Western blot de LC3, ¿qué porcentaje de gel se debe seleccionar para su separación efectiva?
El peso molecular predicho de LC3 es

17 kDa y las formas procesadas LC3-I / II aparecen entre 14-18 kDa en el análisis de WB. Para una separación eficaz de las dos formas, recomendamos utilizar un gel de gradiente al 16% o al 4-20%. Si utiliza un gel al 16%, asegúrese de que el gel no se desborde. La proteína LC3 puede escurrirse del gel debido a su rápida movilidad / bajo peso molecular. El uso de un porcentaje de gel más bajo, la carga de grandes cantidades de muestra y la ejecución del gel a alto voltaje puede resultar en una separación / superposición inapropiada de las bandas LC3-I y LC3-II, lo que hace que sea muy difícil distinguir entre las dos bandas objetivo y complica la interpretación de los datos. Volver a las preguntas frecuentes

¿Hay algún consejo para el paso de transferencia en el ensayo de transferencia Western de LC3?
Después de ejecutar el paso, equilibre el gel en el tampón de transferencia correctamente para eliminar todo el tampón de ejecución del gel. Es importante destacar que asegúrese de no agregar ni rastros de SDS al búfer de transferencia. A algunos investigadores les resulta mejor utilizar la membrana de PVDF en comparación con la membrana de nitrocelulosa para la detección de LC3. Al elegir una membrana, se recomienda un tamaño de poro de 0,2 um. Dado que la LC3 es una proteína significativamente pequeña, no se deben utilizar membranas con un tamaño de poro de 0,45 um (la LC3 puede atravesar la membrana). El voltaje / corriente para la transferencia debe mantenerse bajo y también debe evitarse una transferencia prolongada para evitar que la proteína objetivo atraviese la membrana. Después de realizar la transferencia, se debe usar tinción con Amido black o Ponceau S para visulizar la transferencia de proteínas y para asegurarse de que las proteínas se hayan transferido realmente en la región de bajo peso molecular (rango de 15-20 kDa). Volver a las preguntas frecuentes

¿Cuál es el mejor tampón de bloqueo para el ensayo de transferencia Western LC3?
En nuestros ensayos de validación de anticuerpos, las condiciones con las que hemos tenido más éxito son la leche en polvo desnatada al 5% en TBST como tampón de bloqueo. Sugerimos al menos 1 hora de bloqueo en un agitador lento a temperatura ambiente. El tampón de bloqueo debe prepararse fresco porque el tampón de bloqueo antiguo (con posible contaminación microbiana) puede provocar problemas como un fondo alto o la aparición de puntos grandes en la mancha. Volver a las preguntas frecuentes

¿Qué control positivo puedo usar para Western blot de LC3?
Novus ofrece Lisado de células tratadas / no tratadas con cloroquina HeLa (NBP2-49689) y Lisado de células no tratadas / tratadas con cloroquina Neuro2a (NBP2-49688) que son controles positivos altamente recomendados para el ensayo WB de LC3. Los lisados ​​de sobreexpresión de LC3, como NBP2-04906, o un lisado celular total de células privadas de suero que muestran una vacuolización excesiva son otras opciones para su uso como control positivo al realizar el análisis LC3 WB. Volver a las preguntas frecuentes

- Se trataron células Neuro2A (neuroblastoma de ratón) con (+) y sin (-) cloroquina 50 uM durante la noche. Aproximadamente 10 ug de cada lisado de células completas en tampón de muestra 1x Laemmli (NBP2-49688) se separaron en un gel de gradiente mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF de 0,2 um y se bloquearon en leche desnatada al 5% en TBST. La membrana se probó con 1 ug / ml de anticuerpo anti-LC3 (NB100-2220) y 1 ug / ml de anti-alfa tubulina (NB100-690), y se detectó con los anticuerpos secundarios apropiados usando quimioluminiscencia.

- Se trataron células HeLa (carcinoma de cuello uterino humano) con (+) y sin (-) cloroquina 50 uM durante la noche. Aproximadamente 10 ug de cada lisado de células completas en tampón de muestra 1x Laemmli (NBP2-49689) se separaron en un gel de gradiente mediante SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF de 0,2 um y se bloquearon en leche desnatada al 5% en TBST. La membrana se probó con 1 ug / ml de anti-LC3 (NB100-2220) y 1 ug / ml de anti-alfa tubulina (NB100-690), y se detectó con los anticuerpos secundarios apropiados usando quimioluminiscencia.

¿Cuánto tiempo se debe privar de suero a las células para inducir la autofagia?
Dependiendo del tipo de célula, la inanición de suero puede tardar desde unas pocas horas hasta dos días para inducir la autofagia. Sin embargo, someter las células a medios como la solución salina equilibrada de Earle o la solución salina equilibrada de Hank puede inducir la autofagia en puntos de tiempo que van desde unos pocos minutos hasta un par de horas. La clave sería observar las células en busca de cambios morfológicos, y la aparición de un gran número de vacuolas en las células es un buen indicador de la inducción de muerte autofágica. Volver a las preguntas frecuentes

No veo la banda LC3-II en mi mancha. ¿Cómo soluciono este problema?
La expresión de LC3-II se correlaciona con la inducción de autofagia y solo se detectará cuando esté presente una actividad autofágica significativa en las muestras que se están probando. Antes de producir lisados ​​a partir de células cultivadas, asegúrese de buscar cambios morfológicos que son características de la muerte autofágica (especialmente la vacuolización excesiva). Si se trabaja en tejidos, debe tenerse en cuenta que las células autofágicas se eliminan más rápidamente in vivo, y la inclusión de un control positivo basado en el bloqueo del flujo autofágico (como NBP2-49688 o NBP2-49689) puede ser útil en el análisis de la extensión de actividad autofágica en los tejidos bajo investigación. Volver a las preguntas frecuentes

Mis muestras de control también muestran niveles muy altos de LC3II. ¿Qué significa?
Algunas líneas celulares pueden tener niveles basales de autofagia más altos que otras y, en esos casos, la muestra de control mostrará niveles altos de LC3-II. La inanición excesiva antes de los tratamientos de interés también puede conducir a la detección de niveles altos de LC3-II en las muestras de control. Volver a las preguntas frecuentes

En el análisis de Western blot, puedo visualizar las bandas de control de carga, pero no veo ninguna banda para LC3. ¿Hay algún problema con mi anticuerpo primario?
También puede ser un problema relacionado con el anticuerpo primario, pero antes de llegar a esa conclusión, se pueden considerar también otras posibles razones. Antes de hacer los lisados ​​a partir de células cultivadas, asegúrese de observar la morfología de las células para confirmar si se está induciendo la autofagia o no (la vacuolización excesiva es un buen indicador de autofagia). Utilice gel al 4-20% para la separación y no utilice el gel a alto voltaje. El tamaño de los poros de la membrana de transferencia debe ser

0,2 um, y el búfer de transferencia no debe contener SDS. Después de la transferencia, use la tinción Amido black o Ponceau S para ver si tiene proteínas transferidas en la región de bajo peso molecular (rango de 15-20 kDa). Para proporcionar una temperatura / tiempo óptimos para la interacción antígeno-anticuerpo, realice la incubación primaria a temperatura ambiente durante un par de horas, seguida de una incubación durante la noche a 4 ° C. Volver a las preguntas frecuentes

Además de las bandas LC3-I / II, veo una señal arriba

40kDa también en mis muestras. ¿Es una banda inespecífica o potencialmente un dímero de LC3?
En la literatura, se ha demostrado que el homólogo de LC3 GABARAP asume una conformación dimérica que se requiere para que se una a microtúbulos y receptores GABA (Nymann-Andersen et al. 2002). Baisamy y col. 2009 demostró que el LC3 etiquetado con FLAG y GFP puede co-inmunoprecipitar a partir de lisados ​​de células HEK-293, lo que sugiere que LC3 puede formar oligómeros dentro de las células. Además, propusieron que en esta configuración, la unión de LC3 podría promover un cambio conformacional que impacta la actividad Rho-GEF de AKAP-Lbc. Por lo tanto, creemos que en las transferencias de LC3, las bandas que corren por encima de la posición de 40 kDa podrían originarse a partir de las formas diméricas / oligoméricas potenciales de LC3. Volver a las preguntas frecuentes

Anticuerpo ATG5 [NB110-53818] Análisis de WB de lisados ​​de células madre embrionarias de ratón de tipo salvaje / células madre embrionarias (atg + / +) y células madre madre embrionarias de ratón de tipo salvaje (atg + / +) y las células madre embrionarias de ratón con inactivación de ATG5 (control negativo atg - / -) que muestra una banda específica del conjugado Atg5-Atg12 en Posición de 56 kDa.

Anticuerpo p62 / SQSTM1 [NBP1-48320] Se trataron células HeLa con (+) o sin (-) 50 uM de cloroquina durante 24 horas y se analizaron los lisados ​​de células completas en WB usando anti-p62 / SQSMT1 y anti-alfa tubulina ( Control de carga NB100-690).

¿Dónde puedo conseguir inhibidores o inductores de la autofagia?
Tocris (una marca de biotecnología) es un nombre establecido en el campo de las moléculas pequeñas bioactivas y ofrece varios inhibidores / inductores diferentes de la autofagia:

¿Novus ofrece péptidos para la inducción de la autofagia?
Sí, ofrecemos el péptido Tat-D11 (NBP2-49888) que es útil para la inducción in vitro e in vivo de la autofagia. Estructuralmente, Tat-D11 es una versión más corta de Tat-Beclin 1 que fue diseñada por Shoji-Kawata et al 2013 como un péptido compuesto por la región inductora de autofagia de Beclin 1 fusionada con la proteína Tat del VIH. Mecánicamente, estos péptidos inducen la autofagia a través de la interacción con el regulador negativo de la autofagia GAPR-1 / GLIPR2. En particular, en comparación con Tat-Beclin 1, Tat-D11 aumenta la inducción de autofagosomas y autolisosomas en más de cinco veces. Volver a las preguntas frecuentes

Análisis de microscopía fluorescente de GFP-puncta en células HeLa que expresan GFP-LC3B tratadas con péptido codificado Tat-L11S (NBP2-49887) o péptido Tat-D11 (NBP2-49888).

Para inmunocitoquímica / inmunofluorescencia (ICC / IF) de LC3, ¿cómo debo reparar mis células? ¿Necesito permeabilizar las células?
En nuestras pruebas de validación de control de calidad de anticuerpos LC3, fijamos de forma rutinaria varias células en paraformaldehído / PFA al 4% (es decir, formalina tamponada al 10%) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Sí, la permeabilización es un paso necesario porque LC3 se localiza en el citosol y las membranas de los autofagosomas. En nuestro laboratorio, utilizamos triton X100 al 0,1-0,5% durante 10 minutos para permeabilizar las células fijadas con paraformaldehído. Es importante destacar que no se requiere el paso de permeabilización cuando se fijan las células en metanol durante 5 minutos, ya que el metanol en sí mismo actúa como un agente permeabilizante. Volver a las preguntas frecuentes

¿Necesito incluir un paso de recuperación de antígeno mientras realizo IHC-P de LC3?
La recuperación del antígeno es generalmente un paso necesario cuando los tejidos se fijan en PFA al 4% (es decir, formalina tamponada al 10%) durante más de 4-6 horas. Para los métodos habituales de IHC-P, el tiempo de fijación varía de 6 a 24 horas y debe evitarse la fijación excesiva, ya que puede provocar una reticulación excesiva de las proteínas en los tejidos fijados. Los tejidos sobre fijados requerirán una recuperación de antígeno más rigurosa que puede conducir al desarrollo de señales falsas. En nuestro laboratorio, utilizamos de forma rutinaria un método basado en tampón de citrato de sodio 10 mM (pH 6,0) para la recuperación de antígeno inducida por calor, en el que incubamos los portaobjetos en el tampón a una temperatura de sub-ebullición durante 10 minutos seguido de enfriamiento de los portaobjetos (mientras se recuperan tampón) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Volver a las preguntas frecuentes

¿Qué patrón de tinción debo esperar en el ensayo IHC-P de LC3?
LC3-I se encuentra en el citosol, mientras que LC3-II se localiza en los autofagosomas, y en IHC-P, se puede observar una tinción citoplasmática difusa (LC3-I) con tinción puntiforme (LC3-II) en células que experimentan muerte autofágica. Para obtener imágenes de referencia sobre tinción LC3 IHC, sugerimos consultar publicaciones como Parajuli y MacMillan-Crow 2013, Kang et al. 2013, Guo et al. 2011, Shintaku 2011 y más enumerados en la sección Reseñas y publicaciones de las hojas de datos de nuestros anticuerpos LC3. Volver a las preguntas frecuentes

Veo una tinción difusa de LC3 en IHC-P. ¿Cómo confirmo si es LC3 y no antecedentes no específicos?
Se debe esperar un patrón de tinción de difuso a punteado para LC3, y para confirmar la especificidad de la inmunorreactividad, sugerimos los siguientes controles en el ensayo IHC-P: control negativo (sin primario, sin secundario), control secundario solo negativo ( sin adición primaria) y control de bloqueo de péptidos (Protocolo de competencia de péptidos). Dependiendo del resultado de la tinción en las muestras de prueba / control, se pueden tomar medidas adicionales siguiendo las sugerencias de solución de problemas apropiadas de nuestra página Soporte por aplicación. Volver a las preguntas frecuentes

Para la tinción LC3 IHC-P, ¿es normal obtener una señal en el núcleo de las células?
La mayoría de las publicaciones de investigación sugieren que la forma LC3-I es citosólica mientras que la forma LC3-II se localiza en las membranas autofagosómicas de las células que experimentan muerte autofágica. Sin embargo, hay algunos informes de investigación que muestran la localización nuclear de LC3. Para obtener información adicional sobre la localización / relevancia biológica de la reserva nuclear de LC3, recomendamos encarecidamente revisar las siguientes publicaciones: Hasui et al. 2011, Drake y col. 2010, Martinez-Lopezand et al. 2013 y Karim et al. 2007. Desde el punto de vista del ensayo, es útil comprobar el tiempo de fijación, ya que una fijación inadecuada o insuficiente puede conducir a la dispersión de LC3 en los núcleos celulares de tejidos disecados o células cultivadas. La optimización de las recetas / tiempos de permeabilidad y la concentración o el tiempo de incubación del anticuerpo primario también puede mejorar la localización y la sensibilidad. Volver a las preguntas frecuentes

¿Existen otros recursos o pautas sobre consejos para trabajar con LC3?
Sí, uno de los mejores recursos son las "Directrices para el uso e interpretación de ensayos para el seguimiento de la autofagia (tercera edición)", documentadas recientemente (Klionsky et al. 2016). También recomendamos "Cómo interpretar la inmunotransferencia LC3" de Mizushima y Yoshimori 2007, y "Autofagia: ensayos y artefactos" de Barth et al. 2010. Volver a preguntas frecuentes


Resultados

La señalización sostenida mediada por TCR se correlaciona con la proliferación, mientras que la señalización transitoria se correlaciona con la falta de respuesta

Se estimularon células T humanas periféricas usando sAbs o iAbs. Estos estímulos inducen cinéticas de activación y respuestas celulares marcadamente diferentes (Figura 1). La estimulación con sAbs resultó en una fuerte y transitoria inducción de fosforilación de tirosina global, así como de ZAP70, LAT y PLCγ-1. Por el contrario, cuando las células T humanas primarias se trataron con iAbs, la fosforilación global de tirosina y la fosforilación de ZAP70, LAT y PLCγ-1 fueron débiles, pero sostenidas (Figura 1A, B). Además, la fosforilación de TCR $ $ se mejoró grande y rápidamente con sAbs. Por el contrario, la estimulación de iAbs induce sólo una fosforilación de TCRζ débil (Figura 1C). Curiosamente, la cinética de fosforilación de PAG / Cbp, una proteína adaptadora transmembrana que funciona a aproximadamente 70 KDa que se desfosforila con la estimulación con TCR [9], es comparable en ambas condiciones de estimulación (Figura 1A). A continuación, analizamos la cinética de señalización de la cascada de Erk. Sorprendentemente, encontramos que Erk estaba muy fuertemente activado en ambas condiciones de estimulación. Sin embargo, la activación inducida por iAbs se mantuvo y duró hasta 90 minutos, mientras que, tras la estimulación con sAbs, la activación de Erk fue transitoria, alcanzó su punto máximo a los 1-5 minutos y disminuyó rápidamente a partir de entonces (Figura 1D). Por tanto, a pesar de la activación débil de las moléculas de señalización proximales, los iAbs son capaces de inducir una activación fuerte y prolongada de las vías de señalización aguas abajo.

Análisis de la firma de señalización y efectos funcionales de la estimulación de sAbs e iAbs. ANUNCIO) Se trataron células T humanas purificadas con mAb CD3xCD28 solubles (sAbs) o inmovilizados (iAbs) durante los períodos de tiempo indicados. Lisados ​​celulares totales (A, B, y D) o inmunoprecipitados de TCRζ C) se prepararon y analizaron mediante transferencia Western usando los Abs indicados. Se muestra una inmunotransferencia representativa de al menos 3 experimentos independientes. La fosforilación de TCRζ se cuantificó usando el software 1D ImageQuant y los valores se normalizaron a la correspondiente señal de TCRζ total. Los datos representan la media de los niveles de fosforilación mostrados como unidades arbitrarias ± SEM de 3 experimentos independientes. MI) Las células T se marcaron con CFSE y se estimularon como se indica. La proliferación se evaluó después de 72 h analizando el contenido de CFSE en un FACS Calibur. Se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes.

En general, se acepta que las señales transitorias desencadenadas por anticuerpos solubles no pueden inducir respuestas productivas de células T. De hecho, nosotros y otros hemos demostrado que las células T periféricas humanas, las células T transgénicas OT-I de ratón y los clones de linfocitos T citotóxicos no se activan y no se diferencian tras la estimulación con anticuerpos entrecruzados en suspensión [7, 8, 10]. . Aquí, hemos estimulado células T humanas primarias con sAbs o iAbs y analizamos sus respuestas funcionales. El tratamiento con sAbs no logró inducir la proliferación de células T (Figura 1E). Por el contrario, la Figura 1E muestra que el tratamiento de las células T con iAbs condujo a una fuerte respuesta proliferativa.

La señalización transitoria se regula a través de retroalimentaciones regulatorias negativas

Los datos presentados anteriormente muestran que sAbs indujo una cinética de señalización mediada por TCR rápida pero transitoria, que no puede inducir una respuesta productiva de células T, mientras que la estimulación con iAbs resultó en una activación sostenida de una variedad de moléculas de señalización y condujo a la proliferación. Estos datos indican que puede haber diferentes mecanismos reguladores inducidos tras la estimulación de sAbs frente a iAbs. Por lo tanto, a continuación investigamos cómo la señalización mediada por TCR se regula de manera diferencial en las dos condiciones. Presumimos que una internalización rápida de las moléculas de TCR disponibles tras la estimulación con sAbs podría proporcionar una explicación para la terminación rápida de la señalización mediada por TCR. Por lo tanto, comparamos los niveles de expresión del TCR después de la estimulación con sAbs o iAbs por citometría de flujo. La Figura 2A muestra que los sAb inducen una tasa lenta de regulación a la baja de TCR, que se hizo evidente después de 30 minutos de estimulación. Es importante señalar que la mayoría de las moléculas de señalización que hemos probado volvieron al estado desfosforilado / inactivo ya 15 minutos después de la estimulación con sAbs (Figura 1). Por lo tanto, la terminación de la señalización mediada por TCR ocurre antes de la internalización de TCR. Por otro lado, los datos presentados en la Figura 2A muestran que la estimulación con iAbs no reduce, sino que aumenta ligeramente los niveles de TCR. Esto probablemente se deba al hecho de que los Abs unidos a una matriz sólida limitan la internalización del TCR, pero no interfieren con su transporte a la membrana plasmática. Además, hemos demostrado anteriormente que la proliferación y la señalización sostenida mediada por TCR pueden ocurrir en condiciones de estimulación que inducen la regulación a la baja de TCR [7]. Por lo tanto, sobre la base de estas observaciones, excluimos que la internalización de TCR inducida por sAbs sea la causa de la señalización transitoria.

Los sAbs, pero no los iAbs, inducen ciclos de retroalimentación inhibitoria. Se trataron células T humanas purificadas con mAb CD3xCD28 solubles (sAbs) o inmovilizados (iAbs) durante los puntos de tiempo indicados. A) Medida de internalización de TCR. La expresión del TCR se evaluó mediante análisis de tinción de mAb anti-TCRαβ conjugado con PE mediante citometría de flujo. Los datos representan el% de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la expresión de TCR en relación con el tiempo 0 de 4 experimentos independientes. B) La fosforilación de c-Cbl en Y 731 y Dok2 en Y 351 se determinó mediante transferencia Western. Las bandas de c-Cbl y Dok2 fosforiladas se cuantificaron usando el software 1D ImageQuant y los valores se normalizaron a la correspondiente señal de β-actina. Los datos representan la media de los niveles de fosforilación mostrados como unidades arbitrarias ± SEM de al menos 4 experimentos independientes. C) La expresión de ZAP70 se determinó mediante transferencia Western. Se muestra una carga igual al reprobar las inmunotransferencias con anticuerpos específicos para la β-actina. Las bandas de ZAP70 se cuantificaron como anteriormente. Los datos representan la media de los niveles de expresión mostrados como unidades arbitrarias ± SEM de 6 experimentos independientes. D) La fosforilación de tirosina de Fyn y Lck en el bucle de activación se determinó mediante transferencia Western usando el anticuerpo pSrc (Y 416). Las bandas se cuantificaron utilizando el software 1D ImageQuant y los valores se normalizaron a las correspondientes señales Fyn y Lck totales. Los datos del gráfico representan la media de los niveles de fosforilación mostrados como unidades arbitrarias ± SEM de 4 experimentos independientes. Los asteriscos (*) indican la cadena pesada de Ig. Análisis estadístico ** P & lt0.01 ns, no estadísticamente significativo.

Habiendo descartado esta posibilidad, nos centramos a continuación en el análisis de los eventos de regulación por retroalimentación, que se ha demostrado que desempeñan un papel crucial en la activación de las células T [11-13]. Los circuitos de retroalimentación negativa proximal pueden ser activados por el signalosoma de TCR y pueden regular la amplitud, la duración y la especificidad de la señal (revisado en Acuto et al. [13]). Hicimos la pregunta de si la estimulación con sAbs inducía la activación de moléculas reguladoras negativas que pueden terminar la señalización, dando como resultado la señal transitoria observada anteriormente. Entre las muchas moléculas inhibidoras que organizan circuitos reguladores negativos, decidimos centrarnos en c-Cbl, una ubiquitina ligasa E3 perteneciente a la familia CBL, y la proteína adaptadora Dok2, que regula la señalización mediada por TCR a través de dos mecanismos diferentes. Mientras que los miembros de la familia CBL están involucrados en la regulación negativa de las moléculas de señalización a través de la ubiquitinación [14], Dok2 y su homólogo Dok1 inhiben la activación de las vías de señalización compitiendo por la unión a los dominios SH2 o reclutando otros reguladores negativos, como SHIP1 y RasGAP. , al signalosoma TCR [15]. Se ha informado que la actividad de c-Cbl y Dok2 está regulada por la fosforilación de tirosina [15-17] y puede controlarse fácilmente mediante el uso de anticuerpos fosfoespecíficos anti-c-Cbl y anti-Dok2, respectivamente. La Figura 2B muestra que tras la estimulación de sAbs, las células T fosforilaron muy rápida y fuertemente tanto c-Cbl como Dok2, mientras que el tratamiento de células T humanas con iAbs dio como resultado solo una fosforilación muy débil de ambas moléculas.

c-Cbl se dirige a muchas moléculas de señalización para la degradación, incluido ZAP70 [18]. Por lo tanto, a continuación probamos si sAbs, además de inducir una fuerte fosforilación de c-Cbl, también induciría la ubiquitinación y degradación de ZAP70. Anteriormente hemos demostrado en células T OT-I de ratón que la ubiquitinación de ZAP70 da como resultado la aparición de bandas de ZAP70 que muestran una migración retardada en SDS-PAGE [7]. Verificamos si la estimulación con CD3xCD28 Abs soluble también resultó en la aparición de bandas de ZAP70 con un peso molecular más alto en las células T humanas primarias y descubrimos que la activación / fosforilación de c-Cbl tras la estimulación con sAbs se correlaciona de hecho con la migración retardada de ZAP70 (Figura 2C). Además, los datos presentados en la Figura 2C sugieren que la estimulación con sAbs también indujo la degradación de ZAP70. Por el contrario, la estimulación con iAbs no indujo significativamente ni la fosforilación de c-Cbl ni la migración y degradación retardadas de ZAP70 (Figura 2C). Por tanto, parece que la estimulación con sAbs activa bucles de retroalimentación inhibitoria que pueden ser responsables de terminar la señalización mediada por TCR.

Además de inducir una fuerte fosforilación de tirosina de c-Cbl y Dok2, la estimulación con sAbs también da como resultado una fuerte fosforilación de moléculas de señalización proximales de TCR que incluyen TCRζ, ZAP70 y LAT (Figura 1B, 1C). Por lo tanto, investigamos si los sAbs inducen una activación más fuerte de las tirosina quinasas Lck y Fyn en comparación con los iAbs. Inmunoprecipitamos TCRζ y evaluamos el nivel de Lck y Fyn activos asociados con el TCR. Como se muestra en la Figura 2D, la estimulación de sAbs mejora significativamente el nivel de Lck y Fyn fosforilado en el bucle de activación, lo que se cree que es un signo de una enzima activa. Por el contrario, este aumento significativo en la fosforilación de Lck y Fyn no se observa con la estimulación de iAbs. Por lo tanto, los datos sugieren que, en marcado contraste con iAbs, la estimulación de sAbs mejora la activación de Lck y Fyn. Postulamos que la activación mejorada de Lck y Fyn puede resultar en una fosforilación de tirosina más fuerte de las moléculas aguas abajo (incluidos los reguladores negativos, como c-Cbl y Dok2), lo que podría desequilibrar la señalización mediada por TCR, amortiguando así la activación de las células T.

La activación sostenida está regulada por bucles de retroalimentación positiva

A continuación, investigamos si los iAbs pueden desencadenar bucles de retroalimentación positiva, lo que conduce a una activación sostenida de la señalización mediada por TCR. En particular, exploramos el circuito regulador que implica la fosforilación de Lck por Erk activado [11]. Este modelo se basa en observaciones que muestran que la fosforilación de Lck mediada por Erk en la serina 59 altera la movilidad de Lck y la capacidad del dominio SH2 de Lck para unirse a las fosfotirosinas [19-21]. Stefanova y col. demostraron además que la fosforilación de Lck mediada por Erk previene la unión de SHP-1, interfiriendo así con la inactivación de Lck mediada por SHP-1 [11]. Según este modelo, Erk activo retroalimentaría a Lck para mantener la señalización. Para evaluar si la estimulación con iAbs desencadena este bucle de retroalimentación positiva mediada por Erk, se estimularon las células T con iAbs y sAbs y se detectó la fosforilación de Lck en S 59 mediante la aparición de una nueva banda de Lck a 59 kDa mediante Western blot [11 ]. Como se muestra en la Figura 3A y B, la estimulación de las células T con iAbs dio como resultado claramente la formación de p59 Lck (hasta el 50% del Lck total), mientras que este cambio en el peso molecular de Lck fue apenas detectable con el tratamiento con sAbs.

Los iAbs inducen un ciclo de retroalimentación positiva mediada por Erk. A) Las células T humanas purificadas se trataron con mAb CD3xCD28 solubles (sAbs) o inmovilizados (iAbs) durante los puntos de tiempo indicados. La expresión de Lck se detectó en lisados ​​celulares mediante inmunotransferencia anti-Lck. B) Las bandas correspondientes a p56 o p59 Lck se cuantificaron como se describe en la Figura 2. Los datos representan la relación de los niveles de p56 y p59, y el Lck total (p56 + p59) mostrado como unidades arbitrarias ± SEM de 5 experimentos independientes. C) Se trataron células T humanas purificadas con mAb CD3xCD28 inmovilizados (iAbs) durante los períodos de tiempo indicados en presencia o ausencia del inhibidor I de MEK o U0126. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western usando los Abs indicados. Se muestra una inmunotransferencia representativa de 4 experimentos independientes. D) Se transfectaron células J.CaM1.6 con varias construcciones que portaban diferentes mutaciones (S42A, S42D, S59A, S59D, S42A / S59A). Después de la transfección, las células se dejaron sin estimular o se estimularon con iAb durante 45 min. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western usando los Abs indicados. Se muestra un experimento representativo de cinco experimentos independientes.

Para demostrar que la aparición de p59 Lck depende realmente de la fosforilación mediada por Erk, se estimularon células T con iAbs durante 30 min en presencia o ausencia de U0126 o el inhibidor I de MEK, inhibidores del activador MEK de Erk. Se ha demostrado previamente que este tratamiento elimina la conversión de Lck a la forma p59 [11]. De acuerdo con estas observaciones, también encontramos que el tratamiento de células T estimuladas con iAbs con U0126 o el inhibidor I de MEK abolió por completo tanto la activación de Erk como el cambio de Lck a la forma p59 (Figura 3C). A continuación, probamos si el cambio molecular de Lck tras la estimulación de iAbs es inducido de hecho por la fosforilación de S 59. Para evaluar este problema, aprovechamos las construcciones de Lck que llevan mutaciones de S a D y S a A en esta posición, que imitan la fosforilación constitutiva o previenen la fosforilación, respectivamente. Usamos los siguientes mutantes S59D, S59A, S42D, S42A y S42A / S59A, que se expresaron en la línea de células T Jurkat deficiente en Lck J.CaM1.6. Como se muestra en la Figura 3D, las mutaciones de S 42 no afectan el cambio de movilidad de Lck en células no estimuladas o estimuladas con iAbs. Por el contrario, la mutación S59D da como resultado un cambio constitutivo a p59 Lck, lo que indica que la fosforilación en este sitio juega un papel importante en la regulación de la movilidad de Lck. Por consiguiente, la sustitución de S59A, que da como resultado un mutante no fosforilable, evita la generación de la forma de 59 kDa de Lck tras la estimulación con iAbs (Figura 3D). En resumen, estos datos demuestran que la fosforilación de Lck mediada por Erk en S 59 da como resultado su movilidad retardada en SDS-PAGE.

Para comprobar si la inhibición de la fosforilación de Lck mediada por Erk también resultó en una reducción de su actividad, investigamos los niveles de fosforilación de moléculas de señalización aguas abajo que son sustratos de Lck, como la tirosina quinasa ZAP70 y la proteína adaptadora LAT cuya fosforilación depende de ZAP70. . Las células T se estimularon durante 30 min con iAbs. Posteriormente, la actividad de Erk se bloqueó mediante la adición del inhibidor de MEK U0126. Los datos presentados en (Figura 4A, B) muestran que la fosforilación de ZAP70 y LAT se reduce con la inhibición de MEK, lo que indica que la fosforilación de Lck mediada por Erk puede mejorar su respuesta. Por el contrario, el tratamiento de células T estimuladas con sAbs con el inhibidor de MEK redujo la fosforilación de Erk, como se esperaba, pero no la fosforilación de ZAP70 o LAT (Figura 4C, D).

Un bucle de retroalimentación Erk-Lck regula la señalización mediada por TCR. A) Se trataron células T humanas purificadas con iAbs solo durante 30 min y luego se añadió DMSO o el inhibidor de MEK U0126 y se incubaron durante 30 a 60 min más. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western utilizando los Abs indicados. B) Las bandas en A) se cuantificaron y los valores se normalizaron como se describe. Los gráficos muestran la media de los niveles de fosforilación de Erk1 / 2, ZAP70 y LAT o el nivel de p59 Lck como unidades arbitrarias ± SEM de 4 experimentos independientes. C) Se preincubaron células T humanas purificadas en presencia de DMSO o del inhibidor de MEK U0126 y posteriormente se estimularon con sAbs durante los puntos de tiempo indicados. Las muestras se analizaron mediante transferencia Western usando los Abs indicados. D) Bandas en C) se cuantificaron como se describió anteriormente y se muestran los datos de al menos dos experimentos independientes.

En conjunto, estos datos sugieren que la estimulación con iAbs activa un bucle de retroalimentación positiva mediada por Erk que se requiere para la adecuada respuesta y proliferación de las células T. Es importante destacar que el circuito regulador inducido por iAbs parece imitar un mecanismo descrito anteriormente que se induce en las células T tras la estimulación fisiológica [11].

La mejora de la fosforilación de las cinasas Src convierte la señal sostenida en transitoria

Los datos presentados anteriormente sugieren que sAbs e iAbs inducen señales cualitativamente diferentes y regulación de retroalimentación que se traducen en distintas respuestas celulares. Aún no se comprende completamente cómo la célula detecta la calidad de la señal. Nuestros datos sugieren que los sAbs inducen una activación de quinasas Src más fuerte y un patrón de fosforilación de tirosina más fuerte en comparación con la estimulación de iAbs (Figura 1). Estas observaciones pueden sugerir que las Src quinasas están involucradas en descifrar la naturaleza de la señal. Para probar la contribución de Lck, la cinasa Src principal en las células T, en la regulación de la dinámica de señalización, suprimimos su expresión por ARNi en las células T Jurkat y evaluamos los efectos sobre la activación de Erk. La Figura 5A muestra que las células que expresan una cantidad baja de Lck mostraron una activación prolongada de Erk1 / 2.Estas observaciones están en línea con estudios previos que muestran que la eliminación de Lck en Jurkat y las células T humanas primarias prolonga la fosforilación de Erk y la activación transcripcional [22, 23].

La fosforilación de Lck se correlaciona con una disminución de la activación de las células T. A) Se transfectaron células T Jurkat con dúplex de ARNip Lck o control de ARNip (Ctrl) y se cultivaron durante 48 h. Posteriormente, las células se estimularon con mAb CD3 solubles (clon OKT3) durante los tiempos indicados. Los lisados ​​celulares se analizaron mediante inmunotransferencia usando los Abs indicados. Se muestra la inmunotransferencia que verifica la regulación a la baja de Lck. Se muestra un experimento representativo de tres experimentos independientes. B)-D) Se trataron células T CD4 + humanas purificadas con mAb CD3xCD28 inmovilizados (iAbs) en presencia o ausencia de mAb CD4 reticulado como se indica. B) Los niveles de fosforilación de las quinasas Erk1 / 2 y Src se determinaron mediante transferencia Western. Las bandas fosfoespecíficas se cuantificaron utilizando el software 1D ImageQuant y los valores se normalizaron a la correspondiente señal de β-actina. Los datos del gráfico representan la media de los niveles de fosforilación mostrados como unidades arbitrarias ± SEM de 3 experimentos independientes. C) 24 h después de la estimulación, se analizó la activación de las células T CD4 + mediante tinción con CD69 y citometría de flujo. Los datos del gráfico representan la media de los niveles de expresión mostrados como unidades arbitrarias ± SEM de 3 experimentos independientes. D) Las células T CD4 + se marcaron con CFSE y se estimularon como se indica. La proliferación se evaluó después de 72 h analizando el contenido de CFSE en un LSRFortessa. Se muestra un experimento representativo de 3 experimentos independientes.

A continuación, decidimos investigar si una fuerte fosforilación de Lck y Fyn puede convertir una señal sostenida en transitoria. Con este objetivo, se estimularon células T humanas primarias CD4 + con iAb durante un período de tiempo corto y posteriormente se reticuló CD4 usando mAb anti-CD4 solubles. Se sabe que la reticulación de CD4 da como resultado trans-fosforilación de Lck, mejorando así fuertemente su actividad. Como se presenta en la Figura 5B, la reticulación de CD4 dio como resultado una fuerte inducción de la fosforilación de Lck medida usando un anticuerpo anti-pY 416 Src. Más importante aún, la fosforilación de Lck mejorada fue paralela a una reducción significativa en la fosforilación de Erk (Figura 5B). En consecuencia, encontramos que también la expresión y la proliferación de CD69 se redujeron fuertemente tras la reticulación de CD4 (Figura 5C, D). Estos datos sugieren que una fuerte actividad quinasa de la familia Src puede resultar en la activación de señales inhibidoras que suprimen la activación de las células T.

En resumen, hemos demostrado que la estimulación con iAbs induce una regulación por retroalimentación diferente a la del tratamiento con sAbs (Figura 6). Los sAbs conducen a una activación fuerte y rápida de las cinasas Src y, posteriormente, a la fosforilación de moléculas inhibidoras (por ejemplo, c-Cbl, Dok2), que terminan la señalización. Por otro lado, los iAbs inducen sólo un ligero aumento en la actividad de la quinasa y un bucle de retroalimentación positiva Erk-Lck, que puede ser necesario para prevenir la desfosforilación rápida de Lck por SHP-1 u otras fosfatasas y, por lo tanto, conduce a una activación sostenida.

Regulación por retroalimentación de la señalización mediada por TCR. La estimulación de sAbs desencadena una fuerte fosforilación de las cinasas Src, como Lck, y conduce a una fuerte activación de las vías de señalización aguas abajo. Además de la activación de reguladores positivos, los sAbs también inducen moléculas inhibidoras (c-Cbl, Dok2), que podrían desequilibrar la señalización mediada por TCR, terminando así rápidamente la activación de las células T (lado izquierdo). Por otro lado, la estimulación iAbs da como resultado la activación de un bucle de retroalimentación positiva Erk-Lck, que se requiere para mantener la señalización (lado derecho).


Discusión

Asignación de las fracciones AEC separadas

Basándose en la determinación de proteínas por SDS-PAGE y espectrometría de masas, las fracciones 2 a 4 de AEC podrían asignarse a PSII y PSI. Aunque la Fracción 1 contenía subunidades proteicas de PSII, las bajas cantidades de proteína, pero las altas concentraciones de pigmentos, en esta fracción hace poco probable que la Fracción 1 consista en complejos de proteína pigmentada específicos. El predominio de las subunidades de la proteína PSII en la Fracción 2 aboga por la presencia de una gran cantidad de complejos centrales de PSII en esta fracción. La fracción 3 contenía subunidades de proteínas tanto de PSII como de PSI y parece representar una fracción con una población mixta de complejos centrales de PSII y PSI. La fracción 4, por otro lado, se caracterizó por un número menor de proteínas PSII en comparación con las fracciones 2 y 3, pero aún contenía las tres subunidades de PSI que se observaron típicamente en el presente estudio. Esto aboga por una mayor concentración de complejos centrales de PSI en la Fracción 4. La Fracción 5, que representaba el pico principal del cromatograma AEC, se caracterizó por un fuerte enriquecimiento de proteínas FCP y, por lo tanto, lo más probable es que represente los complejos FCP periféricos de T. pseudonana. El enriquecimiento de los complejos del núcleo de PSII en la Fracción 2 y PSI en la Fracción 4 estaba en línea con la caracterización espectroscópica de estas fracciones. La fracción 2 contenía moléculas de Chl a que se absorbían en longitudes de onda más cortas en la parte roja del espectro que son típicas de PSII. La fracción 4, por otro lado, se caracterizó por la presencia de moléculas Ch1a que absorben y emiten fluorescencia de longitudes de onda más largas típicas de PSI. La fracción 5 contenía moléculas de Chl a que se absorbían a longitudes de onda más cortas en la parte roja del espectro que está en línea con la presencia de complejos de FCP en esta fracción. La alta emisión de fluorescencia de la Fracción 5 en la región de longitud de onda larga es probablemente causada por una fuerte agregación de los FCP por la alta concentración de sal necesaria para la elución como en los experimentos de Schaller et al. [30] que utilizó iones Mg 2+ para agregar los complejos FCP. En algunos casos, se observó una emisión de longitud de onda corta para la Fracción 5. En este caso, es razonable creer que los complejos FCP en la Fracción 5 mostraron una agregación más débil. Las diferencias en el estado de agregación de los complejos de FCP en la Fracción 5 pueden haber sido causadas por ligeras diferencias en las condiciones de solubilización de las membranas de tilacoides, que, en general, no podrían aislarse con una reproducibilidad tan alta como p. tilacoides de espinaca. La fracción 5 mostró relaciones altas de Fx por Chl a y Fx por DD, lo que es típico de los complejos de FCP con una función primaria de captación de luz. Aunque la Fracción 5 contenía la mayor parte de los complejos FCP de T. pseudonana, Los complejos FCP también estaban presentes en las Fracciones 2 a 4. Sin embargo, las concentraciones más altas de β-caroteno de las Fracciones 2 a 4 indican que los complejos centrales de PSI y PSII y no los complejos de FCP estaban enriquecidos en estas fracciones. La presencia de complejos FCP en los complejos centrales de PSII aislados observados en el presente estudio está en línea con los estudios de Nagao et al. [26, 28]. En estos estudios, las membranas tilacoides de la diatomea céntrica C. gracilis se solubilizaron con Triton X-100 y los complejos centrales de PSII que desprendían oxígeno se aislaron mediante centrifugación diferencial [26]. Estas preparaciones de FCP que contienen PSII podrían luego purificarse adicionalmente mediante cromatografía de intercambio aniónico [28]. Como en nuestra actual separación AEC, Ikeda et al. [17, 18] complejos centrales de PSI aislados con complejos de FCP asociados de las diatomeas céntricas C. gracilis y T. pseudonana con la ayuda de centrifugación en gradiente de sacarosa y cromatografía de exclusión por tamaño [17] o centrifugación en gradiente de sacarosa en combinación con AEC [18]. Los procedimientos de aislamiento condujeron a la purificación de complejos de núcleo de PSI con dos complejos de FCP diferentes que se denominaron FCPI-1 y FCPI-2. FCPI-2 parece estar estrechamente asociado con el complejo central de PSI, mientras que FCPI-1 se pierde después de un tratamiento con detergente más severo. Ikeda y col. [18] propuso que el complejo FCPI-2 media la transferencia de energía de excitación entre el FCPI-1 más periférico y el núcleo PSI.

Según los datos recientes de Gundermann et al. [16] que purificó los complejos FCP de la diatomea céntrica C. meneghiniana con una combinación de AEC y centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa es posible que durante la separación de AEC descrita en el presente estudio haya tenido lugar una coelución de complejos de FCPa y complejos de núcleo de PSII y PSI. El perfil de elución de AEC presentado por Gundermann et al. [16] muestra un pico pronunciado a altas concentraciones de sal que se ha asignado al complejo FCPb. Se eluyeron picos más pequeños adicionales de la columna a concentraciones de sal más bajas y se han caracterizado como diferentes subtipos de los llamados complejos FCPa. Mientras que el pico de FCPb a altas concentraciones de sal corresponde muy probablemente a la Fracción 5 de la presente separación de AEC, los picos de FCPa más pequeños exhiben tiempos de retención que son comparables con los tiempos de retención de las fracciones de PSII y PSI, es decir, las Fracciones 2 a 4, de nuestra separación de proteínas. . La posible coelución de los complejos de FCPa y las fracciones de PSII / PSI hace que sea difícil decidir si las FCP que se encuentran en las presentes fracciones de PSII y PSI representan proteínas de antena que están estrechamente asociadas con los complejos del núcleo del fotosistema o si estas proteínas son subunidades de los diferentes complejos FCPa de T. pseudonana.

Separación de los complejos de proteínas pigmentarias de T. pseudonana con el método presentado en este estudio se comparó con la separación de las proteínas pigmentarias fotosintéticas de la espinaca (archivo adicional 2A). La separación de las proteínas del pigmento de la espinaca dio lugar a la aparición de un pico mayor y varios picos menores. El pico principal, que eluyó a 12-15 ml, mostró máximos pronunciados de Chl a y Chl b en la parte azul y roja del espectro y podría asignarse inequívocamente al LHCII (archivo adicional 3). El breve tiempo de retención del LHCII indica que el principal complejo de captación de luz de las plantas superiores exhibe una carga neta negativa bastante baja y, por tanto, podría eluirse de la columna AEC con bajas concentraciones de sal. El FCP periférico de T. pseudonana, por otro lado, se caracterizó por el mayor tiempo de retención de los complejos de proteína pigmentada de diatomeas separados y solo eluyó a altas concentraciones de NaCl, lo que indica una alta carga negativa de los complejos FCP. Comparando los complejos LHCII y FCP periférico, es posible que las regiones expuestas de las proteínas, que interactúan con la matriz cargada positivamente de la columna AEC, muestren diferencias en su carga negativa. También es posible que las diferencias en el estado de oligomerización de los complejos captadores de luz conduzcan a diferentes cargas netas negativas y, por tanto, a diferentes tiempos de retención. El LHCII de plantas superiores generalmente se aísla como LHCII trimérico. Los estados oligoméricos más altos de los complejos FCP son típicos de las diatomeas céntricas como C. meneghiniana o la diatomea utilizada en el presente estudio, T. pseudonana. En estas algas, los complejos FCPb, que representan la última fracción de proteína en la purificación de los complejos FCP por AEC [16], y por lo tanto son comparables a la Fracción 5 de la presente separación, parecen estar compuestos de nonámeros FCP mientras que los complejos FCPa muestran un trimérico estructura [3, 13, 27]. El aumento de la carga superficial negativa de los FCP se puede observar junto con la alta concentración del lípido SQDG cargado negativamente en las membranas tilacoides de las diatomeas [22]. La repulsión pronunciada entre FCP y SQDG puede conducir a la separación de PSI en regiones de la membrana tilacoide externa enriquecidas con SQDG y PSII y el FCP periférico en las laminillas de la membrana interna compuestas principalmente de MGDG. Esta separación del fotosistema ha sido propuesta por Lepetit et al. [22] y ha sido respaldado recientemente por los datos de Bina et al. [4] y Flori et al. [10].

Aplicabilidad del presente método de separación AEC

El método AEC presentado en este estudio permite la purificación previa del núcleo PSI y PSII y los complejos FCP de la diatomea céntrica. T. pseudonana. También se probó para la separación de las proteínas pigmentarias de la diatomea céntrica bien caracterizada. C. meneghiniana. Estos análisis arrojaron un fraccionamiento comparable de las membranas tilacoides solubilizadas (consulte el archivo adicional 2B). Los complejos de proteína de pigmento aislados pueden servir como material de partida para la purificación final de los respectivos complejos usando un método de purificación de proteínas separado, tal como cromatografía de exclusión por tamaño o centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. La purificación parcial, es decir, el aislamiento de las fracciones del complejo central de PSI y PSII que contienen complejos de FCP, permite diferenciar entre los complejos de FCP que están más estrechamente asociados con los complejos de núcleo de PSI y PSII y los complejos de FCP que forman los complejos de antena periférica. , siempre que la aparición de FCP en las fracciones de PSI y PSII no represente una coelución de complejos de FCP-A y complejos de núcleo de PS.

Heterogeneidad de los FCP

La fracción 5 de la presente separación de AEC contenía los complejos FCP periféricos que no estaban asociados con los complejos centrales de PSI y PSII. Los complejos de FCP periféricos estaban dominados por la presencia de la banda de proteína de 21 kDa y la banda de FCP de 18 kDa solo se detectó en baja concentración. Según el análisis por espectrometría de masas, la banda de 21 kDa estaba compuesta exclusivamente por las proteínas Lhcf8 y Lhcf9. Curiosamente, Lhcf8 y Lhcf9 también se encontraron en la banda de 18 kDa pero, según los datos del análisis 1 del presente estudio, no en todas las fracciones de la AEC. No se detectaron proteínas Lhc adicionales en el FCP periférico. Según la separación AEC presentada por Gundermann et al. [16] La fracción 5 corresponde a los complejos FCPb de C. meneghiniana. Gundermann y col. [16] detectaron Fcp5 / Lhcf3 como la proteína Lhc más prominente en los complejos FCPb. Lhcf3 estuvo acompañada de bajas concentraciones de Lhcf1 y Lhcf4 / Lhcf6. Este último, sin embargo, solo se encontró en el complejo FCPb2. Teniendo en cuenta que en T. pseudonana los genes Lhcf3, Lhcf8 y Lhcf9 similares codifican una proteína idéntica, los datos del presente estudio sobre la composición proteica de los complejos FCP periféricos están de acuerdo con los datos de Gundermann et al. [16] relativo al FCPb. Además de las proteínas Lhcf, Gundermann et al. [16] observó la presencia de las proteínas Lhcx1 y Lhcx6_1 en el FCPb que se purificó a partir de cultivos de alto crecimiento con luz. Estas proteínas no se detectaron en el presente estudio como componentes de la FCP periférica. La aparición de la proteína Lhcf8 en la banda de FCP de 21 kDa está en línea con los datos publicados por Nagao et al. [27] que detectó la proteína Lhcf8 en las bandas de 21 kDa del FCP oligomérico y trimérico de T. pseudonana. La proteína Lhcf9, que se detectó como un componente adicional de la banda de 21 kDa en el presente estudio, no fue observada por Nagao et al. [27]. Sin embargo, esta proteína probablemente sea idéntica al producto del gen Lhcf8. El FCP oligomérico de T. pseudonana, que fue purificado por Nagao et al. [27] por PAGE nativa clara, se caracterizó por la presencia única de la banda FCP de 21 kDa. Por tanto, es comparable a los complejos de FCP periféricos aislados en el presente estudio que también estaban dominados por la banda de 21 kDa. Los hallazgos del presente estudio también están en línea con las observaciones recientes de Calvaruso et al. [6] que el complejo periférico FCPb de T. pseudonana consta de las proteínas Lhcf8 / Lhcf9. Como la banda de 21 kDa de la Fracción 5, las bandas de 21 kDa de las otras fracciones de AEC contenían solo Lhcf8 y Lhcf9. Al igual que la banda de 21 kDa, la banda de 18 kDa mostró una composición proteica comparable en las diferentes fracciones a excepción de Lhcf8 y Lhcf9 que, según el análisis 1, solo se encontraron en la banda de 18 kDa de las Fracciones 2 y 5. Lhcf1, Lhcf2, Lhcf5 y Lhcf6, por otro lado, se encontraron en todas las fracciones y, por tanto, parecen representar las principales proteínas Lhcf de la banda de 18 kDa. Mientras que en el primer análisis de EM realizado en el presente estudio Lhcf4 solo se detectó en la banda de 18 kDa de la Fracción 2, el segundo análisis de EM indicó la presencia de la proteína Lhcf4 en la banda de 18 kDa de las Fracciones 2 a 4. La presencia de Lhcf5 en la banda de FCP de 18 kDa está en línea con los datos de Nagao et al. [27] que observaron dos bandas de FCP en la región de 18 kDa de los complejos de FCP triméricos de T. pseudonana. Según su análisis espectrométrico de masas, la banda principal de 18 kDa contenía Lhcf5 y, además, Lhcf1 y Lhcf4. En el presente estudio, tanto Lhcf1 como Lhcf4 también se detectaron en la banda de 18 kDa de las Fracciones 2 a 4. La banda menor de 18 kDa en el estudio de Nagao et al. [27] se caracterizó por la presencia adicional de Lhcf6, Lhcf7 y Lhcf11. Lhcf6 representó un componente de las Fracciones 2 a 4 de la presente separación AEC, mientras que Lhcf7 solo se detectó en el segundo análisis por espectrometría de masas y solo ocurrió en la Fracción 2. Sin embargo, Lhcf11 no se observó en las respectivas fracciones del presente estudio. La ausencia de Lhcf11 se explica muy probablemente por el hecho de que en las presentes separaciones de proteínas mediante SDS-PAGE no se resolvió una banda menor de FCP de 18 kDa. La presencia de Lhcf4 en la banda de 18 kDA de la Fracción 2, que parece estar enriquecida en PSII, está en línea con el reciente aislamiento de un supercomplejo PSII-FCP de C. gracilis [35]. Sobre la base de los datos estructurales, se propuso que el monómero FCP-E, que está estrechamente asociado con el complejo del núcleo de PSII y media la interacción de uno de los tetrámeros de FCP-A con el núcleo, representa una subunidad similar a Lhcf4. Curiosamente, el monómero FCP-D, que también participa en la interacción del FCP-A periférico con el complejo central de PSII, parece ser una proteína LHC relacionada con Lhca.

Teniendo en cuenta que podría haber tenido lugar una coelución de los complejos de núcleo de PSII y PSI y los complejos de FCPa en la separación AEC del presente estudio, una comparación con la composición de proteínas de los diferentes complejos de FCPa publicada por Gundermann et al. [16] parece valioso. En el presente estudio, Lhcf1, Lhcf2, Lhcf5 y Lhcf6, con una presencia adicional de Lhcf8 y Lhcf9, parecían representar las principales proteínas de las fracciones 2 a 4 de AEC, que corresponderían a los diferentes complejos de FCPa. Gundermann y col. [16] observó que los complejos FCPa de C. meneghiniana estaban dominadas por las proteínas Lhcf1, Lhcf4 / Lhcf6 y Lhcf3. Según su análisis por espectrometría de masas, FCPa1, FCPa3 y FCPa4 contienen Lhcf1 como la principal proteína Lhcf mientras que FCPa2 se caracteriza por una alta concentración de Lhcf4 / Lhcf6.

Proteínas FCP adicionales que fueron detectadas por Gundermann et al.[16] como constituyentes de los complejos FCPa fueron las proteínas Lhcx1 y Lhcx6_1. En el presente estudio se encontraron cuatro proteínas Lhcx diferentes, a saber, Lhcx1, Lhcx2, Lhcx5 y Lhcx6_1. Las proteínas Lhcx1, Lhcx2 y Lhcx5 se observaron en la Fracción 2 de la separación de AEC, que según su composición proteica, representa una fracción enriquecida en complejos núcleo PSII. Lhcx6_1 era un constituyente de la Fracción 1 que, debido a su alta concentración de DD, Dt y Fx, debe considerarse como una mezcla de proteína y fracción de pigmento libre.

Las fracciones 3 y 4 no contenían proteínas Lhcx pero, además de las proteínas Lhcf, se caracterizaron por la presencia de dos proteínas Lhcr en cada fracción. Mientras que la Fracción 3 contenía Lhcr3 y Lhcr14, Lhcr1 y Lhcr3 se encontraron en la Fracción 4. Además, Lhcr3 se detectó en la Fracción 2. La presencia de proteínas Lhcr en las fracciones AEC que contienen proteínas del complejo central de PSI está en línea con los datos de la literatura que describen las proteínas Lhcr como proteínas de antena específicas de PSI [13, 18]. Mientras que en el presente estudio se detectaron Lhcr1, Lhcr3 y Lhcr14, Grouneva et al. [13] observaron Lhcr1, Lhcr3, Lhcr4, Lhcr7, Lhcr10, Lhcr11 y Lhcr14 en su análisis del proteoma tilacoide de T. pseudonana. El análisis de los complejos PSI-FCPI de T. pseudonana aislado mediante una combinación de centrifugación en gradiente de sacarosa y AEC [18] mostró la presencia de Lhcr1, Lhcr3, Lhcr4, Lhcr10, Lhcr13 y Lhcr14 como proteínas de antena de PSI.

Asignación de otras proteínas importantes

La fracción 2 de la presente separación AEC, que está enriquecida en complejos centrales de PSII, contiene otra proteína interesante, a saber, la DD de-epoxidasa (DDE). DDE es la enzima que cataliza la reacción directa del ciclo de xantofilas de las diatomeas, la des-epoxidación de DD a Dt (para una revisión de los ciclos de xantofilas y NPQ, ver [11]). Dt es uno de los componentes responsables del proceso de NPQ. Otro factor importante para NPQ es la presencia de proteínas Lhcx que también se encuentran en la Fracción 2 del gradiente AEC que contiene PSII. Se cree que las proteínas Dt y Lhcx desempeñan un papel en el sitio de extinción Q2 que se encuentra cerca del complejo central de PSII y, junto con el sitio de extinción Q1, proporciona protección de PSII contra daños causados ​​por una energía de excitación excesiva.


Materiales y métodos

Son

Se introdujo un epítopo myc en el NH2 término de Emp24p maduro. El myc-etiquetado emp24-E178A mutante se construyó sustituyendo un fragmento apropiado de EMP24 con la versión mutante secuenciada obtenida mediante técnicas de PCR. RH4443 (MATα, ura3, leu2, his4, bar1, emp24 :: KanMx) se obtuvo reemplazando todo el EMP24 secuencia de codificación de RH1959 (ESTERAα, ura3, leu2, his4, bar1) con un KanMx casete. EMP24 Los alelos se clonaron en un plásmido YCplac111 (CEN / ARS). los S. cerevisiae cepa RH696-2B (ESTERAα, sec18-20 gap1Δ :: LEU2 ura3 ade2 leu2 lys2Δ201 pPL269) se obtuvo cruzando PLY129 (pPL269) (MATα gap1Δ :: LEU2 ura3 ade2 leu2 lys2Δ201 pPL269) (Kuehn et al.1996), con RH478 (ESTERAα sec18-20 leu2 his4). Los citosoles se prepararon a partir de RH732 (MATα his4 leu2 ura3 lys2 pep4 :: URA3 bar1) y RH2043 (MATα sec18-20 his4 leu2 ura3 pep4 :: URA3 bar1).

Técnicas de proteínas

Los niveles de proteína se determinaron mediante extracción de cultivos en fase logarítmica y transferencia Western (Sütterlin et al. 1997) utilizando anticuerpos producidos contra la cola citosólica Emp24p o el epítopo myc. El análisis del transporte de Gas1p in vivo se realizó mediante un protocolo de seguimiento de pulsos (Sütterlin et al. 1997). La maduración de Gas1p se analizó utilizando un pulso de 4 minutos y seguimiento posterior a 30 ° C, seguido de inmunoprecipitación, SDS-PAGE y fluorografía. Las formas inmaduras (105 kD) y maduras (125 kD) de Gas1p se cuantificaron usando un densitómetro. El porcentaje de Gas1p maduro se utilizó como indicación de transporte al aparato de Golgi. La determinación del reparto de Gas1p entre las fases acuosa y detergente de Triton X-114 se realizó como se describe (Nuoffer et al. 1993), excepto que no se analizaron las fracciones del medio. Después de la separación en detergente y fases acuosas, Gas1p se desnaturalizó, inmunoprecipitó, se resolvió mediante SDS-PAGE, se visualizó y se cuantificó usando un PhosphorImager.

Ensayo de gemación ER in vitro

El ensayo de empaquetamiento de carga ER permeabilizado, basado en células, se realizó como se describe (Kuehn et al. 1996) con algunas modificaciones. Las cepas RH1959, RH4438 y RH696-2B se transformaron con pCNYG1 para sobreexpresar Gas1p (aproximadamente cinco veces) (Nuoffer et al. 1991). La sobreexpresión no afectó la cinética de transporte de Gas1p o la dependencia de EMP24. El ácido 2-mercaptoetanosulfónico 10 mM reemplazó al ditiotreitol 10 mM. Las reacciones de gemación contenían 30 μl de membranas (de 12 × 10 7 células), 300 μg de citosol crudo, 3 μg de Sar1p, mezcla de 1 × ATP y GTP 0,2 mM en un volumen de 150 μl. Después de 2 ha 25 ° C, se retiró una porción de la muestra para análisis (total), se sedimentó la alícuota restante (14,000 rpm, 2 min, 4 ° C), y se recolectaron 125 μl del sobrenadante y se sometieron a flotación en un gradiente escalonado de Nycodenz® (Barlowe et al. 1994). Se descartaron 100 µl de la parte superior y los siguientes 800 µl se transfirieron a un tubo nuevo. 400 μl se diluyeron tres veces con B88 y se centrifugaron (100.000 gramo, 1 h, 4 ° C). El sedimento de la membrana se disolvió en SDS al 1% en tampón TEPI (Sütterlin et al. 1997) durante 10 min a 55 ° C, se sometió a inmunoprecipitación y se analizó mediante SDS-PAGE con posterior exposición y cuantificación utilizando un PhosphorImager.

Inmunoaislamiento de vesículas

Las vesículas se produjeron en una reacción de gemación utilizando seg18 membranas y citosol. los seg18 las membranas se prepararon como anteriormente, excepto que los últimos 5 minutos de agotamiento y el marcaje por pulsos fueron a 32ºC. los seg18 El citosol se preincubó (32 ° C, 10 min) antes de su uso. Las vesículas se inmunoaislaron con o sin el anticuerpo anti-cola Emp24p y se procesaron de acuerdo con Kuehn et al. 1996.

Vinculación cruzada

Las vesículas purificadas con Nycodenz producidas en una reacción de gemación se ajustaron a urea 2,5 M en B88 y se incubaron con ditiobis (succinimidilpropionato) (DSP) 1 mM o varias cantidades de glutarato de disuccinimidilo (DSG Pierce) (20 ° C, 20 min). La reacción de reticulación se detuvo mediante la adición de glicina (50 mM final, 5 min, 20ºC). Las vesículas se sedimentaron a 100.000 gramo (1 h, 4 ° C), disuelto con SDS al 1% en TEPI (5 min, 95 ° C para Gas1p y factor α glicosilado [gpαF], o 55 ° C para Gap1p), e inmunoprecipitado con anticuerpo anti-cola Emp24p o anticuerpo Erv25 (Belden y Barlowe 1996) y proteína A-Sepharose. El material precipitado se eluyó de las perlas de Sepharose mediante incubación con SDS al 1% en TEPI (5 min, 95 o 55ºC) y se volvió a inmunoprecipitar con anticuerpo anti-Gas1p o anti-Gap1p.


Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Amarillas, L., Chaidez, C., Gonz & # x00E1lez-Robles, A., y Le & # x00F3n-F & # x00E9lix, J. (2016). Secuencia completa del genoma del nuevo bacteriófago phiE142, que provoca simultáneamente la lisis de multirresistentes Escherichia coli O157: H7 y Salmonella enterica. Pararse. Genomic Sci. 11:89.

Altschul, S. F., Madden, T. L., Sch & # x00E4ffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., et al. (1997). Gapped BLAST y PSI-BLAST: una nueva generación de programas de búsqueda de bases de datos de proteínas. Ácidos nucleicos Res. 25, 3389 y # x20133402. doi: 10.1093 / nar / 25.17.3389

Belle, A., Landthaler, M. y Shub, D. A. (2002). Homing sin intrones: la endonucleasa SegF específica del sitio del bacteriófago T4 media la exclusión de marcadores localizados de forma análoga a las endonucleasas de homing de intrones del grupo I. Genes Dev. 16, 351 & # x2013362. doi: 10.1101 / gad.960302

Clokie, M. R., Millard, A. D., Letarov, A. V. y Heaphy, S. (2011). Fagos en la naturaleza. Bacteriófago 1, 31 & # x201345.

Comeau, A. M., Bertrand, C., Letarov, A., T & # x00E9tart, F. y Krisch, H. (2007). Arquitectura modular de la superfamilia del fago T4: un genoma central conservado y una periferia plástica. Virología 362, 384 y # x2013396. doi: 10.1016 / j.virol.2006.12.031

Cuff, J. A., Clamp, M. E., Siddiqui, A. S., Finlay, M. y Barton, G. J. (1998). JPred: un servidor de predicción de estructura secundaria de consenso. Bioinformática 14, 892 & # x2013893. doi: 10.1093 / bioinformática / 14.10.892

Drivdahl, R. H. y Kutter, E. M. (1990). Inhibición de la transcripción de ADN que contiene citosina in vitro por el producto del gen alc del bacteriófago T4. J. Bacteriol. 172, 2716 & # x20132727. doi: 10.1128 / jb.172.5.2716-2727.1990

Frazier, M. W. y Mosig, G. (1990). El gen del bacteriófago T4 mrh cuyo producto inhibe la expresión del gen T4 tardío en un Escherichia coli mutante rpoH (& # x03C332). Gene 88, 7 & # x201314. doi: 10.1016 / 0378-1119 (90) 90053-t

Gamkrelidze, M. y Dabrowska, K. (2014). Bacteriófago T4 como plataforma de presentación de fagos. Arco. Microbiol. 196, 473 y # x2013479. doi: 10.1007 / s00203-014-0989-8

Gruber, H., Kern, G., Gauss, P. y Gold, L. (1988). Efecto de la secuencia y estructura del ADN sobre la actividad nucleasa de la proteína DexA del bacteriófago T4. J. Bacteriol. 170, 5830 & # x20135836. doi: 10.1128 / jb.170.12.5830-5836.1988

Herendeen, D. R., Williams, K. P., Kassavetis, G. A. y Geiduschek, E. P. (1990). Una proteína de unión a la ARN polimerasa que se requiere para la comunicación entre un potenciador y un promotor. Ciencias 248, 573 y # x2013578. doi: 10.1126 / science.2185541

Huang, Y.-J., Parker, M. M. y Belfort, M. (1999). Papel de la degradación exonucleolítica en la localización del intrón del grupo I en el fago T4. Genética 153, 1501 & # x20131512.

Kadyrov, F. A., Shlyapnikov, M. G. y Kryukov, V. M. (1997). Una endonucleasa específica del sitio del fago T4, SegE, es responsable de un intercambio genético no recíproco entre fagos relacionados con T-even. FEBS Lett. 415, 75 & # x201380. doi: 10.1016 / s0014-5793 (97) 01098-3

Kashlev, M., Nudler, E., Goldfarb, A., White, T. y Kutter, E. (1993). Proteína del bacteriófago T4 Alc: un factor de terminación de la transcripción que detecta la modificación local del ADN. Celda 75, 147 & # x2013154. doi: 10.1016 / s0092-8674 (05) 80091-1

Keen, E. C. (2015). Un siglo de investigación de fagos: bacteriófagos y la configuración de la biología moderna. Bioensayos 37, 6 & # x20139. doi: 10.1002 / bies.201400152

Kutter, E., Gachechiladze, K., Poglazov, A., Marusich, E., Shneider, M., Aronsson, P., et al. (1995). Evolución de los fagos relacionados con T4. Genes de virus 11, 285 & # x2013297. doi: 10.1007 / bf01728666

Lin, D. M., Koskella, B. y Lin, H. C. (2017). Terapia de fagos: una alternativa a los antibióticos en la era de la resistencia a múltiples fármacos. World J. Gastrointest. Pharmacol. El r. 8: 162. doi: 10.4292 / wjgpt.v8.i3.162

Loc-Carrillo, C. y Abedon, S. T. (2011). Pros y contras de la terapia con fagos. Bacteriófago 1, 111 & # x2013114. doi: 10.4161 / bact.1.2.14590

Marblestone, J. G., Edavettal, S. C., Lim, Y., Lim, P., Zuo, X. y Butt, T. R. (2006). Comparación de la tecnología de fusión SUMO con los sistemas tradicionales de fusión de genes: mayor expresión y solubilidad con SUMO. Protein Sci. 15, 182 y # x2013189. doi: 10.1110 / ps.051812706

Miller, E. S., Kutter, E., Mosig, G., Arisaka, F., Kunisawa, T. y Ruger, W. (2003). Genoma del bacteriófago T4. Microbiol. Mol. Biol. Rvdo. 67, 86 & # x2013156.

Mosig, G. y Eiserling, F. (2006). & # x201CT4 y fagos relacionados: estructura y desarrollo, & # x201D en Los bacteriófagos, 2ª Ed., Ed. R. Calendar (Oxford: Oxford University Press), 225 & # x2013267.

Mosig, G., Colowick, N. E. y Pietz, B. C. (1998). Varios genes nuevos del bacteriófago T4, mapeados mediante la secuenciación de los puntos finales de deleción entre los genes 56 (dCTPasa) y dda (una ATPasa-helicasa dependiente de ADN) modulan la transcripción. Gene 223, 143 & # x2013155. doi: 10.1016 / s0378-1119 (98) 00238-8

M & # x00FCller, U. y Marchin, G. (1977). Purificación y propiedades de un factor bacteriófago T4 que modifica la valil-tRNA sintetasa de Escherichia coli. J. Biol. Chem. 252, 6640 y # x20136645. doi: 10.1016 / s0021-9258 (17) 39895-2

M & # x00FCller, U. y Marchin, G. L. (1975). Aparición temporal de la valil tRNA sintetasa modificada por bacteriófago T4 en Escherichia coli. J. Virol. 15, 238 & # x2013243. doi: 10.1128 / jvi.15.2.238-243.1975

Pulitzer, J. F., Colombo, M. y Ciaramella, M. (1985). Nuevos elementos de control de la transcripción pre-replicativa del bacteriófago T4. J. Mol. Biol. 182, 249 & # x2013263. doi: 10.1016 / 0022-2836 (85) 90343-2

Ram & # x00F3n, A., Se & # x00F1orale, M. y Mar & # x00EDn, M. J. F. I. M. (2014). Cuerpos de inclusión: no tan mal & # x2026. Parte delantera. Microbiol. 5:56. doi: 10.3389 / fmicb.2014.00056

Sharma, M. y Hinton, D. M. (1994). Purificación y caracterización de la proteína SegA del bacteriófago T4, una endonucleasa relacionada con proteínas codificadas por intrones del grupo I. J. Bacteriol. 176, 6439 & # x20136448. doi: 10.1128 / jb.176.21.6439-6448.1994

Sharma, U. K. y Chatterji, D. (2008). Mecanismos diferenciales de unión de factores anti-sigma Escherichia coli El Rsd y el bacteriófago T4 AsiA a la ARN polimerasa de E. coli dan lugar a diversas consecuencias fisiológicas. J. Bacteriol. 190, 3434 y # x20133443. doi: 10.1128 / jb.01792-07

Skorupski, K., Tomaschewski, J., R & # x00FCger, W. y Simon, L. (1988). Un gen del bacteriófago T4 que actúa inhibiendo Escherichia coli Lon proteasa. J. Bacteriol. 170, 3016 & # x20133024. doi: 10.1128 / jb.170.7.3016-3024.1988

Stitt, B. L. y Mosig, G. (1989). La expresión alterada de ciertos genes del bacteriófago T4 prerreplicativos explica la síntesis alterada del ADN T4 en Escherichia coli mutantes rho (nusD). J. Bacteriol. 171, 3872 & # x20133880. doi: 10.1128 / jb.171.7.3872-3880.1989

Taj, M. K., Samreen, Z., Taj, I., Hassani, T. M., Ling, J. y Yunlin, W. (2014). Bacteriófago T4 como organismo modelo. IMPACTO Int. J. Res. Apl. Nat. Soc. Sci. 2, 19 & # x201324.

Uzan, M., d & # x2019 Aubenton-Carafa, Y., Favre, R., de Franciscis, V. y Brody, E. (1985). La proteína T4 mot funciona como parte de un complejo ADN-proteína pre-replicativo. J. Biol. Chem. 260, 633 & # x2013639. doi: 10.1016 / s0021-9258 (18) 89779-4

Wang, G., Vianelli, A. y Goldberg, E. (2000). Autoensamblaje del bacteriófago T4: reconstitución in vitro de gp2 recombinante en fago infeccioso. J. Bacteriol. 182, 672 & # x2013679. doi: 10.1128 / jb.182.3.672-679.2000

Wilson, G. W. y Edgell, D. R. (2009). El fago T4 mobE promueve el homing trans de la endonucleasa homing difunta I-TevIII. Ácidos nucleicos Res. 37, 7110 & # x20137123. doi: 10.1093 / nar / gkp769

Yang, Y., Ke, Z., Wang, Z., Li, Y., Li, Y., Wang, Y., et al. (2020). Asignaciones de RMN 1H, 13C y 15 N de la proteína etiqueta de solubilidad Msyb de Escherichia coli. Biomol. Asignar RMN. 14, 251 & # x2013254. doi: 10.1007 / s12104-020-09955-6

Yap, M. L. y Rossmann, M. G. (2014). Estructura y función del bacteriófago T4. Future Microbiol. 9, 1319 y # x20131327. doi: 10.2217 / fmb.14.91

Zhang, K., Wang, Z., Chang, G., Wang, H., Wang, Y. y Liu, B. (2019). Asignaciones de resonancia de la proteína del bacteriófago T4 Y04L. Biomol. Asignar RMN. 14, 51 & # x201354. doi: 10.1007 / s12104-019-09919-5

Palabras clave: bacteriófago, T4, RMN, cryo-EM, Mrh, Cef, Y04L y Gp57B

Cita: Zhang K, Li X, Wang Z, Li G, Ma B, Chen H, Li N, Yang H, Wang Y y Liu B (2021) Expresión sistémica, purificación y caracterización estructural inicial de proteínas de bacteriófago T4 sin estructura conocida Homólogos. Parte delantera. Microbiol. 12: 674415. doi: 10.3389 / fmicb.2021.674415

Recibido: 01 de marzo de 2021 Aceptado: 22 de marzo de 2021
Publicado: 13 de abril de 2021.

Shuai Le, Universidad Médica del Ejército, China

Jianfeng Yu, Universidad de Shenzhen, China
Nan Hou, Academia China de Ciencias Médicas, China

Copyright & # x00A9 2021 Zhang, Li, Wang, Li, Ma, Chen, Li, Yang, Wang y Liu. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de atribución Creative Commons (CC BY). Se permite el uso, distribución o reproducción en otros foros, siempre que se acredite al autor (es) original (es) y al propietario (es) de los derechos de autor y se cite la publicación original en esta revista, de acuerdo con la práctica académica aceptada. No se permite ningún uso, distribución o reproducción que no cumpla con estos términos.