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¿La cobertura de la secuenciación de ADN es una función de la pureza de la muestra?

¿La cobertura de la secuenciación de ADN es una función de la pureza de la muestra?


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¿Cómo se ve afectada la cobertura por la pureza de una muestra? ¿Y la cobertura de una muestra puede verse afectada por otras cosas, como la preparación de la biblioteca o la forma en que se almacenó la muestra?


Entonces, factores que entran en cobertura en la secuenciación de lectura corta (y secuenciación de Sanger).

  • La profundidad es la obvia. En igualdad de condiciones, se obtiene una distribución de cobertura de Poisson sobre un genoma, razón por la cual más secuenciación = más cobertura.

  • El genoma y el transcriptoma humanos no son todos iguales. La secuenciación de Illumina depende en última instancia (la mayoría de los protocolos) de la amplificación por PCR, lo que significa que cualquier factor que influya en la capacidad de amplificación por PCR también afectará a la profundidad de la secuenciación. Las dos obvias a este respecto son: 1) Regiones de contenido extremo de GC y 2) Regiones que contienen estructuras secundarias (principalmente ARN).

  • La alineación es la siguiente fuente importante de error para las regiones que se 'caen' dependiendo de cómo su alineador maneje las lecturas de múltiples mapas. Algunos genomas tienen elementos transponibles muy jóvenes, muy similares entre sí y muy abundantes. Para la mayoría de los alineadores, eso significa que puede obtener una cobertura enorme o una cobertura realmente pequeña, dependiendo de cómo se ensamble el genoma.

  • Para las técnicas de secuenciación de bajo consumo, se obtienen las principales fuentes de contaminación de ADN / ARN de las enzimas, los reactivos y la preparación de las muestras. Esto se puede minimizar en gran medida teniendo muestras "limpias" y utilizando grandes cantidades de ADN / ARN de entrada.

Dependiendo de las secuencias que esté estudiando, la profundidad de lectura puede ser el único factor que considere o si tiene regiones difíciles o preguntas específicas, puede lidiar con una amplia gama de problemas.

Entonces, en respuesta a su pregunta: sí, la calidad del ADN afectará directamente la cobertura. A veces, puede 'simplemente secuenciar más' para superar este problema, a veces necesita volver a la mesa de dibujo.


El mayor contribuyente a la cobertura de secuenciación (en un Hiseq, supongo) es la cantidad de lecturas que obtiene, que depende principalmente del porcentaje de celda de flujo que le dé. Obviamente, el resto que mencionó contribuye, y la pureza podría ser un gran problema si está buscando un subconjunto de celdas que estaba tratando de aislar de un grupo más grande, pero la forma más fácil de obtener más cobertura es acaparar más bienes raíces en la celda de flujo.


Ver el vídeo: SECUENCIACIÓN DE ADN (Febrero 2023).