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En la PCR de toma de contacto, ¿la temperatura de extensión debe coincidir con la temperatura de recocido en la fase 1?

En la PCR de toma de contacto, ¿la temperatura de extensión debe coincidir con la temperatura de recocido en la fase 1?


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Para TD PCR, se recomienda que la temperatura de recocido (T_a) sea 10 ° C más alta que el ciclo normal T_a durante los primeros 10 ciclos más o menos, bajando de 0.5 a 1.0 ° C / ciclo. ¿Debe la temperatura de extensión (T_ext) coincidir con este patrón para evitar el recocido incorrecto? Parece que si la T_a inicial fuera de 75 ° C, entonces T_ext se estableció en 72 ° C (o lo que sea óptimo para la polimerasa), se perdería el propósito de la T_a alta.

En cambio, ¿debería T_ext hacer coincidir T_a con un tiempo de extensión aumentado hasta que se alcance el T_ext óptimo?


No lo sé si entiendo corregir la pregunta. Pero te escribo un ejemplo. Por ejemplo para la amplificación del gen nirS, Utilicé un PCR de touchdown. La Tm de la imprimación es de 60 ° C. Creé un touchdown desde 65 ° C y cada ciclo disminuyó un grado (el ciclo total del touchdown es 5). El termoperfil es el siguiente: 94 ° C durante 3 min; 5 ciclos de 94 ° C durante 15 segundos, 65 ° C (toma de contacto -1 ° C) durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 segundos; 34 ciclos de 94 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 segundos; seguido durante 72 ° C durante 10 min. Es mejor que en total tu PCR no haga más de 40 ciclos. Espero que esto te ayude Jo


Ver el vídeo: Tratamientos térmicos del acero: recocido, normalizado, temple y revenido (Noviembre 2022).