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Cómo realizar la electroforesis en gel de agar en casa

Cómo realizar la electroforesis en gel de agar en casa


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He revisado varios sitios que explican cómo puede hacer fácilmente su propio kit de electroforesis en gel en casa. Pero siempre prueban varios colorantes alimentarios en estos kits caseros en lugar de muestras de ADN reales. La extracción de ADN de la materia vegetal también se puede hacer fácilmente en casa, entonces, ¿por qué no puede simplemente ejecutar esto en el kit casero?


Hay algunas razones por las que normalmente no se sugiere esto.

  • El ADN en sí no es visible (al menos no en las cantidades que usarías en tu gel). Necesita un compuesto (tinte) que se una al ADN para hacerlo visible, y debido a que se unen al ADN, la mayoría de estos compuestos son cancerígenos. Incluso si usa un tinte de este tipo, muchos de ellos solo aparecen bajo luz ultravioleta, una dificultad adicional. También puede comprar un tinte seguro que funcione y sea visible, pero que también haga que la tinción sea más laboriosa. El colorante para alimentos será visible todo el tiempo, ya al ejecutar el gel.

  • Los buenos geles CSI que ves en la televisión muestran (supuestamente) productos de PCR de repeticiones cortas en tándem, lo que te da buenas bandas a diferentes alturas en el gel. Estas bandas también tienen un tamaño conveniente para la electroforesis en gel. El análisis de restricción de plásmidos también es algo que vería con más frecuencia, y también aquí las piezas tienen entre 100 y 10,000 pb. El ADN extraído de las plantas consta de ADN genómico, cadenas enormes (millones de pares de bases) que realmente no se ejecutarán en un gel de agarosa. Obtener una selección de fragmentos de ADN de tamaño discreto realmente no es tan fácil en su cocina, por eso optan por colorantes alimentarios.


¿Por qué se usa agarosa en electroforesis en gel en lugar de agar?

Electroforesis en gel de agarosa separa los fragmentos de ADN según su tamaño. Una corriente eléctrica es usó mover las moléculas de ADN a través de un Gel de agarosa, que es una matriz de polisacárido que funciona como una especie de tamiz. La matriz ayuda a "atrapar" las moléculas a medida que son transportadas por la corriente eléctrica.

Además, ¿Agar y agarosa son lo mismo? Diferencia entre Agar y agarosa. La diferencia clave entre agar y agarosa es que el agar es una sustancia gelatinosa obtenida a partir de algas rojas mientras que agarosa es un polímero lineal purificado de agar o algas rojas. Agar y agarosa son dos tipos de productos polisacáridos que provienen de algas rojas o algas marinas.

Por lo tanto, ¿puedo usar agarosa en lugar de agar?

Un agarosa con grupos de baja carga es por lo tanto generalmente preferido para usar en agarosa electroforesis en gel de ácidos nucleicos. Como agar es una mezcla compleja que contiene Agaropectina, que tiene grupos sulfato y piruvato, supongo que interactúa más con biomoléculas que agarosa.

¿De qué está hecha la electroforesis en gel de agarosa?

Geles para la separación del ADN son a menudo hecha de un polisacárido llamado agarosa, que se presenta en forma de copos secos y en polvo. Cuando el agarosa se calienta en un tampón (agua con algunas sales) y se deja enfriar, formará un sólido, ligeramente blando gel.


Materiales necesarios:

Soluciones de agarosa.
Bromuro de etidio.
Tampón de electroforesis.

Ácidos nucleicos y oligonucleótidos:

(Las muestras de ADN de tamaño conocido se generan típicamente mediante digestión con enzimas de restricción de un ADN plasmídico o bacteriófago de secuencia conocida).
El equipo y los suministros necesarios para realizar la electroforesis en gel de agarosa son relativamente simples e incluyen:

  • Una cámara de electroforesis y fuente de alimentación.
  • Bandejas de fundición de gel, que están disponibles en una variedad de tamaños y están compuestos de plástico transparente a los rayos UV.
  • Peines de muestra, alrededor del cual se vierte agarosa fundida para formar pocillos de muestra en el gel.
  • Tampón de electroforesis, generalmente Tris-acetato-EDTA (TAE) o Tris-borato-EDTA (TBE).
  • Buffer de carga, que contiene algo denso (por ejemplo, glicerol) para permitir que la muestra "caiga" en los pocillos de muestra, y uno o dos tintes de seguimiento, que migran en el gel y permiten un control visual o hasta dónde ha avanzado la electroforesis.
  • Bromuro de etidio, un tinte fluorescente utilizado para teñir ácidos nucleicos.
  • Transiluminador (una caja de luz ultravioleta), que se utiliza para visualizar el ADN teñido con bromuro de etidio en geles.

NOTA: Utilice siempre gafas protectoras cuando observe el ADN en un transiluminador para evitar daños en los ojos por la luz ultravioleta.

Para ello tomamos 2ml de solución madre de TAE en un matraz Erlenmeyer y hacemos el volumen a 100ml añadiendo 98ml de agua destilada. La solución de trabajo 1x es Tris-acetato 40 mM / EDTA 1 mM

Es importante utilizar el mismo lote de tampón de electroforesis tanto en el tanque de electroforesis como en la preparación del gel.

Para esto, normalmente se añaden 2 gramos de agarosa a 100 ml de tampón de electroforesis.

Concentración de agarosa en gel (% [p / v])

Rango de separación de Moléculas de ADN lineal (kb)


La tecnología de ADN recombinante es posible gracias a varias herramientas útiles para manipular moléculas de ADN y transformar células, incluidos plásmidos, enzimas de restricción y ligasa de ADN. Este laboratorio le presenta los plásmidos y las enzimas de restricción, así como la técnica de laboratorio de electroforesis en gel. Los experimentos de laboratorio posteriores le presentarán las otras herramientas de la biotecnología.

Enzimas de restricción (también llamado endonucleasas de restricción) son proteínas elaboradas por muchas especies bacterianas para defenderse de las infecciones virales. Cada enzima de restricción se mueve a lo largo de una molécula de ADN hasta que encuentra un secuencia de reconocimiento en el ADN. La enzima corta el ADN de doble hebra, lo que da como resultado fragmentos de ADN. Se han descubierto más de 3000 enzimas de restricción que reconocen secuencias palindrómicas cortas (4-8 pb).

Figura 1. Secuencia de reconocimiento de la enzima Hind III

La Figura 1 muestra la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción Hind III. Observe que la secuencia de reconocimiento es una palíndromo, y lee lo mismo yendo hacia adelante y hacia atrás. La enzima Hind III produce una escalonado corta el ADN y produce fragmentos que tienen áreas monocatenarias llamadas & ldquosticky ends & rdquo. La Figura 2 muestra la secuencia de reconocimiento de otras dos enzimas de restricción Sca 1 y Pst 1. La enzima Pst 1 realiza un corte escalonado del ADN en su secuencia de reconocimiento. Pero la enzima de restricción Sca I produce una desafilado cortar en su secuencia de reconocimiento para generar fragmentos de ADN sin extremos pegajosos.

Figura 2: Sitios de reconocimiento de enzimas de restricción.

Las células bacterianas tienen todos sus genes (genoma) en un solo cromosoma circular. Pero las células bacterianas también pueden transportar piezas de ADN no esenciales llamadas plásmidos. Un plásmido es un pequeño ADN circular que puede replicarse a sí mismo y puede transportar algunos genes de una célula a otra. Los científicos pueden diseñar plásmidos recombinantes para transportar genes específicos a una célula huésped diana.

Figura 3: Mapa de plásmidos de pUC19.

El mapa genético de un plásmido & ldquopUC19 & rdquo se muestra en la Figura 3. El tamaño total del plásmido es 2686 pb. Hay un sitio de reconocimiento Pst I en la posición 439, un sitio de reconocimiento Hind III en la posición 447 y un sitio de reconocimiento Sca I en 2179. Si se usa una enzima de restricción para cortar el plásmido pUC19, ¿qué se produciría?

Determine qué fragmentos de ADN se producen cuando se utilizan dos enzimas de restricción para cortar el ADN del plásmido pUC19.

Cortar con enzimas de restricción

Sca I y Pst I

Sca I y Hind III

Pst I y Hind III

Tamaños de fragmentos de ADN resultantes


Contenido

El gel de agarosa es una matriz tridimensional formada por moléculas de agarosa helicoidales en haces superenrollados que se agregan en estructuras tridimensionales con canales y poros a través de los cuales pueden pasar las biomoléculas. [3] La estructura 3-D se mantiene unida con enlaces de hidrógeno y, por lo tanto, puede romperse calentando de nuevo a un estado líquido. La temperatura de fusión es diferente de la temperatura de gelificación, dependiendo de las fuentes, el gel de agarosa tiene una temperatura de gelificación de 35 a 42 ° C y una temperatura de fusión de 85 a 95 ° C. También se encuentran disponibles agarosas de bajo punto de fusión y de baja gelificación obtenidas mediante modificaciones químicas.

El gel de agarosa tiene un tamaño de poro grande y una buena fuerza de gel, lo que lo hace adecuado como medio anticonvección para la electroforesis de ADN y moléculas de proteínas grandes. El tamaño de poro de un gel al 1% se ha estimado entre 100 nm y 200-500 nm, [4] [5] y su fuerza de gel permite que los geles diluidos al 0,15% formen una placa para la electroforesis en gel. [6] Sin embargo, los geles de baja concentración (0,1-0,2%) son frágiles y, por lo tanto, difíciles de manipular. El gel de agarosa tiene un poder de resolución más bajo que el gel de poliacrilamida para el ADN, pero tiene un mayor rango de separación y, por lo tanto, se usa para fragmentos de ADN de tamaño generalmente de 50 a 20 000 pb. El límite de resolución para la electroforesis en gel de agarosa estándar es de alrededor de 750 kb, pero es posible una resolución de más de 6 Mb con la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). [7] También se puede utilizar para separar proteínas grandes y es la matriz preferida para la electroforesis en gel de partículas con radios efectivos superiores a 5-10 nm. Un gel de agarosa al 0,9% tiene poros lo suficientemente grandes para la entrada del bacteriófago T4. [6]

El polímero de agarosa contiene grupos cargados, en particular piruvato y sulfato. [8] Estos grupos cargados negativamente crean un flujo de agua en la dirección opuesta al movimiento del ADN en un proceso llamado electroendosmosis (EEO) y, por lo tanto, pueden retardar el movimiento del ADN y provocar la distorsión de las bandas. Los geles de mayor concentración tendrían un mayor flujo electroendosmótico. Por tanto, se prefiere generalmente la agarosa de EEO baja para su uso en la electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa, pero la agarosa de EEO alta se puede usar para otros fines. El menor contenido de sulfato de la agarosa de baja EEO, particularmente la agarosa de bajo punto de fusión (LMP), también es beneficioso en los casos en que el ADN extraído del gel se va a utilizar para una manipulación adicional, ya que la presencia de sulfatos contaminantes puede afectar algunos procedimientos posteriores, como como ligadura y PCR. Sin embargo, las agarosas con cero EEO no son deseables para algunas aplicaciones, ya que pueden prepararse agregando grupos cargados positivamente y tales grupos pueden afectar las reacciones enzimáticas posteriores. [9] La electroendosmosis es una razón por la que la agarosa se usa con preferencia al agar, ya que el componente de agaropectina en el agar contiene una cantidad significativa de grupos carboxilo y sulfato cargados negativamente. La eliminación de agaropectina en agarosa reduce sustancialmente la EEO, además de reducir la adsorción inespecífica de biomoléculas a la matriz del gel. Sin embargo, para algunas aplicaciones tales como la electroforesis de proteínas séricas, puede ser deseable una EEO alta y se puede añadir agaropectina en el gel utilizado. [10]

Factores que afectan la migración de ácido nucleico en gel Editar

Varios factores pueden afectar la migración de los ácidos nucleicos: la dimensión de los poros del gel (concentración del gel), el tamaño del ADN que se somete a electroforesis, el voltaje utilizado, la fuerza iónica del tampón y la concentración de colorante intercalante como el bromuro de etidio. si se usa durante la electroforesis. [11]

Las moléculas más pequeñas viajan más rápido que las moléculas más grandes en gel, y el ADN de doble hebra se mueve a una velocidad inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases. Sin embargo, esta relación se rompe con fragmentos de ADN muy grandes, y la separación de fragmentos de ADN muy grandes requiere el uso de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), que aplica corriente alterna desde dos direcciones diferentes y los fragmentos de ADN grandes se separan a medida que se reorientan con la corriente cambiante. [12]

Para la electroforesis en gel de agarosa estándar, las moléculas más grandes se resuelven mejor usando un gel de baja concentración, mientras que las moléculas más pequeñas se separan mejor en un gel de alta concentración. Sin embargo, el gel de altas concentraciones requiere tiempos de ejecución más largos (a veces días).

El movimiento del ADN puede verse afectado por la conformación de la molécula de ADN, por ejemplo, el ADN superenrollado generalmente se mueve más rápido que el ADN relajado porque está estrechamente enrollado y, por lo tanto, más compacto. En una preparación de ADN plasmídico normal, pueden estar presentes múltiples formas de ADN. [13] La electroforesis en gel de los plásmidos normalmente mostraría la forma superenrollada negativamente como la banda principal, mientras que el ADN mellado (forma circular abierta) y la forma circular cerrada relajada aparecen como bandas menores. Sin embargo, la velocidad a la que se mueven las diversas formas puede cambiar utilizando diferentes condiciones de electroforesis, [14] y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más fuertemente afectada que el ADN lineal por el tamaño de los poros del gel. [15]

El bromuro de etidio que se intercala en el ADN circular puede cambiar la carga, la longitud y la superhelicidad de la molécula de ADN, por lo que su presencia en el gel durante la electroforesis puede afectar su movimiento. Por ejemplo, la carga positiva de bromuro de etidio puede reducir el movimiento del ADN en un 15%. [12] La electroforesis en gel de agarosa se puede utilizar para resolver ADN circular con diferentes topologías de superenrollamiento. [dieciséis]

El daño del ADN debido al aumento de la reticulación también reducirá la migración del ADN electroforético de una manera dependiente de la dosis. [17] [18]

La tasa de migración del ADN es proporcional al voltaje aplicado, es decir, cuanto mayor es el voltaje, más rápido se mueve el ADN. Sin embargo, la resolución de grandes fragmentos de ADN es menor a alto voltaje. La movilidad del ADN también puede cambiar en un campo inestable; en un campo que se invierte periódicamente, la movilidad del ADN de un tamaño particular puede disminuir significativamente en una frecuencia de ciclo particular. [4] Este fenómeno puede resultar en una inversión de banda en la electroforesis en gel de inversión de campo (FIGE), por la cual los fragmentos de ADN más grandes se mueven más rápido que los más pequeños.

Anomalías de migración Editar

  • Geles "sonrientes": este efecto de borde se produce cuando el voltaje aplicado es demasiado alto para la concentración de gel utilizada. [19]
  • Sobrecarga de ADN: la sobrecarga de ADN ralentiza la migración de fragmentos de ADN.
  • Contaminación: la presencia de impurezas, como sales o proteínas, puede afectar el movimiento del ADN.

Mecanismo de migración y separación Editar

La carga negativa de su cadena principal de fosfato mueve el ADN hacia el ánodo cargado positivamente durante la electroforesis. Sin embargo, la migración de moléculas de ADN en solución, en ausencia de una matriz de gel, es independiente del peso molecular durante la electroforesis. [4] [20] Por lo tanto, la matriz de gel es responsable de la separación del ADN por tamaño durante la electroforesis, y existen varios modelos para explicar el mecanismo de separación de biomoléculas en la matriz de gel. Uno ampliamente aceptado es el modelo de Ogston que trata la matriz polimérica como un tamiz. Una proteína globular o un ADN en espiral aleatorio se mueve a través de los poros interconectados, y es más probable que el movimiento de moléculas más grandes se vea obstaculizado y ralentizado por las colisiones con la matriz del gel, por lo que las moléculas de diferentes tamaños pueden separarse en este proceso de tamizado. . [4]

Sin embargo, el modelo de Ogston se descompone para moléculas grandes, por lo que los poros son significativamente más pequeños que el tamaño de la molécula. Para moléculas de ADN de tamaño superior a 1 kb, se utiliza con mayor frecuencia un modelo de reptación (o sus variantes). Este modelo asume que el ADN puede arrastrarse en forma de "serpiente" (de ahí "reptación") a través de los poros como una molécula alargada. Un modelo de reptación sesgado se aplica a una mayor intensidad de campo eléctrico, por lo que el extremo delantero de la molécula se polariza fuertemente en la dirección de avance y tira del resto de la molécula. [21] La microscopía de fluorescencia en tiempo real de moléculas teñidas, sin embargo, mostró una dinámica más sutil durante la electroforesis, con el ADN mostrando una elasticidad considerable al estirarse alternativamente en la dirección del campo aplicado y luego contraerse en una bola, o engancharse en un Forma de U cuando queda atrapado en las fibras de polímero. [22] [23]

Los detalles de un experimento de electroforesis en gel de agarosa pueden variar según los métodos, pero la mayoría sigue un procedimiento general.


Para la proxima vez

  1. Tome el log10 de la longitud de cada marcador de peso molecular que pueda identificar en su fotografía de gel de agarosa. Grafica el registro10 de su longitud en el eje y frente a la distancia que migraron desde el pozo en el eje x, medida en mm con una regla y la imagen de su gel de agarosa. Un ejemplo de un gráfico de este tipo se encuentra en la introducción al experimento de hoy. Use la ecuación de la línea de su gráfico para determinar el tamaño de su columna vertebral M13KO7 (use la banda en el carril en el que cargó el ADN cortado). ¿Cómo se compara esta medida con el tamaño previsto?
  2. ¿Cuántas placas espera si se colocan en placa 10 µl de una dilución de fago 10 -8, si el título de fago es 10 12 unidades formadoras de placa / ml? ¿Cuántas placas esperaría si probara el stock de fagos en la cepa DH5?
  3. El oligonucleótido que está agregando a p3 utiliza técnicas tradicionales de ingeniería genética ("recombinante"). Estas son formas poderosas y precisas de mover genes individuales de un organismo a otro y de producir productos proteicos quiméricos útiles como en el que está trabajando ahora. La biología sintética es un enfoque más nuevo para programar células. Por favor, lea uno (¡o más!) De los siguientes artículos y luego escriba un párrafo que explore la legitimidad de la siguiente declaración: & quot; la biología sintética se trata de ingeniería, mientras que la ingeniería genética se trata de biología & quot.
    • Tucker, Jonathan B. y Raymond A. Zilinskas. "La promesa y los peligros de la biología sintética". La nueva Atlántida, primavera de 2006.
    • Stone, Marcia. "Vida rediseñada para adaptarse a la multitud de ingenieros". Microbe, otoño de 2006.
    • Marguet, P. y col. & quotBiología por diseño: reducción y síntesis de componentes celulares y comportamiento & quot; Revista del Interfaz de la Royal Society 4 no. 15 (22 de agosto de 2007): 607-623. (PDF)

Gran nube blanca en electroforesis en gel de agar - (16 / Abr / 2012)

Hola a todos. He tenido problemas con la electroforesis las últimas 2 semanas. Aparece una nube blanca en más de la mitad superior del gel, como se muestra en la imagen. Normalmente hago gel de agarosa al 2% con TAE 50x. Hago un stock de 1500 mL y uso 50 ml de esta solución para el gel, con 3ul de Etrb (10mg / mL). Yo cargo los pozos con 6ul (5uL de adn y 1 uL de tinte) Para la escalera utilizo 1 uL de tinte y 2 uL de escalera. No sé qué diablos está pasando. Disminuí la carga de Etrb a 3uL (antes de usar 5uL), compré un tinte nuevo pero el problema persiste, también intenté cambiar los tiempos de exposición en el transiluminador UV. Leí que esto podría deberse a una contaminación por ARN. Porque a veces también usan esta tabla para obtener ARN. Las sugerencias serán muy apreciadas. Muchísimas gracias.

Esto se llama sombra de etidio y es causado por la migración del bromuro de etidio en la dirección opuesta al ADN (es decir, hacia el electrodo -ve). Puede arreglarse agregando bromuro de etidio al tampón de funcionamiento o colocando posteriormente el gel.

Tenga en cuenta que EtBr generalmente se usa a 0.5 ug / ml, no a los 20 ug / ml que está usando.

Gracias por tu respuesta Bob, alguien en otro laboratorio me dijo lo mismo. No entiendo cómo la adición de Etbr al TAE marcaría la diferencia. Yo suelo hacer el TAE, luego el gel de agarosa, lo pongo 1,30 min en el microondas (tómalo cada 30 segundos y agítalo) y después de esto pongo el Etbr. Además, utilizo 3 ul de una solución de EtBr de 10 mg / ml, ¿cree que estoy usando una mala cantidad?

Bob estaba diciendo que agregue el EtBr al tampón en su aparato de gel, además del tampón utilizado para hacer el gel. Solo lo necesitas en el electrodo positivo. El EtBr en el tampón de funcionamiento reemplaza al EtBr que está migrando en el gel.

Gracias por el aviso Phage, estoy probando esto ahora, publicaré si obtengo resultados o no más tarde, gracias, ¿qué pasa con la PCR, los tiempos de ciclo inapropiados en la PCR podrían conducir a este tipo de imagen más adelante?

Esta es la imagen que obtuve hoy después de agregar EtBr en el búfer en ejecución y después de que mi supervisor me gritara por pensar que esto podría causar cáncer a todos en el laboratorio a pesar de que cubrí el vidrio con cinta adhesiva. Creo que haré otro PCR

está bien. Mucho mejor. Está sobrecargando demasiado ADN en el gel, pero eso es fácil de arreglar. Es probable que su PCR no funcione. Yo diría que las bandas que ves son probablemente dímeros de cebadores, o posiblemente solo cebadores. Cuéntenos más sobre su reacción de PCR: plantilla, cebadores, tamaño esperado, condiciones de ciclo, enzimas, todo. ¿Qué escalera estás usando?

¿Su supervisor cree que agregar EtBr en el tampón del tanque causará cáncer?

¿Exactamente a dónde cree que migra todo el EtBr de los geles? Podría intentar (con cuidado) señalar que los tanques ya están contaminados con EtBr y, por lo tanto, SIEMPRE deben manipularse con guantes adecuados de todos modos.

Sin mencionar que la histeria de EtBr / cáncer es una reacción exagerada. Todavía tengo que encontrar literatura sobre un solo caso de cáncer atribuido a EtBr (feliz de ser corregido, pero dudo que haya algo).


Cómo realizar la electroforesis en gel de agar en casa - Biología

Informe de laboratorio de electroforesis:

Cálculo del tamaño de los fragmentos de moléculas de ADN desconocidas

En este laboratorio, se utilizó una base de agarosa líquida para crear una base de gel para un procedimiento de electroforesis utilizando diferentes hebras de ADN. La electroforesis en gel se utiliza para separar macromoléculas en fragmentos según su tamaño. Las muestras de ADN se colocaron en los pocillos del gel de agarosa en el extremo negativo y luego se pasó una corriente a través de ellas, lo que provocó que el ADN viajara una cierta longitud hacia el lado positivo a través del gel, dependiendo de su tamaño. Los resultados se calcularon midiendo qué tan lejos pasaron las hebras a través del gel y luego se mapearon en un gráfico logarítmico.

El propósito de este laboratorio es explorar la electroforesis y la manipulación del ADN. En los primeros días de la ciencia, el ADN se separaba por gravedad, pero en la década de 1950, Oliver Smithies (Smithies) descubrió la electroforesis en gel de ADN. Este proceso clasifica los fragmentos de ADN en orden de tamaño mediante el uso de electricidad a través de una matriz de gel (Bowen). El ADN se fabrica en diferentes tamaños mediante enzimas restrictivas, enzimas que cortan el ADN en trozos más pequeños para poder analizarlos (Pearson). Una vez que se corta el ADN, se tiñe y luego se inserta en los pocillos. Cuando la electricidad fluye, el ADN se extrae del lado negativo al lado positivo porque el ADN tiene una carga negativa (Biblioteca de animación de biología). Las moléculas más pequeñas se mueven más fácilmente mientras que las moléculas más grandes se mueven más lentamente a través del gel. Esto conduce a que las moléculas más pequeñas (y por lo tanto las moléculas que han sido cortadas por enzimas de restricción) viajen más hacia el polo negativo (Biblioteca de animación de biología). Estamos haciendo este laboratorio para probar este proceso y ver si tiene éxito. Debido a que miles de científicos lo han hecho tantas veces, tenemos la hipótesis de que seremos capaces de separar fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de ADN.

Nuestro laboratorio de electroforesis se llevó a cabo el 28 y 29 de enero de 2016 y fue escrito por Pearson LabBench. Comenzamos usando agarosa líquida para hacer una base de gel para que nuestras moléculas de ADN migraran y colocamos un peine en el extremo negativo para crear pozos que luego servirían como sitio para la inyección de ADN en el gel. Una vez solidificado, cubrimos el gel en un líquido tamponado y dejamos que la bandeja de gel se refrigerara durante 24 horas. Después del período de refrigeración, retiramos el peine de la bandeja para exponer una serie de pocillos formados en los que luego podríamos inyectar moléculas de ADN segmentadas. Inyectamos las siguientes 5 variaciones de ADN segmentado: ADN Lambda, BamHI, EcoRI, Hindi III y el control (ADN no segmentado). Luego sumergimos la bandeja de gel con tampón y aplicamos una corriente constante de 75 V (imagen a la derecha) durante aproximadamente 15-20 minutos. Luego detuvimos la corriente, retiramos el gel y medimos y observamos cualquier migración de ADN que ocurriera. Se aplicó tinte a la bandeja de gel para ayudar a acentuar las partículas de ADN presentes.


Polvo de agarosa, tampón TAE o TBE, bromuro de etidio y colorante azul de bromofenol.

Rueda de gel, cámara de electroforesis, fuente de voltaje, bandeja de gel, peine, horno, transiluminador Uv.

Pipetas, puntas, matraz, balanza de peso.

La representación hipotética del equipo de electroforesis en gel de agarosa se muestra a continuación,

Representación gráfica del aparato de electroforesis.


Análisis de ARN en electroforesis en gel de agarosa no desnaturalizante

1. Se recomiendan las siguientes condiciones de electroforesis en gel:

- use tampón TAE 1X en lugar de TBE 1X - use gel de agarosa en la concentración de 1,1% -1,2% - agregue bromuro de etidio (EtBr) al gel y tampón de electroforesis para evitar el paso adicional (potencialmente propenso a la ARNasa) de tinción en gel - Utilice siempre gel y tampón nuevos, así como equipos de electroforesis limpios para el análisis de ARN. Use guantes para proteger las muestras de ARN de la degradación por nucleasas y evite el contacto de las manos con EtBr. - utilice un voltaje de funcionamiento de hasta 10 V / cm (10 V por cada cm de espacio entre los electrodos en la cámara electroforética). No utilice alto voltaje para evitar la degradación del ARN durante la electroforesis.

2. Caliente una alícuota de la solución de ARN a 70 ° C durante 1 minuto y colóquela en hielo antes de cargarla en un gel.

3. Cargue una cantidad conocida de ADN o escalera de ARN junto con su muestra de ARN como estándar para determinar la concentración de ARN. La concentración de ARN se puede estimar aproximadamente asumiendo que la eficiencia de la incorporación de EtBr en el ARNr es la misma que la del ADN (el ARN ribosómico puede considerarse una molécula de doble hebra debido a su extensa estructura secundaria).

4. El primer signo de degradación del ARN en el gel no desnaturalizante es una ligera mancha que comienza en las bandas del ARNr y se extiende hasta el área de los fragmentos más cortos. El ARN que muestra este grado de degradación sigue siendo bueno para otros procedimientos. Sin embargo, si la mancha descendente es tan pronunciada que las bandas de ARNr no tienen un borde inferior discernible, este ARN debe descartarse.

Las siguientes características indican una preparación exitosa de ARN:

- Para el ARN total de mamíferos, deben observarse dos bandas intensivas frente a un frotis ligero. Estas bandas representan ARNr 28S y 18S. La relación de intensidades de estas bandas debe ser de aproximadamente 1,5-2,5: 1. El poli (A) + ARN de mamífero intacto aparece como un frotis con un tamaño de 0,1 a 4-7 (o más) kb con bandas débiles de ARNr 28S y 18S.

- En el caso de ARN de fuentes que no sean de mamíferos (plantas, insectos, levaduras, anfibios), el frotis de ARNm normal en el gel de agarosa no desnaturalizante no puede exceder de 2-3 kb. Además, la inmensa mayoría de los invertebrados tiene ARNr 28s con una denominada "ruptura oculta" (Ishikawa, 1977). En algunos organismos, la interacción entre las partes del ARNr 28s es bastante débil, por lo que la preparación de ARN total exhibe una única banda de ARNr similar a 18s incluso en un gel no desnaturalizante. En otras especies, el ARNr 28s es más robusto, por lo que todavía es visible como una segunda banda.

Nota: Si su ARN experimental es más corto de lo esperado y / o está degradado según los datos de electroforesis, prepare ARN fresco después de verificar la calidad de los reactivos de purificación de ARN. Si los problemas persisten, es posible que deba buscar otra fuente de tejido / células. En algunos casos, el ARN parcialmente degradado solo está disponible (por ejemplo, muestras de tumores o tejidos tratados con dureza). Este ARN se puede utilizar para la preparación de ADNc, sin embargo, la muestra de ADNc contendrá un número reducido de moléculas de longitud completa.

ARN total de células endoteliales humanas.

- Por lo general, la contaminación del ADN genómico no excede la cantidad que se ve en el gel de agarosa / EtBr como una banda débil de alto peso molecular. Tal contaminación no afecta la síntesis de cDNA. No se recomienda el tratamiento con DNasa para degradar el ADN genómico. En algunos casos, el exceso de ADN genómico puede eliminarse mediante precipitación con LiCl o mediante extracción con fenol: cloroformo.


Ver el vídeo: Cómo hacer una Electroforesis? (Febrero 2023).