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Contenido de ADN en semillas de plantas frente a pulpa de frutas

Contenido de ADN en semillas de plantas frente a pulpa de frutas


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¿Existe una publicación que compare el rendimiento de ADN y / o la amplificabilidad por PCR después de la extracción de la pulpa de la fruta (como manzanas, naranjas, cerezas, etc.) en comparación con las semillas de las mismas frutas?

Preferiría una referencia, pero tu experiencia inédita también me interesa.


Depende de la semilla y la fruta de la que estés hablando.

La cantidad de ADN en su muestra triturada de materia vegetal depende solo de una cosa: cuántas células hay en su muestra. Mire este diagrama de un grano de maíz (U de Indiana):

Hay diferentes densidades de células en cada área; en el endospermo, las células pueden ser enormes (y por lo tanto tienen una menor densidad de ADN en comparación con el embrión).

Veamos una semilla de mostaza manchada (U de Londres):

Como puede ver, las células aquí son muy densas. Más denso significa más ADN por unidad de muestra.

En lo que respecta a la fruta, se aplica la misma regla general. Verner, 1938 muestra algo de histología del tejido de la manzana que podría darle una idea de la densidad celular en el tejido de la fruta (nuevamente, será diferente en diferentes frutas - buscar"histología de nombre de fruta"si estás interesado).

Sin embargo, ahora que hemos hablado de la densidad, tenemos que pensar realmente en sacar el ADN. El proceso de extracción es en realidad mucho más importante en términos de su rendimiento final.

Muchas semillas de plantas contienen polifenoles, que pueden provocar la degradación del ADN. Este protocolo (Cornell U) detalla muchas de las posibles deficiencias:

También se ha informado que estos compuestos causan dificultades en la purificación del ADN en otras especies de plantas; polisacáridos (Murray y Thompson, 1980; Fang et al., 1992); compuestos polifenólicos (Katterman y Shattuck, 1983; Couch y Fritz, 1990; Howland et al. 1991; Collins y Symons, 1992); y materiales pegajosos y resinosos (Webb y Knapp, 1990).

Estos contaminantes pueden degradar el ADN, pero también inutilizarlo en la amplificación por PCR y la digestión de endonucleasas (Kim et al. 1997, Cornell U, EPICENTER Biotechnologies).

En general, definitivamente hay diferencias específicas de especie en el contenido de ADN de la planta de fruta / semilla. PrácticamenteSin embargo, el factor más importante en el rendimiento y la viabilidad del ADN para la experimentación futura es la pureza y la contaminación de la muestra. Las frutas y semillas específicas pueden contener uno o más de los contaminantes anteriores, entonces la respuesta a "¿Semillas o frutas?" definitivamente depende de la especie de planta con la que esté trabajando.


  • Las frutas se pueden clasificar en simples, agregadas, múltiples o accesorias.
  • Los frutos simples se desarrollan a partir de un solo carpelo o los carpelos fusionados de un solo ovario, mientras que los frutos agregados se desarrollan a partir de más de un carpelo que se encuentra en la misma flor.
  • Múltiples frutos se desarrollan a partir de un racimo de flores, mientras que los frutos accesorios no se desarrollan a partir de un ovario, sino de otras partes de una planta.
  • Las partes principales de una fruta incluyen el exocarpio (piel), el mesocarpio (parte media) y el endocarpio (parte interna), estas tres partes forman el pericarpio.
  • Los frutos dehiscentes liberan rápidamente sus semillas, mientras que los frutos indehiscentes dependen de la descomposición para liberar sus semillas.
  • exocarpio: la capa más externa del pericarpio de los frutos la piel
  • fruta simple: fruto que se desarrolla a partir de un solo carpelo o carpelos fusionados de un solo ovario
  • endocarpio: la parte interior de la fruta
  • mesocarpio: parte media de la fruta
  • fruta accesoria: una fruta que no se deriva del ovario sino de otra parte de la flor

Abstracto

Aunque el sabor es un aspecto importante de la calidad de la fruta, nuestra comprensión de su control genético sigue siendo difícil de alcanzar en los cultivos de manzanas y otras frutas. Análisis de secuencia genómica de 497 Malus Las accesiones revelaron una erosión de la diversidad genética causada por la reproducción de manzanas y posibles eventos de domesticación independiente de manzanas de postre y sidra. Se detectaron firmas de selección para la acidez y el tamaño de la fruta durante el proceso de domesticación y mejora, pero no para el contenido de azúcar de la fruta. Mutaciones únicas en los principales genes que afectan el sabor de la fruta, que incluyen Ma1, MdTDT, y MdSOT2, disminuyen drásticamente la acumulación de malato, citrato y sorbitol, respectivamente, y corresponden a importantes eventos de domesticación. Los efectos pleiotrópicos de Ma1 sobre el contenido de ácidos orgánicos y la relación azúcar: ácido sugieren su papel vital en la determinación del sabor de la fruta. Es poco probable que el sabor de la fruta se haya visto afectado negativamente por el arrastre de ligamiento asociado con la selección de frutas más grandes que resultó de la formación de pirámides de múltiples genes con efectos menores sobre el tamaño de la fruta. Nuestro estudio proporciona información sobre la base genética de la calidad de la fruta y su hoja de ruta evolutiva durante la domesticación de la manzana, y también señala genes diana para la manipulación genética del sabor de la fruta.


Resultados

Identificación de todo el genoma de CLE genes en pepino

La búsqueda de todo el genoma CLE genes en pepino se realizó mediante alineación. Primero descargamos las proteínas CLE conocidas de Arabidopsis para autoconstruir un modelo CLE Markov. Al escanear las 24.317 proteínas codificantes de pepino en la versión 3 del ensamblaje del genoma utilizando el modelo CLE Markov diseñado, identificamos 26 factores de transcripción CLE (Tabla S1). La verificación manual reveló factores de transcripción CLE bien conservados (referidos por el término "CsCLE" con un número de serie y ordenados por el valor E del dominio CLE Tabla 1). Muchos péptidos CLE de pepino son péptidos cortos (90 aminoácidos de longitud) excepto CsCLE24 (1021 aminoácidos), CsCLE5 (416 aminoácidos) y CsCLE6 (404 aminoácidos). El peso molecular de las proteínas CLE de pepino osciló entre 5293,84 (CsCLE9) y 113,323,11 (CsCLE24), que es muy similar a los de Arabidopsis. La mayoría de las proteínas CLE de pepino son alcalinas con un pI teórico que varía de 7,09 (CsCLE17) a 12,11 (CsCLE10), excepto por una proteína débilmente ácida, CsCLE24 (pI = 6,52). La proteína CsCLE4 es estable mientras que otras son inestables. El índice alifático de las proteínas CLE de pepino osciló entre 49,03 (CsCLE6) y 106,78 (CsCLE17), y el índice GRAVY osciló entre - 0,935 (CsCLE9) y 0,17 (CsCLE21).

El 26 CLE los genes permanecieron distribuidos en los cromosomas, incluidos 7 en chr5, 6 en chr6, 5 en cada chr1 y chr2, y uno en cada chr3, chr4 y chr7 (Fig. 1). los CLE genes CsCLE24 y CsCLE25 se ubicaron extremadamente cerca con una ubicación intergénica corta de 1 kb. Además, CsCLE13 y CsCLE14 también se ubicaron en las proximidades, este hallazgo indicó que estos genes podrían estar duplicados en tándem. Además, un par de genes, CsCLE5 y CsCLE6, con duplicación segmentaria se encontró dentro de la CsCLE familia, y los pares de genes de duplicación segmentaria identificados se distribuyeron en diferentes cromosomas en pepino (Fig. 2).

Distribución cromosómica de CLE genes en pepino. Los diferentes colores de línea representan diferentes cromosomas y las marcas en ellos son los genes correspondientes y sus ubicaciones.

Distribución de la duplicación segmentaria CLE genes CLE5 y CLE6 en el genoma del pepino. Dos genes del mismo par de genes duplicados segmentarios están marcados en rojo

Relaciones filogenéticas y divergencia de proteínas CLE de pepino

En el presente estudio, utilizamos principalmente el ensamblaje del genoma del chino largo "9930".

Sólo 31 CLE genes fueron identificados (Tabla S2) en este informe, mientras que un informe anterior mostró que Arabidopsis contenía 32 CLE genes [30]. Un total de 25 CLE Se identificaron genes en melón (Tabla S3) utilizando el enfoque computacional. Para comprender la evolución de CLE genes en Cucurbitaceae y la planta modelo Arabidopsis, comparamos los genes de Arabidopsis, melón y el cultivar de pepino chino largo "9930" (Fig. 3). Estas CLE se dividieron en función de su relación filogenética en siete grupos parafiléticos (Grupos 1 a 7). Todos los grupos, excepto el Grupo 2 y el Grupo 6, estaban compuestos por CLE tanto del pepino como de otras especies de plantas, lo que indica la estrecha relación entre el pepino CLE y los de otras plantas. La distribución del pepino CLE fue desigual en estos grupos. El grupo 7 fue el grupo más grande con 12 miembros, lo que representa casi la mitad del pepino. CLE, seguido de los Grupos 1 y 5 que contienen 6 y 5 pepinos CLE, respectivamente. Las subfamilias menos representadas fueron los Grupos 2 y 6 sin pepino CLEs.

Análisis filogenético de CLE genes de Arabidopsis, pepino y melón. El análisis involucró 26 secuencias de proteínas CLE de pepino, 31 Arabidopsis Secuencias de proteínas AtCLE y 25 secuencias de proteínas CLE de melón. Las estrellas rojas representan las proteínas CLE de pepino, los cuadrados azules representan la Arabidopsis Las proteínas CLE y los círculos verdes representan las proteínas CLE de melón

Estructura genética del pepino CLE genes

Para comparar los genes del pepino, se predijeron sus estructuras exón-intrón (Fig. 4). El árbol filogenético se construyó mediante el método de máxima verosimilitud utilizando la secuencia de proteína conservada del pepino. CLE genes. Catorce CLE los genes eran genes de un solo exón, diez eran genes de doble exón y uno era un gen de triple exón. Los patrones exón-intrón dentro del mismo grupo de clasificación filogenética mostraron similitud. Gen del pepino CLE24 fue único con sus regiones de codificación discretas divididas por 19 intrones.

Estructuras de exón-intrón predichas del pepino CLE y motivos conservados de proteína CLE de pepino. a El árbol filogenético se construyó basándose en las secuencias de proteínas de longitud completa de 26 proteínas CLE de pepino utilizando el software MEGA V6.06. B Motivos conservados en proteínas CLE de pepino. Los motivos, números del 1 al 10, se exhibieron en recuadros de diferentes colores. C Estructura exón-intrón del pepino CLE genes. Los exones y los intrones se indican mediante recuadros verdes y líneas simples, respectivamente.

Motivos de proteína CLE de pepino conservado

El software MEME se utilizó para explorar los dominios y motivos conservados de las proteínas CLE en pepino. Los motivos se enumeraron desde el motivo 1 al 10 de acuerdo con el valor E ascendente de la alineación (Fig. 4). Casi todas las proteínas CLE de pepino contenían el motivo 1, que representa un dominio CLE típico cerca del C-terminal, excepto CsCLE9. Las proteínas CsCLE5 y CsCLE6 eran diferentes en el C-terminal y ambas contenían el motivo 4 cerca del dominio CLE del C-terminal. La proteína CsCLE11 contenía cuatro motivos 6 localizados en tándem y un dominio CLE, mientras que CsCLE24 contenía dos motivos 2 en tándem. Estos resultados indicaron que la caracterización de la secuencia y la función biológica diferían ampliamente entre las proteínas CLE de pepino en cada rama del árbol filogenético. Estas proteínas también poseían otros dominios funcionales en el N-terminal o en el medio, mientras que su dominio CLE era funcional en las vías de señal.

Elementos reguladores cis aguas arriba (CRE)

En la base de datos PlantCARE, se utilizó la secuencia de 1500 pb en el promotor corriente arriba para localizar el elemento regulador cis en la región reguladora corriente arriba. Analizando las funciones biológicas de las CRE en la región aguas arriba de 26 pepino CLE genes, se puede concluir que la mayoría de los componentes distintos de los necesarios para la expresión normal de los promotores, como AT

TATA-Box y CAAT-Box, se pueden dividir en las siguientes cuatro categorías. 1) El primer tipo de elemento son los elementos de respuesta hormonal, como ABRE (elemento de respuesta ABA), el elemento TCA (elemento de respuesta de ácido salicílico), el TATC-Box (elemento de respuesta de giberelina) y el elemento TGA (respuesta de auxina). elemento), entre otros. Estos elementos fueron graficados en este experimento (Fig. 5). 2) El segundo tipo de elemento son los elementos sensibles a la luz, como ACE, G-box, motivo ATA, elemento LAMP, etc. 3). El tercer tipo de elemento son los elementos de expresión meristemática. Por ejemplo, HD-zip1 (elementos relacionados con la diferenciación celular del mesófilo) y el motivo TGACG (elementos relacionados con el desarrollo del meristemo) juegan un papel importante en la regulación del gen CLE del mantenimiento y organogénesis del meristemo vegetal. 4) El cuarto tipo son los elementos de respuesta al estrés, como ARE, MBS, repeticiones ricas en TC, LTR, etc., así como otros factores reguladores que juegan un papel en la regulación metabólica.

Elementos de respuesta hormonal aguas arriba del pepino CLE. Los elementos que responden a las hormonas se muestran en recuadros de diferentes colores.

Pares homólogos de proteínas CLE de pepino

Para comprender el descenso vertical de un solo gen ancestral y la duplicación, se realizó un análisis comparativo para identificar los pares de genes ortólogos, coortólogos y parálogos en Arabidopsis, pepino y melón.

El software OrthoMCL identificó 24 ortólogos, 23 coortólogos y 8 parálogos CLE pares de genes entre Arabidopsis, pepino y melón. Esta red de pares de genes homólogos era muy consistente con el árbol filogenético, que está claramente dividido en tres partes. Los genes ortólogos entre estas tres especies se muestran en la Fig. 6. De 26 pepinos CLE genes, 15 genes ortólogos en melón y 7 en Arabidopsis fueron encontrados.

Pares de genes homólogos en Arabidopsis, pepino y melón. Las líneas grises representan todos los pares homólogos entre diferentes genomas, y las líneas rojas representan los pares homólogos de la CLE familia de genes

Tiempo de selección y divergencia

Para investigar los mecanismos de selección de CLE genes durante la evolución, calculamos Ka, Ks y el tiempo de divergencia del par homólogo CsCLE24-CsCLE25 (Tabla S4). Este par tenía un Ka de 1.08 y un Ks de 0.82, y una relación Ka / Ks de 1.31 con un PAG-valor de 0,0098, lo que indica que este par de genes está experimentando una selección positiva que condujo a la diferenciación funcional.

Patrón de expresión de pepino CLE genes durante el desarrollo

Investigamos la expresión de cada CLE gen utilizando datos de secuencia de ARN publicados (Tabla S5) para 23 tejidos de pepino diferentes durante el desarrollo vegetativo y reproductivo. El nivel de expresión de cada gen se normalizó utilizando el método RPKM. Diez pepino CLE genes incluidos CsCLE1, 2, 4, 5, 14, 25, 24, 23, 15, y 17 mostraron niveles relativamente bajos de expresión en las 23 muestras, lo que demuestra que desempeñaron un papel insignificante en los procesos de desarrollo del pepino. Genes CsCLE9, 10, 18, y 22 mostró niveles relativamente altos de expresión en múltiples muestras (Fig. 7a).

Patrón de expresión de pepino CLE genes. a Mapa de calor que representa el perfil de expresión del pepino CLE genes durante diferentes etapas de desarrollo analizados por datos de RNA-seq. B Mapa de calor que representa el perfil de expresión del pepino CLE genes durante diferentes etapas de desarrollo validados por qPCR en chino largo '9930'

Utilizando qPCR, analizamos la expresión de pepino CLE genes (Tabla S6) en diferentes tejidos de plántulas chinas largas "9930". De 26 pepinos CLE genes, se detectaron 24 genes en 21 muestras. Genes CLE1, 2, 7, 8, 9, 17, 18, 19, y 26 se expresaron en niveles relativamente bajos en todas las muestras, y otros se expresaron en niveles relativamente altos en al menos una muestra. Pepino CLE los genes mostraron niveles de expresión relativamente altos en los tejidos en crecimiento, incluidos la punta, el tallo y la flor, y niveles de expresión relativamente bajos en la raíz. El nivel de expresión de CsCLE4, 6, 11, 14, 21, 23, 24, y 25 fue el más alto (Fig. 7b). Los resultados de qPCR son muy consistentes con los datos anteriores de RNA-seq disponibles en la base de datos pública.

Sobreexpresión heteróloga de CsCLV3 gen en Arabidopsis

El vector de expresión se construyó con éxito llevando el gen diana en el plásmido PHB, y luego CsCLV3 gen, el gen representativo de la CLE familia, fue sobreexpresado en Arabidopsis nos referimos a estas plantas transformadas como cepa positiva. Los resultados mostraron que en el fenotipo de cepa positiva se desarrolló debilidad en el punto de crecimiento. En comparación con el tipo salvaje, el diámetro del punto de crecimiento del tipo salvaje Arabidopsis era de aproximadamente 0,66 mm (Fig.8a), y la de CsCLV3 La cepa positiva de sobreexpresión genética fue de aproximadamente 0,54 mm (Fig. 8b). En las mismas condiciones, el punto de crecimiento de la cepa positiva fue menor que el del tipo salvaje.

El punto de crecimiento de la sobreexpresión heteróloga de CsCLV3 gen en Arabidopsis. a Punto de crecimiento de tipo salvaje. a El diámetro del punto de crecimiento para el tipo salvaje es de 0,6584168 mm. B Punto de crecimiento de cepa positiva. B El diámetro del punto de crecimiento para la tensión positiva es de 0,5429444 mm. El diámetro del punto de crecimiento se midió con el software IPwin 32

Después del trasplante, casi todas las plantas transformadas en la generación T1 mostraron el fenómeno de obvia debilidad del desarrollo del punto de crecimiento, ausencia de bulbos y disminución de la capacidad de crecimiento de la planta (Fig. 9). Las semillas hereditarias obtenidas de plantas T1 fueron extremadamente pocas, lo que hizo inviable el análisis funcional en generaciones posteriores. Además, pocas de las cepas positivas completaron los procesos de crecimiento y desarrollo. En este estudio, solo dos cepas atornilladas mostraron que la vaina no se desarrolló o la vaina era corta, y su desarrollo fue significativamente inferior al del tipo salvaje (Fig. 10a). Se seleccionaron al azar diez transformantes para la detección por PCR cuantitativa de fluorescencia (Fig. 10b). Los resultados (Tabla S7) mostraron que los genes diana se expresaron en todos los materiales transgénicos, y el fenotipo N ° 15 y N ° 8 con menor expresión fue el más débil, que pudo dar frutos pero no una gran capacidad de fructificación. Al mismo tiempo, los números 1, 12 y 13, que tenían altos niveles de expresión, tenían fenotipos capaces y un alto grado de anomalía, y no podían brotar ni fructificar. En términos generales, el nivel de expresión de CsCLV3 gen es consistente con su fenotipo. Los resultados experimentales demostraron que el pepino CLV3 los genes funcionan de una manera esencial para controlar el desarrollo de los puntos de crecimiento y los frutos, y el crecimiento de las plantas.

Sobreexpresión heteróloga de CsCLV3 gen en Arabidopsis. La cepa de tipo salvaje (WT) tiene un ciclo de crecimiento y desarrollo normal, y una estructura fenotípica de hojas en roseta, tallos, hojas, vainas, etc. La cepa positiva (4910-13) fue el fenómeno de sobreexpresión heteróloga de CsCLV3 gen, y no tiene tallo, hoja, vaina del fruto u otras estructuras morfológicas, mostrando solo hojas arrugadas en roseta

Vainas de menor expresión en cepas positivas. a Los fenotipos de vaina de tipo salvaje (col-0) y tinción positiva (4910-15) podían brotar pero no dar fruto, mientras que 4910-8 podían brotar y dar fruto pero los entrenudos eran más cortos que en WT. Fenotipos de vaina de Arabidopsis se observaron bajo un microscopio Nikon D3300. Las bandas que se muestran en la figura son la expresión génica correspondiente a los fenotipos. B Se seleccionaron al azar diez transformantes para la detección de PCR cuantitativa de fluorescencia


¿Cuál es la diferencia entre el ADN vegetal y el ADN animal?

En el centro de cada célula vegetal, desde las algas hasta las orquídeas & # 8211 y en el centro de cada célula animal, desde las medusas hasta usted y yo & # 8211 hay una copia del material genético del organismo. Este ADN lleva un plano completo del organismo. Es lo que transfiere características de una generación a la siguiente.

Hay diferencias bastante obvias entre plantas y animales, pero & # 8211 a nivel químico & # 8211 las células de todas las plantas y todos los animales contienen ADN en la misma forma & # 8211 la famosa & # 8220 doble hélice & # 8221 que parece un escalera torcida. Además, todas las moléculas de ADN, tanto en plantas como en animales, están hechas de los mismos cuatro bloques de construcción químicos, llamados nucleótidos.

Lo que es diferente es cómo se organizan estos cuatro nucleótidos en el ADN. Es su secuencia la que determina qué proteínas se fabricarán. La forma en que se organizan los nucleótidos y la información que codifican decide si el organismo producirá escamas u hojas & # 8211 patas o un tallo.

Las investigaciones muestran que las plantas y los animales pueden producir algunas proteínas en común. Un ejemplo destacado se conoce como citocromo C. Pero debido a que el proceso de copia del ADN es imperfecto, los errores se acumulan con el tiempo, lo que hace que el citocromo C sea ligeramente diferente en diferentes criaturas. Las regiones de genes que especifican la secuencia de aminoácidos en el citocromo C humano son más similares a las de otro mamífero como un conejo, y menos similares a una criatura evolutivamente más distante, como un girasol.

El esquema de clasificación de animales y plantas en reinos se enfrenta a la competencia. Más recientemente ha surgido un sistema alternativo, basado en información evolutiva y molecular. El citocromo c es quizás la molécula canónica o paradigmática en este enfoque.

Cada especie tiene un número característico de cromosomas, llamado número de cromosomas. Los animales tienen más cromosomas, las plantas tienen menos.


Usando similitudes en el ADN para clasificar organismos

Sin embargo, gracias a la tecnología moderna, el análisis de las relaciones genéticas entre especies y organismos ahora es posible y ha llevado a considerar las relaciones entre formas de vida de manera diferente. En 1990, Carl Woese propuso el & ldquoThree Domains System & rdquo de clasificación basada en similitudes genéticas entre organismos. El sistema muestra un ancestro común de toda la vida dividido en tres amplios dominios: mdashBacteria, Archaea y Eukaryotes (los organismos con un núcleo para almacenar su ADN).

Al examinar los genes de diferentes especies, tanto animales como hongos, se pueden observar cambios mutacionales y se pueden determinar relaciones genealógicas que se remontan a millones de años.

Resulta que los animales y los hongos comparten un ancestro común y se separaron de las plantas hace unos 1.100 millones de años. Solamente más tarde ¿Se separaron los animales y los hongos en el árbol genealógico de la vida, haciendo que los hongos estén más estrechamente relacionados con los humanos que con las plantas? Lo más probable es que este ancestro común fuera un organismo unicelular que exhibía características similares a los espermatozoides (como un animal) y luego una etapa de desarrollo posterior con una pared celular más fuerte (hongos).

Un árbol filogenético basado en el análisis de ARNr. En el lado derecho, observe la divergencia de plantas, hongos y animales. (Crédito de la foto: Sting & ndash fr: Sting / Wikimedia Commons)

¿Los hongos son vegetales?

Respuesta simple? No, un hongo no es un vegetal. Los hongos son cuerpos fructíferos de hongos filamentosos macroscópicos. Cuando surgió la micología (el estudio de los hongos), fue parte de la botánica porque los hongos se consideraban plantas primitivas.

La principal diferencia entre una planta (vegetal) y un hongo es cómo adquieren su alimento. Las plantas poseen clorofila y producen su alimento a través de la fotosíntesis. Los hongos existen en material en descomposición en la naturaleza. Además, existen diferencias estructurales obvias, como la falta de hojas, raíces y semillas. Por lo tanto, los hongos ahora tienen su propio reino basado en la organización celular.

Sin embargo, este es el lado científico de las cosas, pero ¡echemos un vistazo al otro lado de la comida! En la vida cotidiana, no usamos la ciencia para clasificar nuestra comida. Los tomates y los pepinos son científicamente los frutos de una planta, pero todavía los llamamos vegetales. Del mismo modo, los hongos no son verduras ni frutas, ni siquiera carne. Son en sí mismos una categoría diferente, pero por conveniencia, los juntamos con verduras.

Los diferentes tipos de hongos tienen varios beneficios para la salud. En un momento de la historia, los hongos fueron tan apreciados que en realidad estaba prohibido que la gente común los comiera. Estaban reservados solo para familias reales.


Contenido de ADN en semillas de plantas frente a pulpa de frutas - Biología

¿Cuánto ADN comparten las plantas con los humanos? ¿Más del 99%?

Este es un número con el que debemos tener cuidado.

Primero, ¡solo hay un tipo de ADN! TODOS los animales y plantas comparten el mismo ADN, que es básicamente un código de solo 4 'letras' que codifican los mismos aminoácidos a partir de los cuales están hechas todas las proteínas. Existe la complicación de que algunos aminoácidos tienen más de un código que lo especifica; hay muchos ejemplos en los que un cambio de códigos (por ejemplo, una mutación) puede resultar en NO CAMBIO en el aminoácido especificado.

No es sorprendente que todos los animales y plantas tengan en común la mayoría de sus GENES. El mecanismo por el cual los azúcares se oxidan para liberar su energía (respiración) es casi universal. Hay docenas de enzimas involucradas solo en este proceso. Cada enzima es una proteína y cada una debe codificarse en el ADN. Hay muchas enzimas involucradas en la replicación del ADN en sí. Otros procesos también son casi universales.

Por otro lado, algunos genes son muy importantes. Creo que hay un solo gen responsable de poner a un embrión humano en el camino hacia la masculinidad en lugar de la feminidad. Sin embargo, este gen actúa como un interruptor y dirige a otros genes para que produzcan una gran variedad de diferencias entre hombres y mujeres.

Algunos genes están presentes, pero nunca se utilizan (nunca se activan). Parece haber una gran cantidad de ADN que hemos heredado de nuestro pasado y puede que ya no sea útil, pero no ha sido "eliminado". Algunos genes son interrumpidos por largos tramos de ADN "silencioso" para el que no conocemos una función. Es posible que hayamos mapeado el genoma completo de unos pocos organismos (humanos, Aarabidopsis, etc.), pero esto es poco más que una "hoja de ruta" y todavía tenemos que identificar las "casas" y, más significativamente, los "habitantes" de esas casas.

Sabrá que las huellas dactilares de ADN pueden identificar a un individuo de otro. Claramente, hay tramos de ADN que ni siquiera compartimos con nuestros parientes (excepto los gemelos idénticos): cuanto más estrecha es la relación, más 'bandas' en nuestra huella dactilar compartimos. Mis hijos solo comparten la mitad de mi huella digital de ADN.

Se dice que compartimos alrededor del 60% de nuestros genes con un plátano. Pero puede ver que tal afirmación puede ser muy engañosa.

Se han realizado algunos estudios interesantes de proteínas que comparten TODOS los organismos. Uno de ellos es el citocromo C, que participa en parte de la respiración. Se ha estudiado ampliamente el número de diferentes aminoácidos / mutaciones entre el hombre y otros organismos. Información como esta puede dar una diferencia numérica entre el hombre y otras especies (incluidas las plantas). Sin embargo, estas diferencias no están en la parte de la molécula que importa: la parte de la molécula que permite que el citocromo C lleve a cabo su función. Dichos datos son útiles para que los estudios digan cuán estrechamente están relacionados los organismos (y de hecho nos dicen acerca de las relaciones dentro de ese árbol), pero no nos dicen cuán "diferentes" somos, ¡porque el Citocromo C funciona de la MISMA en TODOS los organismos!


¿Cómo surgen los frutos sin semillas y cómo se propagan?

El desarrollo de la fruta normalmente comienza cuando uno o más óvulos en el compartimento ovular de la flor son fertilizados por núcleos de esperma del polen. En algunas plantas, sin embargo, la fruta se desarrolla sin fertilización, un fenómeno conocido como partenocarpia. La fruta partenocárpica tiene ventajas sobre la fruta sin semillas: mayor vida útil y mayor atractivo para el consumidor.

Las razones más frecuentes de la falta de desarrollo de las semillas son la falta de polinización o los óvulos o espermatozoides no funcionales. En muchas plantas, los genes de autoincompatibilidad limitan la fertilización exitosa a la polinización cruzada entre padres masculinos y femeninos genéticamente diferentes. Esta propiedad es explotada por productores de cítricos que cultivan frutas sin semillas, como naranjas navel y clementinas. Debido a que estos cultivares son autoincompatibles, no producen semillas cuando se plantan en huertos de plantas idénticas (clones). Sin embargo, estas plantas tienen una alta frecuencia de partenocarpia, por lo que todavía producen frutos. Dichos árboles no requieren semillas para su propagación. De hecho, la propagación por semilla sería desventajosa porque la progenie sería diferente del padre. En cambio, los viveristas suelen propagar los árboles frutales asexualmente, generalmente mediante injertos.

Otra razón frecuente de la falta de fertilización exitosa es el desequilibrio cromosómico. Por ejemplo, el plátano común es triploide. En otras palabras, tiene tres juegos de cromosomas. En lugar de tener un juego de cromosomas de cada padre, tiene dos juegos de un padre y un juego del otro padre. Los triploides rara vez producen óvulos o espermatozoides que tengan un conjunto equilibrado de cromosomas, por lo que el conjunto de semillas exitoso es muy raro. Los plátanos también son partenocárpicos y producen frutos en ausencia de una fertilización exitosa. Estos plátanos se propagan asexualmente. Una vez que el tallo ha florecido y dado fruto, muere. Pero hay brotes laterales o chupones en la base del tallo principal, que se pueden quitar y volver a plantar para continuar con el cultivo. Los productores también propagan los plátanos mediante cultivo de tejidos.

Las sandías sin semillas son particularmente interesantes porque deben propagarse por semilla y, sin embargo, los productores aún pueden explotar la partenocarpia. Una forma de hacer sandías sin semillas es producir semillas triploides. Como en el caso de los plátanos, las sandías triploides no pueden producir semillas funcionales, pero aún desarrollan buenos frutos a través de la partenocarpia. Los fitomejoradores producen semillas triploides cruzando un progenitor diploide normal con un progenitor tetraploide, que a su vez se fabrica mediante la manipulación genética de diploides para duplicar su número de cromosomas. En el caso de las sandías, esta manipulación se tiene que realizar cada generación, por lo que es una propuesta algo cara pero que aún así vale la pena.

Los biólogos vegetales han aprendido que si la hormona vegetal auxina se produce temprano en el desarrollo del óvulo, la fruta partenocárpica puede crecer en plantas que generalmente no exhiben esta propiedad. Por lo tanto, la ingeniería genética probablemente dará a los consumidores frutos partenocárpicos en muchas otras especies en un futuro próximo.


Discusión

P. trifoliata es una especie china de hoja caduca con hojas trifolioladas que se ha utilizado como patrón para cultivares de cítricos durante mucho tiempo. Es resistente a Phytophthora, nematodos y tristeza virus y puede soportar una temperatura fría de -26 ° C 50,51. Los pueblos antiguos observaron que la unión de injerto de mandarina y P. trifoliata cultivada en el sur de China fue mandarina, mientras que en el norte de China, la unión de injerto cultivada fue naranja trifoliada. Esto ahora es fácil de explicar, ya que solo la naranja trifoliada de portainjerto es muy resistente a las bajas temperaturas y puede sobrevivir en el invierno en el norte de China, mientras que el vástago de mandarina con buena calidad de fruto es vulnerable a las bajas temperaturas. P. trifoliata también es sexualmente compatible con el Agrios género, y el híbrido sexual más cultivado es Troyer citrange, que también es un portainjerto de cítricos muy importante en muchos países 23. En este estudio, secuenciamos y ensamblamos un genoma de alta calidad de una variedad local de P. trifoliata de la provincia de Shanxi sobre la base de la evaluación genética de un conjunto de 169 accesiones. Por tanto, este genotipo representa un tipo original de P. trifoliata Además, en relación con los estrechos antecedentes genéticos de los Estados Unidos, este genoma es más completo que el genoma 52 recientemente publicado (Tabla complementaria 6). Ambos genomas proporcionan un valioso recurso genómico para la genética de portainjertos de cítricos y la mejora de la reproducción. Este genoma junto con los genomas de las plantas de cítricos cultivadas (como vástagos) debería facilitar una comprensión profunda de las interacciones vástago-patrón a nivel genómico. Además, la información genómica también puede ser valiosa para una mayor investigación de la base de los usos médicos y algunos otros rasgos biológicos únicos de la naranja trifoliada, como la resistencia al frío, el carácter de las hojas trifoliadas y la resistencia al virus de la tristeza de los cítricos.

El injerto se ha utilizado ampliamente para mejorar el rendimiento de las plantas hortícolas durante miles de años. Aunque la evidencia fisiológica creciente indica la existencia de interacciones patrón-vástago en plantas 53, la evidencia molecular a nivel genético y epigenético que revela la influencia de las interacciones patrón-vástago es escasa. Recientemente, el descubrimiento de elementos genéticos móviles como el ADN, el ARN y las proteínas ha revelado gradualmente los mecanismos moleculares subyacentes a varios rasgos agronómicos afectados por las interacciones patrón-vástago 16. Por ejemplo, el microRNA399 se identificó como una señal de larga distancia para la regulación de la homeostasis del fosfato vegetal en la colza y la calabaza 54. Epigenetic modification may also play important roles in creating heritable phenotypic variation by grafting. In this study, we found that the DNA methylation level in the scion grafted on P. trifoliata decreased by

3% (Fig. 5). A previous study reported that DNA methylation levels in grafted cucumber and melon were significantly increased when pumpkin was used as rootstock, while there was no significant change in grafted watermelon 19 . Grafting between plant species of Solanaceae caused extensive DNA methylation variation, and some variation could be stably passed on to offspring 18 . Thus, we can conclude that grafting does cause variations in DNA methylation, but the degree and trend of DNA methylation variation may vary based on species and graft combinations. The effect of grafting on DNA methylation may be a regulatory mechanism for intercell interactions between scions and rootstocks 21 .

Our observation that the DNA demethylation pattern in the scions of heterografted plants is concomitant with reduced abundance of 24-nt sRNAs implies a possible mechanism of graft-induced alteration in DNA methylation. sRNA-mediated graft-transmissible epigenetic modifications have been confirmed in Arabidopsis thaliana by grafting experiments. Molnar et al. demonstrated that the movement of transgene-derived and endogenous sRNAs from shoot to root across graft unions can cause epigenetic changes in rootstock cells 55 . A subsequent study showed that mobile sRNAs originating in the shoots guided RdDM at thousands of loci in the roots 56 . Our finding that the sRNAs are associated with the methylation levels of the sRNA-overlapping regions suggests that the DNA demethylation in the scion of heterografted plants may be attributed to the reduction in sRNAs leading to reduced RdDM. As the genotypes of both the rootstock and scion in autografted plants are the same, it is difficult to determine whether the highly expressed sRNAs in the scions of autografted plants are from the rootstock. However, the higher expression of the sRNAs in the roots of sweet orange than in those of Poncirus, combined with the downregulation of the highly expressed sRNAs in the scions of autografted plants after griding treatment, suggested the possibility that the reduction in the rootstock-to-scion movement of sRNAs leads to decreased sRNA abundance in the scions of heterografted plants. Based on the above finding, the DNA demethylation in the scion of SWO/Pt was possibly caused by the reduced graft-transmissible epigenetic modifications mediated by rootstock-to-scion movement of sRNAs.

The high-quality citrus rootstock genome provides an important basis for future studies on rootstock genetic improvement, and our multiomic analysis of P. trifoliata may promote a deeper understanding of graft biology, not only in citrus plants but also in other horticultural crops. Given the important biological roles played by DNA methylation in plants, it is reasonable to suspect that graft-transmissible epigenetic modifications may have functional consequences. In the future, the use of transgenic plants as rootstocks for grafting will further enhance the opportunity to improve practical nontransgenic cultivars in the field.


METHODS

Plant Materials and Phenotypic Evaluation

Diploid Fragaria vesca Germplasm

An F2 mapping population of 145 lines between the everbearing, non-runnering Fragaria vesca cv Reine des Vallées (ESP138.660 RV660) and the WF F. vesca ESP138.596 (WV596) was developed from one F1 plant (F1-14) that was able to produce runners and had RFs. The population was grown in a greenhouse in Málaga, Spain and phenotyped for two years. The two traits, runnering and red/white fruits, were found to segregate independently as two single mutations. The remaining F. vesca accessions were grown under the same conditions and are described in Supplemental Data Set 3 and include cv South Queensferry, GER1, and GER2 from the Günter Staudt collection (Dresden, Germany) and UK13, SE100, and FIN12 from the T. Hytönen and D. Posé collection.

Octoploid Fragaria Germplasm

The University of Florida breeding population 17.66 was derived from a cross between FL 13.65-160 (red) and FL 14.29-1 (white) selections ( Supplemental Figure 4 Supplemental Data Sets 3 and 8 ). The population (102 individuals) was grown under open field conditions with two plants per plot. Fruit skin color was assayed three times from December 2018 to February 2019 at the UF/IFAS Gulf Coast Research and Education Center (Balm, Florida).

To generate the SS×FcL F2 population of 105 progenies, a cross between Fragaria ×ananassa cv Senga Sengana and F. chiloensis ssp. lucida USA2 was performed at Hansabred, Germany in 2008 ( Supplemental Figure 5 ). An F1 seedling, cloned under the number P-90999, was selected among the progeny based on key breeding traits such as tolerance to two spotted spider mite (Tetranychus urticae Koch), yield, and fruit aroma and color. The selected F1 individual was self-pollinated to obtain the F2 mapping population. The population was grown under field conditions at Hansabred and scored for fruit skin, flesh, and core color in three seasons (2014, 2016, and 2019). Skin color was evaluated using a five-score scale from completely white to dark red. Flesh and core color was evaluated using a three-score scale: 1, white 2, light red and 3, red ( Supplemental Figure 10 ). The parental line F. chiloensis ssp. lucida USA2 is a male individual that does not set fruit, and therefore USA1, a sister female plant collected from the same area, was included in phenotypic and molecular analyses, as were other F. chiloensis accessions from diverse origins ( Supplemental Data Set 3 ).

DNA Extraction and QTL-Seq Analysis of Diploid Fragaria vesca

DNA was extracted from young leaves of parental plants, F1 plants, and each F2 line using the CTAB method ( Doyle and Doyle, 1990) with minor modifications. For rapid mapping of the fruit color mutation, we performed whole-genome resequencing of DNA from two bulked populations as previously described by Takagi et al. (2013). The RF and WF pools were produced by mixing equal amounts of DNA from 34 RF and 32 WF F2 lines, respectively.

Pair-end sequencing libraries with insert sizes of ∼350 bp were prepared, and 100-bp sequences were produced with 50× genome coverage using an Illumina HiSeq 2000. The reads from the RF and WF pools were mapped independently against the latest version of the Fragaria vesca reference genome, F_vesca_H4_V4.1 ( Edger et al., 2018). The low-quality reads (<Q20 Phred scale) were filtered using the samtools method ( Li et al., 2009). Duplicates that originated from PCR were eliminated using the picard-tools program.

For the single nucleotide variants and small INDELs calling process, the gatk algorithm ( McKenna et al., 2010) was applied. The large INDELs were identified using the Manta algorithm ( Chen et al., 2016). The variants with coverage less than 20 reads in both samples were not considered in downstream analyses.

SNP frequencies in each pool were calculated as the proportion of reads harboring the SNP different from the reference genome. Thus, SNP frequency = 0 if all short reads match the reference sequence and 1 if they correspond to the alternative allele. SNP positions with read depth <7 and frequencies <0.3 in both pools were excluded, as they may represent spurious SNPs called due to sequencing or alignment errors. The parameter ΔSNP-index was calculated as the absolute difference between SNP frequencies in the RF and WF pool samples. To detect significant genomic regions, the genome was split into 3-Mb sliding windows with 10-kb increments. For each window, the average ΔSNP-index was calculated and used for the sliding window plot. To identify statistically significant regions, a Wilcoxon test was applied using a confidence PAG-value of 0.03.

Whole Genome Resequencing of FIN12 and Data Analysis

Whole genome resequencing of the FIN12 accession was performed at DNA Sequencing and Genomics Laboratory, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, Finland using an Illumina NextSeq 500 sequencer. Library preparation, pair-end sequencing (150 + 150 bp), and the alignment of the sequencing reads on the F. vesca H4 reference genome v4.1 ( Edger et al., 2018) were performed as described by Koskela et al. (2017).

GWAS Analysis of F. × ananassa Breeding Germplasm

A total of 95 individuals from UF family 17.66 were used for GWAS. Total genomic DNA was isolated from leaf tissues using a modified CTAB method described by Noh et al. (2018). Whole-genome SNP Genotyping was performed using the FanaSNP 50K Array ( Hardigan et al., 2020). A GLM, mixed linear model (MLM), and MLMM were used for association tests using GAPIT v2 performed in R ( Team, 2014 Liu et al., 2016 Tang et al., 2016). Manhattan plots were created using the R package qqman version 0.1.4 ( Turner, 2014).

Linkage Mapping and Detection of QTL in Octoploid Fragaria

DNA was extracted from young leaves of parental plants, F1 plants, and the 105 F2 lines using the same CTAB method described for diploid Fragaria. A total of 16,070 SNP markers were produced using the strawberry DArTseq platform ( Sánchez-Sevilla et al., 2015). SNP markers that were monomorphic in the progeny were removed, and markers that did not fit the expected 3:1 segregation ratio using the χ 2 test (P = 0.05). Next, markers with rowSums <400 were also removed. Finally, markers with more than 5% missing scores (more than five progeny lines) were excluded, resulting in a total of 9005 dominantly scored SNP markers. For 5856 markers, the reference and the alternative allele segregated at a 1:2:1 ratio (as expected for a F2 population) and were transformed into 2523 codominant markers (COD-SNPs). The 2523 COD-SNPs were used together with 2446 dominant SNPs (DOM-SNPs) for mapping using JoinMap 4.1 ( van Ooijen, 2006). First, JoinMap software was used (coding the markers as a CP population) to infer the phases of markers heterozygous in both parental lines and thus of unknown origin in the F1 line. Phase information was then used to assign phases and to code the SNP markers as a F2 población. Grouping was performed using independence LOD and the default settings in JoinMap 4.1, and LGs were chosen at a LOD of 9 for all 28 groups obtained. Map construction was performed using the maximum likelihood mapping algorithm and the following parameters: chain length 5,000, initial acceptance probability 0.250, cooling control parameter 0.001, stop after 30,000 chains without improvement, length of burn-in chain 10,000, number of Monte Carlo EM cycles 4, chain length per Monte Carlo EM cycle 2,000, and sampling period for recombination frequency matrix samples 5. A total of 422 identical loci and 517 loci with similarity > 0.99 were removed. The seven HGs were named HG 1 to 7 based on the corresponding LGs in the diploid Fragaria reference map. BLAST analysis was performed using the SNP marker sequences as queries against the recently published Camarosa genome and assigned to the best matching chromosome. LGs within homoeologous groups were then named 1 to 4 according to the corresponding Camarosa chromosome number ( Edger et al., 2019).

QTL analyses were performed using MapQTL 6 ( van Ooijen, 2009). The raw relative data were first analyzed using a nonparametric Kruskal-Wallis rank-sum test. A stringent significance level of P ≤ 0.005 was used as a threshold to identify markers linked to QTLs. Second, transformed data sets for nonnormally distributed traits were used to identify and locate mQTLs using Interval Mapping with a step size of 1 cM and a maximum of five neighboring markers. Significance LOD thresholds were estimated with a 1,000-permutation test for each trait. The most significant markers were then used as cofactors for restricted multiple QTL mapping analysis. mQTLs with LOD scores greater than the genome-wide threshold at P ≤ 0.05 were declared significant. Linkage maps and QTLs were drawn using MapChart 2.2 ( Voorrips, 2002).

RNA Extraction and RT-quantitative PCR

Total RNA was extracted from three independent pools (20 to 25 ripe fruits each) of each WF and RF phenotype. Fruits for these biological triplicates were collected from the same F2 lines of the ‘RV660’ × ‘WV596’ population used for QTL-seq. We followed a CTAB method described by Gambino et al. (2008), with minor modifications. Briefly, 300 mg of powdered fruit sample was used as starting material and RNA was resuspended in 30 μL sterile water. Following digestion with a TURBO DNA-free Kit (Thermo Fisher Scientific AM1907), cDNA was synthesized from 1 μg of RNA using a High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific 4,368,814). RT-qPCR analysis was performed with iQ SYBR Green Supermix in an iCycler iQ5 system (Bio-Rad) following the manufacturer's instructions. Three technical replicates (within each experiment) were performed for each biological replicate. The relative expression level of a gene of interest in each sample was calculated as E -ΔCq and normalized by the E -ΔCq value for GADPH as the internal reference gene. The sequences of primers used in this study are listed in Supplemental Data Set 11 .

Semi-polar Metabolite Analysis Using UPLC-Orbitrap-MS/MS

To investigate the effect of FvMYB10 mutation, three independent pools of 20 to 25 ripe fruits from each phenotype (RF and WF) were analyzed. Fruits were collected from the same F2 lines used for QTL-seq and RT-qPCR. Fruit tissue from each pool was ground in liquid nitrogen and stored at −80°C. Secondary metabolite profiles of RF and WF pools were obtained as described by Vallarino et al. (2018) using a Waters Acquity UPLC system. Full documentation of metabolite profiling data acquisition and interpretation is provided in Supplemental Data Set 2 .

Quantification of Fruit Quality Parameters

To determine SSC, TA, Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC), and ascorbic acid levels, frozen fruit powder from the same samples (in biological triplicate) used for expression and metabolomic studies were used. For SSC, ∼0.5 g of sample was defrosted to room temperature and the puree deposited onto the lens of a refractometer (Atago PR32, Japan). Titratable acidity was evaluated with an automatic titrator (Titroline easy, Schott North America) as previously described by Zorrilla-Fontanesi et al. (2011). Polyphenols were extracted in 80% (v/v) methanol, and the antioxidant capacity of fruit samples was measured based on the ability of antioxidant molecules to quench the ABTS •+ radical cation [2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) Sigma–Aldrich] compared with the antioxidant activity of standard amounts of Trolox. TEAC assays were performed as described ( Pellegrini et al., 1999 Re et al., 1999) using 2 μL of sample and 250 μL of radical reagent. The absorbance at 734 nm was measured after 5 min at 25°C in a spectrophotometer. Results were expressed as μmoles of Trolox equivalents per gram of fresh weight (μmol TE/g FW).

L-Ascorbic acid (L-AA) was measured by HPLC ( Davey et al., 2006 Zorrilla-Fontanesi et al., 2011). In brief, 0.25 g of fruit powder was homogenized in 1 mL cold extraction buffer (metaphosphoric acid 2% [w/v], EDTA 2 mM) and incubated at 0°C for 20 min. The samples were centrifuged at 14,000 rpm for 20 min at 4°C, and the supernatant was filtered (0.45-mm membrane) and transferred to HPLC vials kept on ice. Finally, a 5-mL sample was injected in a Rx-C18 reverse-phase HPLC column (4.6 × 100 mm, 3.5 mM, Agilent Technologies) and detection was performed at 254 nm in a photodiode array detector (G1315D, Agilent Technologies). The mobile phase consisted of a filtered and degassed solution of 0.1 M NaH2correos4, 0.2 mM EDTA pH 3.1 ( Harapanhalli et al., 1993), and the flow rate was 0.7 mL/ min. L-AA content was calculated by comparison with values obtained from a standard curve and were expressed as mg L-AA per 100 g of fresh weight.

Amplicon Sequence Analysis

Amplicon sequencing was performed using cDNA from WF and RF accessions from UF family 17.66. The fruits from each white-skinned and red-skinned accession were collected in the field, and 2-mm-thick fruit skin samples were collected for RNA extraction using a surgical blade. Total RNA was extracted from each sample with a RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany), and cDNA synthesis was performed using LunaScript RT SuperMix Kit (New England Biolabs, USA) following the manufacturer's instructions. For amplicon sequencing, primer sets were developed for the coding region of MYB10 (cv Camarosa, maker-Fvb1-2-snap-gene-157.15-mRNA-1) using IDT's PrimerQuest Software ( Supplemental Data Set 11 ). The PCR products were checked in 3% (w/v) agarose gels and further purified for amplicon sequencing at GENEWIZ (South Plainfield, NJ). The sequencing reads from each WF and RF pool (10 samples per pool) were mapped to the MYB10 gene (maker-Fvb1-2-snap-gene-157.15-mRNA-1) with Geneious v.11.0.5 using default values. The consensus sequences of the MYB10 coding region of white and red strawberry pools were aligned using T-coffee ( Notredame et al., 2000).

Gene and Promoter Cloning and Sequence Homology Analysis

Gene and promoter amplification were performed using MyFi™ DNA Polymerase (Bioline). FvMYB10-gypsy and Fvb1 FIN12 genomic fragments flanking the deleted region were amplified with the 5Prime PCR Extender System (5Prime) using the provided 10× Tuning Buffer following the manufacturer instructions.

PCR products <8 kb were purified with a FavorPrep GEL/PCR Purification Kit (Favorgen). PCR products >8 kb were precipitated (30% [w/v] PEG8000 30mN MgCl2). Purified products were cloned into the pGEM-T Easy Vector Systems (Promega) for Sanger sequencing.

Alineación de secuencia múltiple de MYB10 promoter fragments was performed using the Geneious algorithm (Gap open penalty = 30 Gap extension penalty = 0 50 refinement iterations) and used for homology tree construction (Genetic distance model: Jukes-Cantor Tree build method: Neighbor-Joining Resampling method: Bootstrap 1000 replicates), both in Geneious 7.1.9 ( Kearse et al., 2012). F. vesca MYB10 Pro sequence was chosen as outgroup as it belongs to a different species. Promoter sequence alignment and machine-readable tree files are provided as Supplemental Data Sets 12 and 13 .

RNA-Seq Analysis, Differential Gene Expression, and Variant Calling

Total RNA was extracted from two biological replicates of ripe fruits from the seven selected octoploid accessions as described above. Each replicate consisted of a pool of 3 to 5 fruits collected throughout different days at the same time of day (Zeitgeber Time 7). The fruits were immediately frozen in liquid N2 and stored at −80°C until processing. RNA quantity, quality, and integrity were determined based on absorbance ratios at 260 nm/280 and 260 nm/230 nm using a NanoDrop spectrophotometer (ND-1000 V3.5, NanoDrop Technologies, Inc.) and agarose gel electrophoresis and further verified using a 2100 Bioanalyzer (Agilent, Folsom, CA). Sample RIN values ranged from 7.4 to 8.4. Libraries were produced following Illumina´s recommendations at Sistemas Genómicos facilities, where they were sequenced by pair-end sequencing (100 bp × 2) in an Illumina HiSeq 2500 sequencer. Over 200.4 million reads were generated and filtered for high-quality reads by removing reads containing adapters, reads shorter than 50 bp, and reads with Q-value ≤30 using Fastq-mcf from ea-utils ( Aronesty, 2011) with the parameters -q 30 -l 50. The following analyses were performed on processed clean reads.

Read mapping, differential gene expression analysis, and clustering of reads from the seven selected octoploid accessions and the previously described cv Camarosa’ tissues ( Sánchez-Sevilla et al., 2017) were performed using the Tuxedo suit (Hisat2/Cufflinks/CummRbund) following standard procedures ( Trapnell et al., 2012). For the reference genome ( Edger et al., 2019), we used the latest assembled F. ×ananassa genome (Camarosa Genome Assembly v1.0.a1: F_ana_Camarosa_6-28-17.fasta) and annotation (Fxa_v1.2_makerStandard_MakerGenes_woTposases.gff) downloaded from the Genome Database for Rosaceae website (https://www.rosaceae.org/). The overall alignment rate was 90.72%.

Variant calling was performed using the haplotype-based variant detector FreeBayes v1.0.2-16-gd466dde-dirty ( Garrison and Marth, 2012). To identify the different variants at each position in the reference F. ×ananassa genome, alignment BAM files of the different accessions were labeled with samtools. A VCF file was generated with FreeBayes with all parameters set to default. All bioinformatic processes were performed at the Picasso cluster facilities at Servicio de Supercomputación y Bioinformática Málaga (http://scbi.uma.es).

Transient Overexpression by Agro-infiltration of Fruit

Transient expression studies in strawberry fruits were performed as described ( Hoffmann et al., 2006) with minor modifications. Full-length wild-type FvMYB10 and the truncated fvmyb10-2 cDNAs were amplified from total cDNA from ripe fruits of the F2 RV660 × WV596 population RF or WF pools, respectively. Primers FvMYB10-attB1 F and FvMYB10-attB2 R were used to amplify wild-type FvMYB10, and FvMYB10-attB1 F and ccm29 were used to amplify fvmyb10-2 ( Supplemental Data Set 11 ). Primer ccm29 is complementary to a region of the retrotransposon 45 to 70 bp downstream of the insertion point, which includes the first stop codon generated after the insertion. Each gene version was cloned into the Gateway transfer vector pDONR221 and then into the binary vector pK7WG2D under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter (Gateway BP and LR Clonase II Enzyme mix, Invitrogen). The resulting plasmids were introduced into Agrobacterium strain AGL0 following the protocol of Höfgen and Willmitzer (1988). Immature fruits in the late green/early white stage were used for agro-infiltration using 1 mL suspension of each culture in combination (1:1) with a suspension of Agrobacterium LBA4404 with the p19 suppressor of gene silencing ( Voinnet et al., 2003). Agro-infiltrated fruits were labeled and left to ripen in planta for ∼7 to 10 d.

HRM Marker Development and Marker Data Analysis

The primer set targeting the 8-bp mutation was designed using IDT's PrimerQuest Software and ordered from IDT (San Jose, California Supplemental Data Set 11 ). PCR amplification was performed in a 5 μL reaction containing 0.5 μM of each primer set, 2× AccuStart TM II PCR ToughMix (Quantabio, Beverly, Massachusetts ), 1× LC Green Plus HRM dye (BioFire, Salt Lake City, Utah), and 0.5 μL of DNA. The PCR conditions were as follows: an initial denaturation at 95°C for 5 min 45 cycles of denaturation at 95°C for 10 s, annealing at 62°C for 10 s, and extension at 72°C for 20 s. After PCR amplification, the samples were heated to 95°C for 1 min and cooled to 40°C for 1 min. Melting curves were obtained by melting over the desired range (60° to 95°C) at a rate of 50 acquisitions per 1°C. The HRM assay was performed with the LightCycler 480 System II (Roche Life Science, Germany). The HRM data were analyzed using Melt Curve Genotyping and Gene Scanning Software (Roche Life Science, Germany). Analysis of HRM variants was based on differences in the shapes of the melting curves and Tm values.

SNP Genotyping using KASP

An SNP in MYB10-2 at position −20 from the initial ATG associated with white/red flesh color in the sequenced accessions was targeted for the KASP assay. To produce a subgenome-specific assay, a combination of four primers was used in each reaction: two common forward primers (ccm90 and ccm91) to account for a background-specific G/A SNP, and two allele-specific primers (ccm92 and ccm93), each carrying the standard FAM or HEX dye tails and the targeted SNP at the 3′ end. A single common primer is generally used for standard KASP assays, but the high degree of polymorphism in the targeted region made it necessary to include an extra common forward primer to account for a different, background-associated G/A SNP not linked to the white-fleshed trait. Reaction volumes of 5 μL for 384-well plates were used 2.5 μL of MasterMix, 0.07 μL of assay/primer mix, and 2.5 μL of DNA (12.5 ng total) were used for genotyping. The final primer concentrations in the reaction mix were 210 nM for ccm90 and ccm91 150 nM for ccm92 and 190 nM for ccm93. PCR was conducted in a BioRad CFX-384 instrument using the following protocol: An initial denaturation step at 94°C for 15 min, 12 touchdown cycles (94°C for 20 s, 65°C for 80 s, dropping 0.6°C per cycle), 29 cycles (94°C for 20 s, 58°C for 80 s), and a final recycling for 2 cycles (94°C for 20 s, 60°C for 80 s). BioRad software was used to estimate the final results.

Accession Numbers

F. vesca FIN12 accession sequencing data are stored at National Center for Biotechnology Information Short Read Archive (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) under accession number PRJNA655237.

The raw reads data from (1) Illumina high-throughput sequencing of RF and WF DNA pools from F2 lines of the F. vesca RV660 × WV596 population and (2) RNA-seq from ripe fruits of white and red octoploid accessions were stored at the Sequence Read Archive (SRA) of the European Nucleotide Archive (ENA) under project reference number PRJEB38128. In the same project, Sanger sequences were stored under the following specific codes: (1) fvmyb10-3 mutant alleles sequences from SE100, GER1, and GER2: LR862245, LR862246, and LR862247 (2) MYB10 promoter sequences from F. chiloensis ssp. chiloensis FC157 MYB10-1 Pro/MYB10-3B Pro, MYB10-2 Pro, y MYB10-3A Pro (LR862237-LR862239), F. chiloensis ssp. lucida USA2 MYB10-3A Pro, MYB10-1 Pro/MYB10-3B Pro, y MYB10-2 Pro (LR862240-LR862242), Fragaria × ananassa cv Senga Sengana MYB10-3A Pro y MYB10-1 Pro/MYB10-3B Pro (LR862243- LR862244) and (3) The FvMYB10-gypsy LTR-TE sequence from fvmyb10-2: LR8622681.

Datos suplementarios

Supplemental Figure 1. . The LTR-TE insertion in FvMYB10 cosegregates with the white fruit phenotype in the entire RV660xWF596 population.

Supplemental Figure 2. . TEAC, soluble solid content (SSC), titratable acidity (TA), and L-ascorbic acid (L-AA) content in RF and WF F2 pools of the RV660 x WV596 population.

Supplemental Figure 3. . F. vesca accession FIN12 has a large deletion affecting an ∼100 kb region in Fvb1 that results in the loss of seven predicted genes including FvMYB10 (FvH4_1g22020).

Supplemental Figure 4. . Fruit skin color in UF population 17.66 (FL 13.65-160 × FL 14.29-1).

Supplemental Figure 5. . Fruit flesh and skin color phenotypes in the Hansabred SS×FcL population.

Supplemental Figure 6. . Senga Sengana x F. chiloensis ssp. lucida linkage map and comparison to the physical positions in the F. vesca reference genome.

Supplemental Figure 7. . Expression of cv Camarosa FaMYB10 homoeologs in different tissues and during fruit ripening.

Supplemental Figure 8. . Sequence alignment of WT and mutant MYB10-2 in UF breeding population 17.66.

Supplemental Figure 9. . Alignment of the MYB10 upstream region showing the SNP targeted for KASP genotyping.

Supplemental Figure 10. . Fruit color scale used to phenotype octoploid accessions.

Supplemental Data Set 1 .. List of significant SNPs and INDELs in the RV660 × WV596 population.

Supplemental Data Set 3 .. List of Fragaria ssp. included in this study and description of mutations detected in MYB10.

Supplemental Data Set 4 .. QTLs detected for fruit color traits in the cv Senga Sengana × Fragaria chiloensis ssp. lucida F2 population by Kruskal-Wallis (KW) and restricted multiple QTL mapping (rMQM) analysis.

Supplemental Data Set 5 .. Polymorphisms at MYB10 homoeologs from F. chiloensis accessions and cv Senga Sengana vs. the cv Camarosa reference genome.

Supplemental Data Set 6 .. Expression of anthocyanin pathway genes in cv Senga Sengana and white-fleshed F. chiloensis accessions.

Supplemental Data Set 7 .. Predicted putative cis-elements specific to cv Camarosa FaMYB10-2 Pro.

Supplemental Data Set 8 .. Predicted putative cis-elements specific to cv Camarosa FaMYB10-2 Pro potentially significant in the context of fruit ripening and anthocyanin production.

Supplemental Data Set 9 .. Putative cis-elements predicted in FvMYB10 Pro overlapping with those exclusively predicted in cv Camarosa FaMYB10-2 Pro.

Supplemental Data Set 10 .. Phenotypes and WS_CID_1 marker genotypes of UF breeding population 17.66 (FL 13.65-160 × FL 14.29-1).

Supplemental Data Set 12 .. Sequence alignment file in fasta format of MYB10 Pro variants.


Ver el vídeo: Introducción a las Angiospermas III: Fruto y semilla (Noviembre 2022).